Imunomoduliaciniai metabolitai yra pagrindinis naviko mikroaplinkos (TME) bruožas, tačiau, išskyrus kelias išimtis, jų tapatybė išlieka daugiausia nežinoma. Šiame tyrime analizavome navikus ir T ląsteles iš pacientų, sergančių aukšto laipsnio serozine karcinoma (HGSC), navikų ir ascito, siekdami atskleisti šių skirtingų TME skyrių metabolomą. Ascitas ir naviko ląstelės turi didelių metabolitų skirtumų. Palyginti su ascitu, naviką infiltruojančiose T ląstelėse yra žymiai daugiau 1-metilnikotinamido (MNR). Nors MNR kiekis T ląstelėse yra padidėjęs, nikotinamido N-metiltransferazės (fermento, kuris katalizuoja metilo grupių perdavimą iš S-adenozilmetionino į nikotinamidą) raiška apsiriboja fibroblastais ir naviko ląstelėmis. Funkciniu požiūriu MNR indukuoja T ląsteles išskirti naviką skatinantį citokiną – naviko nekrozės faktorių alfa. Todėl iš TME gauta MNR prisideda prie T ląstelių imuninės reguliacijos ir yra potencialus imunoterapijos taikinys gydant žmonių vėžį.
Naviko kilmės metabolitai gali turėti didelį slopinamąjį poveikį priešnavikiniam imunitetui, ir vis daugiau įrodymų rodo, kad jie taip pat gali būti pagrindinė ligos progresavimo varomoji jėga (1). Be Varburgo efekto, neseniai pradėti tyrimai, skirti apibūdinti naviko ląstelių metabolinę būseną ir jos ryšį su naviko mikroaplinkos (TME) imunine būsena. Tyrimai su pelių modeliais ir žmogaus T ląstelėmis parodė, kad glutamino metabolizmas (2), oksidacinis metabolizmas (3) ir gliukozės metabolizmas (4) gali nepriklausomai veikti įvairius imuninių ląstelių pogrupius. Keletas šių takų metabolitų slopina T ląstelių priešnavikinę funkciją. Įrodyta, kad kofermento tetrahidrobiopterino (BH4) blokada gali pakenkti T ląstelių proliferacijai, o BH4 padidėjimas organizme gali sustiprinti CD4 ir CD8 tarpininkaujamą priešnavikinį imuninį atsaką. Be to, imunosupresinį kinurenino poveikį galima atkurti skiriant BH4 (5). Izocitrato dehidrogenazės (IDH) mutantinėje glioblastomoje enantiometabolinio (R)-2-hidroksiglutarato (R-2-HG) sekrecija slopina T ląstelių aktyvaciją, proliferaciją ir citolizės aktyvumą (6). Neseniai buvo įrodyta, kad metilglioksalas, glikolizės šalutinis produktas, yra gaminamas mieloidinės kilmės slopinamųjų ląstelių, o metilglioksalo pernešimas į T ląsteles gali slopinti efektorinių T ląstelių funkciją. Gydymo metu metilglioksalo neutralizavimas gali įveikti mieloidinės kilmės slopinamųjų ląstelių (MDSC) aktyvumą ir sinergiškai sustiprinti kontrolinių taškų blokados terapiją pelių modeliuose (7). Šie tyrimai kartu pabrėžia pagrindinį iš TME gautų metabolitų vaidmenį reguliuojant T ląstelių funkciją ir aktyvumą.
T ląstelių disfunkcija kiaušidžių vėžio atveju buvo plačiai aprašyta (8). Tai iš dalies lemia hipoksijai ir nenormaliai naviko kraujagyslių struktūrai būdingos metabolinės savybės (9), dėl kurių gliukozė ir triptofanas virsta šalutiniais produktais, tokiais kaip pieno rūgštis ir kinureninas. Per didelis tarpląstelinio laktato kiekis sumažina interferono-γ (IFN-γ) gamybą ir skatina mielosupresinių pogrupių diferenciaciją (10, 11). Triptofano vartojimas tiesiogiai slopina T ląstelių proliferaciją ir slopina T ląstelių receptorių signalizaciją (12–14). Nepaisant šių stebėjimų, daug imuninio metabolizmo tyrimų buvo atlikta in vitro T ląstelių kultūroje, naudojant optimizuotas terpes, arba apsiribojant homologiškais pelių modeliais in vivo, ir nė vienas iš jų iki galo neatspindi žmogaus vėžio heterogeniškumo ir fiziologinės makro bei mikro aplinkos.
Dažnas kiaušidžių vėžio požymis yra išplitimas į pilvaplėvę ir ascito atsiradimas. Ląstelių skysčio kaupimasis ascite yra susijęs su pažengusia liga ir prasta prognoze (15). Remiantis pranešimais, ši unikali sritis yra hipoksinė, joje yra didelis kraujagyslių endotelio augimo faktoriaus (VEGF) ir indoleamino 2,3-dioksigenazės (IDO) kiekis, be to, į ją infiltruojasi T reguliacinės ląstelės ir mieloidines slopinamosios ląstelės (15–18). Ascito metabolinė aplinka gali skirtis nuo paties naviko aplinkos, todėl T ląstelių perprogramavimas pilvaplėvės ertmėje nėra aiškus. Be to, pagrindiniai skirtumai ir heterogeniškumas tarp ascito ir metabolitų, esančių naviko aplinkoje, gali trukdyti imuninių ląstelių infiltracijai ir jų funkcijai navikuose, todėl reikalingi tolesni tyrimai.
Siekdami išspręsti šias problemas, sukūrėme jautrų ląstelių atskyrimo ir skysčių chromatografijos tandeminės masių spektrometrijos (LC-MS/MS) metodą, skirtą tirti skirtingus ląstelių tipus (įskaitant CD4+ ir CD8+ T ląsteles), taip pat navikų viduje ir tarp jų. Jo metabolitai apima ląsteles toje pačioje ascito ir naviko aplinkoje, kurioje yra pacientas. Šį metodą naudojame kartu su didelės dimensijos srauto citometrija ir vienaląsčių RNR sekvenavimu (scRNA-seq), kad pateiktume labai aiškų šių pagrindinių populiacijų metabolinės būklės vaizdą. Šis metodas atskleidė reikšmingą 1-metilnikotinamido (MNR) kiekio padidėjimą naviko T ląstelėse, o in vitro eksperimentai parodė, kad imunomoduliacinis MNR poveikis T ląstelių funkcijai anksčiau nebuvo žinomas. Apskritai šis metodas atskleidžia abipusę metabolinę sąveiką tarp navikų ir imuninių ląstelių ir suteikia unikalių įžvalgų apie imuninės sistemos reguliavimo metabolitus, kurios gali būti naudingos gydant T ląstelių pagrindu veikiančią kiaušidžių vėžio imunoterapiją. Gydymo galimybės.
Didelės dimensijos srauto citometrijos metodu vienu metu kiekybiškai įvertinome gliukozės pasisavinimą [2-(N-(7-nitrofenil-2-oksa-1,3-diaza-4-il)amino)-2-deoksigliukozė (2-NBDG) ir mitochondrijų aktyvumą [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) – tai tipiniai žymenys, skiriantys imunines ląsteles ir naviko ląstelių populiacijas (S2 lentelė ir S1A pav.). Ši analizė parodė, kad, palyginti su T ląstelėmis, ascito ir naviko ląstelės pasižymi didesniu gliukozės pasisavinimo lygiu, tačiau mitochondrijų aktyvumo skirtumai yra mažesni. Vidutinis naviko ląstelių gliukozės pasisavinimas [CD45-EpCAM (EpCAM)+] yra tris–keturis kartus didesnis nei T ląstelių, o vidutinis CD4+ T ląstelių gliukozės pasisavinimas yra 1,2 karto didesnis nei CD8+ T ląstelių, o tai rodo, kad į naviką infiltruojantys limfocitai (TIL) turi skirtingus metabolinius poreikius net ir toje pačioje TME (1A pav.). Priešingai, naviko ląstelių mitochondrijų aktyvumas yra panašus į CD4+ T ląstelių, o abiejų ląstelių tipų mitochondrijų aktyvumas yra didesnis nei CD8+ T ląstelių (1B pav.). Apskritai šie rezultatai atskleidžia metabolinį lygį. Naviko ląstelių metabolinis aktyvumas yra didesnis nei CD4+ T ląstelių, o CD4+ T ląstelių metabolinis aktyvumas yra didesnis nei CD8+ T ląstelių. Nepaisant šių poveikių skirtingiems ląstelių tipams, nėra nuoseklaus skirtumo tarp CD4+ ir CD8+ T ląstelių metabolinės būklės ar jų santykinių proporcijų ascite, palyginti su navikais (1C pav.). Priešingai, CD45 ląstelių frakcijoje EpCAM+ ląstelių dalis navike padidėjo, palyginti su ascitu (1D pav.). Taip pat pastebėjome aiškų metabolinį skirtumą tarp EpCAM+ ir EpCAM- ląstelių komponentų. EpCAM+ (naviko) ląstelės pasižymi didesniu gliukozės įsisavinimu ir mitochondrijų aktyvumu nei EpCAM- ląstelės, o tai yra daug didesnis nei fibroblastų metabolinis aktyvumas naviko ląstelėse TME atveju (1, E ir F pav.).
(A ir B) Gliukozės pasisavinimo mediana fluorescencijos intensyvumo (MFI) (2-NBDG) (A) ir CD4+ T ląstelių mitochondrijų aktyvumas (MitoTracker tamsiai raudona spalva) (B) Tipiniai grafikai (kairėje) ir lenteliniai duomenys (dešinėje), CD8+ T ląstelės ir EpCAM+CD45-naviko ląstelės iš ascito ir naviko. (C) CD4+ ir CD8+ ląstelių (CD3+ T ląstelių) santykis ascite ir navike. (D) EpCAM+ naviko ląstelių dalis ascite ir navike (CD45−). (E ir F) EpCAM+CD45-naviko ir EpCAM-CD45-matricos gliukozės pasisavinimas (2-NBDG) (E) ir mitochondrijų aktyvumas (MitoTracker tamsiai raudona spalva) (F) tipiniai grafikai (kairėje) ir lenteliniai duomenys (dešinėje) Ascitas ir naviko ląstelės. (G) Tipiniai CD25, CD137 ir PD1 raiškos grafikai, gauti srauto citometrijos metodu. (H ir I) CD25, CD137 ir PD1 raiška CD4+ T ląstelėse (H) ir CD8+ T ląstelėse (I). (J ir K) Naivios, centrinės atminties (Tcm), efektorinės (Teff) ir efektorinės atminties (Tem) fenotipai, pagrįsti CCR7 ir CD45RO raiška. Tipiniai CD4+ T ląstelių (J) ir CD8+ T ląstelių (K) vaizdai (kairėje) ir lenteliniai duomenys (dešinėje) ascite ir navikuose. P reikšmės nustatytos poriniu t testu (*P<0,05, **P<0,01 ir ***P<0,001). Linija žymi suporuotus pacientus (n = 6). FMO – fluorescencija minus vienas; MFI – medianinis fluorescencijos intensyvumas.
Tolesnė analizė atskleidė kitus reikšmingus skirtumus tarp labai išskirtos T ląstelių fenotipinės būsenos. Aktyvuotos (1 pav., G–I) ir efektorinės atminties (1 pav., J ir K) navikuose yra daug dažnesnės nei ascitas (CD3+ T ląstelių dalis). Panašiai, fenotipo analizė pagal aktyvacijos žymenų (CD25 ir CD137) ir išeikvojimo žymenų [programuoto ląstelių mirties baltymo 1 (PD1)] raišką parodė, kad nors šių populiacijų metabolinės charakteristikos skiriasi (S1 pav., B–E), tačiau reikšmingų metabolinių skirtumų tarp naiviųjų, efektorinių ar atminties pogrupių nebuvo nuosekliai pastebėta (S1 pav., F–I). Šie rezultatai buvo patvirtinti naudojant mašininio mokymosi metodus, skirtus automatiškai priskirti ląstelių fenotipus (21), o tai dar labiau atskleidė didelį kaulų čiulpų ląstelių (CD45+ / CD3- / CD4+ / CD45RO+) skaičių paciento ascite (S2A pav.). Iš visų nustatytų ląstelių tipų ši mieloidinių ląstelių populiacija pasižymėjo didžiausiu gliukozės įsisavinimu ir mitochondrijų aktyvumu (S2 pav., B–G). Šie rezultatai rodo stiprius metabolinius skirtumus tarp daugelio ląstelių tipų, randamų ascitu ir navikais HGSC pacientams.
Pagrindinis iššūkis suprantant TIL metabonomines charakteristikas yra poreikis išskirti pakankamo grynumo, kokybės ir kiekio T ląstelių mėginius iš navikų. Naujausi tyrimai parodė, kad rūšiavimo ir granulių sodrinimo metodai, pagrįsti srauto citometrija, gali lemti ląstelių metabolitų profilių pokyčius (22–24). Siekdami išspręsti šią problemą, optimizavome granulių sodrinimo metodą, kad galėtume išskirti ir išskirti TIL iš chirurginiu būdu pašalinto žmogaus kiaušidžių vėžio prieš analizę LC-MS/MS metodu (žr. Medžiagos ir metodai; 2A pav.). Siekdami įvertinti bendrą šio protokolo poveikį metabolitų pokyčiams, palyginome sveikų donorų po minėto granulių atskyrimo etapo aktyvuotų T ląstelių metabolitų profilius su ląstelėmis, kurios nebuvo atskirtos granulėmis, o liko ant ledo. Ši kokybės kontrolės analizė parodė, kad tarp šių dviejų sąlygų yra didelė koreliacija (r = 0,77), o 86 metabolitų grupės techninis pakartojamumas yra labai pakartojamas (2B pav.). Todėl šie metodai gali atlikti tikslią metabolitų analizę ląstelėse, kuriose vyksta ląstelių tipo sodrinimas, tokiu būdu suteikiant pirmąją didelės skiriamosios gebos platformą specifiniams metabolitams HGSC identifikuoti, taip suteikiant žmonėms galimybę geriau suprasti ląstelių specifiškumą (lytinės medžiagų apykaitos programa).
(A) Magnetinių karoliukų sodrinimo schema. Prieš analizę LC-MS/MS metodu, ląstelės bus praeinamos trimis iš eilės magnetinių karoliukų sodrinimo etapais arba paliekamos ant ledo. (B) Praturtinimo tipo įtaka metabolitų gausumui. Trijų matavimų vidurkis kiekvienam praturtinimo tipui ± SE. Pilka linija žymi 1:1 santykį. Pakartotinių matavimų klasės vidinė koreliacija (ICC) parodyta ašies žymėje. NAD, nikotinamido adenino dinukleotidas. (C) Pacientų metabolitų analizės darbo eigos schema. Iš pacientų surenkami ascitai arba navikai ir kriogeniškai užkonservuojami. Nedidelė kiekvieno mėginio dalis buvo analizuojama srauto citometrija, o likę mėginiai buvo praeinami trimis CD4+, CD8+ ir CD45- ląstelių sodrinimo etapais. Šios ląstelių frakcijos buvo analizuojamos naudojant LC-MS/MS. (D) Standartizuoto metabolitų gausumo šilumos žemėlapis. Dendrograma vaizduoja Wardo euklidinių atstumų tarp mėginių klasterizaciją. (E) Mėginio metabolitų žemėlapio pagrindinių komponentų analizė (PCA), kurioje rodomi trys kiekvieno mėginio pakartojimai, to paties paciento mėginiai sujungti linija. (F) Mėginio, apdoroto pacientu (t. y. naudojant dalinį perteklinį kiekį), metabolitų profilio PCA; mėginio tipą riboja išgaubtas korpusas. PC1 – 1 pagrindinis komponentas; PC2 – 2 pagrindinis komponentas.
Toliau, taikydami šį praturtinimo metodą, išanalizavome 99 metabolitus šešių HGSC pacientų pirminio ascito ir navikų CD4+, CD8+ ir CD45 ląstelių frakcijose (2C pav., S3A pav. ir S3 bei S4 lentelės). Dominanti populiacija sudaro nuo 2 % iki 70 % pradinio didelio gyvų ląstelių mėginio, o ląstelių dalis labai skiriasi tarp pacientų. Atskyrus granules, dominanti praturtinta frakcija (CD4+, CD8+ arba CD45-) sudaro vidutiniškai daugiau nei 85 % visų gyvų ląstelių mėginyje. Šis praturtinimo metodas leidžia mums analizuoti ląstelių populiacijas iš žmogaus naviko audinių metabolizmo, ko neįmanoma padaryti iš didelių mėginių. Naudodami šį protokolą, nustatėme, kad šių dviejų gerai apibūdintų imunosupresinių metabolitų, l-kinurenino ir adenozino, kiekis buvo padidėjęs naviko T ląstelėse arba naviko ląstelėse (S3, B ir C paveikslai). Todėl šie rezultatai rodo mūsų ląstelių atskyrimo ir masių spektrometrijos technologijos tikslumą ir gebėjimą rasti biologiškai svarbius metabolitus pacientų audiniuose.
Mūsų analizė taip pat atskleidė stiprų ląstelių tipų metabolinį atsiskyrimą pacientų viduje ir tarp jų (2D ir S4A pav.). Visų pirma, palyginti su kitais pacientais, pacientas 70 pasižymėjo skirtingomis metabolinėmis charakteristikomis (2E ir S4B pav.), o tai rodo, kad tarp pacientų gali būti didelis metabolinis heterogeniškumas. Verta paminėti, kad, palyginti su kitais pacientais (nuo 1,2 iki 2 litrų; S1 lentelė), bendras paciento 70 surinkto ascito kiekis (80 ml) buvo mažesnis. Kontroliuojant pacientų heterogeniškumą pagrindinių komponentų analizės metu (pavyzdžiui, naudojant dalinę perteklinę analizę), matyti nuoseklūs pokyčiai tarp ląstelių tipų, o ląstelių tipai ir (arba) mikroaplinka yra aiškiai agreguoti pagal metabolitų profilį (2F pav.). Atskirų metabolitų analizė pabrėžė šį poveikį ir atskleidė reikšmingus skirtumus tarp ląstelių tipų ir mikroaplinkos. Verta paminėti, kad didžiausias pastebėtas skirtumas yra MNA, kuri paprastai yra praturtinta CD45- ląstelėmis ir CD4+ bei CD8+ ląstelėmis, kurios infiltruoja naviką (3A pav.). CD4+ ląstelėms šis poveikis yra akivaizdžiausias, o CD8+ ląstelių MNA taip pat, atrodo, yra stipriai veikiama aplinkos. Tačiau tai nėra svarbu, nes tik trims iš šešių pacientų galima įvertinti naviko CD8+ balus. Be MNA, skirtingų tipų ląstelėse ascite ir navikuose, kiti metabolitai, kurie TIL atveju yra silpnai apibūdinami, taip pat yra skirtingai gausūs (S3 ir S4 paveikslai). Todėl šie duomenys rodo perspektyvų imunomoduliacinių metabolitų rinkinį tolesniems tyrimams.
(A) Normalizuotas MNA kiekis CD4+, CD8+ ir CD45- ląstelėse iš ascito ir naviko. Dėžutėje pavaizduota mediana (linija), tarpkvartilinis diapazonas (rėmelio vyris) ir duomenų diapazonas, iki 1,5 karto didesnis už tarpkvartilinį diapazoną (rėmelio ūsai). Kaip aprašyta paciento medžiagose ir metoduose, P vertei nustatyti naudokite paciento limmos vertę (*P < 0,05 ir **P < 0,01). (B) MNA metabolizmo schema (60). Metabolitai: S-adenozil-1-metioninas; SAH, S-adenozin-1-homocisteinas; NA, nikotinamidas; MNA, 1-metilnikotinamidas; 2-PY, 1-metil-2-piridon-5-karboksamidas; 4-PY, 1-metil-4-piridon-5-karboksamidas; NR, nikotinamido ribozė; NMN, nikotinamido mononukleotidas. Fermentai (žalia spalva): NNMT, nikotinamido N-metiltransferazė; SIRT, sirtuinai; NAMPT, nikotinamido fosforiboziltransferazė; AOX1, aldehido oksidazė 1; NRK, nikotinamido ribozido kinazė; NMNAT, nikotinamido mononukleotido adenilato transferazė; Pnp1, purino nukleozido fosforilazė. (C) Ascito (pilka) ir naviko (raudona; n = 3 pacientai) scRNR sekos t-SNE. (D) NNMT raiška skirtingose ​​ląstelių populiacijose, identifikuotose naudojant scRNR seką. (E) NNMT ir AOX1 raiška SK-OV-3, žmogaus embriono inkstų (HEK) 293T, T ląstelėse ir MNA paveiktose T ląstelėse. Parodyta sulankstyta raiška, palyginti su SK-OV-3. Parodytas raiškos modelis su SEM (n = 6 sveiki donorai). Ct vertės, didesnės nei 35, laikomos neaptinkamomis (UD). (F) SLC22A1 ir SLC22A2 raiška SK-OV-3, HEK293T, T ląstelėse ir T ląstelėse, paveiktose 8 mM MNA. Parodyta sulankstyta raiška, palyginti su SK-OV-3. Parodytas raiškos modelis su SEM (n = 6 sveiki donorai). Ct vertės, didesnės nei 35, laikomos neaptinkamomis (UD). (G) Ląstelių MNA kiekis aktyvuotose sveikose donorų T ląstelėse po 72 valandų inkubacijos su MNA. Parodytas raiškos modelis su SEM (n = 4 sveiki donorai).
MNA gaunama perkeliant metilo grupę iš S-adenozil-1-metionino (SAM) į nikotinamido (NA) nikotinamido N-metiltransferazės (NNMT; 3B pav.) pagalba. NNMT yra pernelyg ekspresuojama sergant įvairiais žmogaus vėžio tipais ir yra susijusi su proliferacija, invazija ir metastazėmis (25–27). Siekdami geriau suprasti MNA šaltinį T ląstelėse sergant TME, panaudojome scRNR sekvenavimą, kad apibūdintume NNMT ekspresiją skirtingų tipų ląstelėse trijų HGSC pacientų ascite ir navikuose (S5 lentelė). Maždaug 6500 ląstelių analizė parodė, kad ascite ir naviko aplinkoje NNMT ekspresija apsiribojo numatomomis fibroblastų ir naviko ląstelių populiacijomis (3, C ir D pav.). Verta paminėti, kad nėra akivaizdžios NNMT ekspresijos jokioje populiacijoje, kuri ekspresuoja PTPRC (CD45+) (3D ir S5A pav.), o tai rodo, kad metabolitų spektre aptikta MNA buvo įvesta į T ląsteles. Aldehido oksidazės 1 (AOX1) raiška MNA paverčia 1-metil-2-piridon-5-karboksamidu (2-PYR) arba 1-metil-4-piridon-5-karboksamidu (4-PYR); 3B pav.) taip pat apsiriboja fibroblastų, ekspresuojančių COL1A1, populiacija (S5A pav.), o tai kartu rodo, kad T ląstelės neturi įprastinio MNA metabolizmo gebėjimo. Šių su MNA susijusių genų raiškos modelis buvo patikrintas naudojant antrą nepriklausomą ląstelių duomenų rinkinį iš HGSC pacientų ascito (S5B pav.; n = 6) (16). Be to, kiekybinė polimerazės grandininės reakcijos (kPGR) analizė, atlikta su sveikomis donorų T ląstelėmis, gydytomis MNA, parodė, kad, palyginti su kontrolinėmis SK-OV-3 kiaušidžių naviko ląstelėmis, NNMT arba AOX1 beveik nebuvo ekspresuojami (3E pav.). Šie netikėti rezultatai rodo, kad TME atveju MNA gali būti išskiriama iš fibroblastų arba navikų į gretimas T ląsteles.
Nors kandidatai apima organinių katijonų transporterių 1–3 šeimą (OCT1, OCT2 ir OCT3), kuriuos koduoja tirpaus nešiklio 22 (SLC22) šeima (SLC22A1, SLC22A2 ir SLC22A3), potencialūs MNA transporteriai vis dar nėra apibrėžti (28). Sveikų donorų T ląstelių mRNR QPCR parodė žemą SLC22A1 ekspresijos lygį, tačiau neaptinkamą SLC22A2 lygį, o tai patvirtina, kad tai anksčiau buvo aprašyta literatūroje (3F pav.) (29). Priešingai, SK-OV-3 kiaušidžių naviko ląstelių linija ekspresavo aukštą abiejų transporterių lygį (3F pav.).
Siekiant ištirti, ar T ląstelės gali absorbuoti svetimą MNR, sveikos donorinės T ląstelės buvo kultivuojamos 72 valandas, esant skirtingoms MNR koncentracijoms. Nesant egzogeninės MNR, ląstelėse esančio MNR kiekio aptikti nepavyko (3G pav.). Tačiau aktyvuotose T ląstelėse, paveiktose egzogenine MNR, MNR kiekis ląstelėse padidėjo nuo dozės iki 6 mM MNR (3G pav.). Šis rezultatas rodo, kad nepaisant žemo transporterio ekspresijos lygio ir pagrindinio fermento, atsakingo už ląstelės viduje vykstantį MNR metabolizmą, trūkumo, TIL vis tiek gali pasisavinti MNR.
Metabolitų spektras pacientų T ląstelėse ir in vitro MNA absorbcijos eksperimentai padidina tikimybę, kad su vėžiu susiję fibroblastai (CAF) išskiria MNA, o naviko ląstelės gali reguliuoti TIL fenotipą ir funkciją. Siekiant nustatyti MNA poveikį T ląstelėms, sveikos donoro T ląstelės buvo aktyvuotos in vitro, esant arba nesant MNA, ir įvertinta jų proliferacija bei citokinų gamyba. Po 7 dienų didžiausios MNA dozės pridėjimo populiacijos dvigubėjimo skaičius buvo šiek tiek sumažėjęs, o gyvybingumas išliko vartojant visas dozes (4A pav.). Be to, gydymas egzogenine MNA padidino CD4+ ir CD8+ T ląstelių, ekspresuojančių naviko nekrozės faktorių α (TNFα; 4B pav.), dalį. Priešingai, tarpląstelinė IFN-γ gamyba reikšmingai sumažėjo CD4+ T ląstelėse, bet ne CD8+ T ląstelėse, ir reikšmingų interleukino 2 (IL-2; 4, C ir D pav.) pokyčių nebuvo. Todėl atlikus šių MNA paveiktų T ląstelių kultūrų supernatantų imunofermentinį tyrimą (ELISA), nustatytas reikšmingas TNFα padidėjimas, IFN-γ sumažėjimas ir IL-2 pokyčių nepakitimas (4 pav., E–G). IFN-γ sumažėjimas rodo, kad MNA gali atlikti tam tikrą vaidmenį slopinant T ląstelių priešnavikinį aktyvumą. Siekiant imituoti MNA poveikį T ląstelių sukeltam citotoksiškumui, sveikų donorų periferinio kraujo mononuklearinės ląstelės (PBMC) gamina chimerinius antigeno receptorių T (FRα-CAR-T) ląsteles, nukreiptas prieš folatų receptorių α, ir CAR-T (GFP), reguliuojamas žaliai fluorescencinio baltymo (GFP) -CAR-T) ląsteles. CAR-T ląstelės buvo kultivuojamos 24 valandas, esant MNA, o po to kultivuojamos kartu su žmogaus SK-OV-3 kiaušidžių naviko ląstelėmis, ekspresuojančiomis folatų receptorių α, kai efektoriaus ir taikinio santykis yra 10:1. MNA gydymas reikšmingai sumažino FRα-CAR-T ląstelių naikinimo aktyvumą, kuris buvo panašus į adenozinu gydytų FRα-CAR-T ląstelių aktyvumą (4H pav.).
(A) Bendras gyvybingų ląstelių skaičius ir populiacijos padvigubėjimas (PD) tiesiai iš kultūros 7 dieną. Juostinė diagrama rodo šešių sveikų donorų vidurkį + SEM. Pateikia duomenis iš mažiausiai n = 3 nepriklausomų eksperimentų. (B–D) CD3/CD28 ir IL-2 buvo naudojami T ląstelėms aktyvuoti atitinkamose MNA koncentracijose 7 dienas. Prieš analizę ląstelės 4 valandas buvo stimuliuojamos PMA/jonomicinu su GolgiStop. TNFα (B) raiška T ląstelėse. TNFα raiškos gyvose ląstelėse pavyzdinis vaizdas (kairėje) ir lentelės duomenys (dešinėje). IFN-γ (C) ir IL-2 (D) raiška T ląstelėse. Citokinų raiška buvo matuojama srauto citometrija. Juostinė diagrama rodo vidurkį (n = 6 sveiki donorai) + SEM. P vertei nustatyti naudojama vienfaktorinė dispersinė analizė ir pakartotiniai matavimai (*P<0,05 ir **P<0,01). Pateikia duomenis iš mažiausiai n = 3 nepriklausomų eksperimentų. (E–G) CD3/CD28 ir IL-2 buvo naudojami T ląstelėms aktyvuoti atitinkamomis MNA koncentracijomis 7 dienas. Terpė buvo surinkta prieš ir po 4 valandų PMA/jonomicino stimuliacijos. TNFα (E), IFN-γ (F) ir IL-2 (G) koncentracijos buvo išmatuotos ELISA metodu. Juostinė diagrama rodo vidurkį (n = 5 sveiki donorai) + SEM. P reikšmė nustatyta naudojant vienfaktorinę dispersinę analizę ir pakartotinius matavimus (*P<0,05). Punktyrinė linija rodo aptikimo ribą. (H) Ląstelių lizės tyrimas. FRα-CAR-T arba GFP-CAR-T ląstelės buvo pakoreguotos adenozinu (250 μM) arba MNA (10 mM) 24 valandas arba paliktos neapdorotos (kontrolė). Buvo išmatuotas SK-OV-3 ląstelių žūties procentas. P reikšmė nustatyta Welch t testu (*P<0,5 ir **P<0,01).
Siekiant suprasti nuo MNA priklausomą TNFα ekspresijos reguliavimą, buvo įvertinti MNA paveiktų T ląstelių TNFα mRNR pokyčiai (5A pav.). Sveikų donorų T ląstelėse, paveiktose MNA, TNFα transkripcijos lygis padidėjo dvigubai, o tai rodo, kad MNA priklauso nuo TNFα transkripcijos reguliavimo. Siekiant ištirti šį galimą reguliavimo mechanizmą, buvo įvertinti du žinomi transkripcijos faktoriai, reguliuojantys TNFα, būtent aktyvuotas T ląstelių branduolio faktorius (NFAT) ir specifinis baltymas 1 (Sp1), reaguojant į MNA prisijungimą prie proksimalinio TNFα promotoriaus (30). TNFα promotoriuje yra 6 nustatytos NFAT prisijungimo vietos ir 2 Sp1 prisijungimo vietos, kurios vienoje vietoje persidengia [-55 bazių poros (bp) nuo 5' dangtelio] (30). Chromatino imunoprecipitacija (ChIP) parodė, kad, paveikus MNA, Sp1 prisijungimas prie TNFα promotoriaus padidėjo tris kartus. NFAT įtraukimas taip pat padidėjo ir priartėjo prie svarbos (5B pav.). Šie duomenys rodo, kad MNA reguliuoja TNFα ekspresiją per Sp1 transkripciją ir mažesniu mastu NFAT ekspresiją.
(A) Palyginti su T ląstelėmis, kultivuojamomis be MNA, TNFα ekspresijos pokytis T ląstelėse, paveiktose MNA, kartų. Parodytas ekspresijos modelis su SEM (n = 5 sveiki donorai). Pateikiami duomenys iš mažiausiai n = 3 nepriklausomų eksperimentų. (B) T ląstelių, apdorotų 8 mM MNA arba be jos po NFAT ir Sp1, TNFα promotorius buvo sujungtas su (Ctrl) ir PMA/jonomicino stimuliacija 4 valandas. Imunoglobulinas G (IgG) ir H3 buvo naudojami atitinkamai kaip neigiama ir teigiama imunoprecipitacijos kontrolė. ChIP kiekybinis įvertinimas parodė, kad Sp1 ir NFAT prisijungimas prie TNFα promotoriaus MNA apdorotose ląstelėse padidėjo kelis kartus, palyginti su kontroline grupe. Pateikiami duomenys iš mažiausiai n = 3 nepriklausomų eksperimentų. P reikšmė nustatyta atliekant kelis t testus (*** P <0,01). (C) Palyginti su HGSC ascitu, T ląstelės (necitotoksinės) parodė padidėjusią TNF ekspresiją navike. Spalvos žymi skirtingus pacientus. Rodomos ląstelės buvo atsitiktinai atrinktos iki 300 ir sumaišytos su virpesiais, siekiant apriboti perteklių (** Padj = 0,0076). (D) Siūlomas MNA modelis kiaušidžių vėžiui diagnozuoti. MNA gaminama naviko ląstelėse ir fibroblastuose TME ir yra pasisavinama T ląstelių. MNA padidina Sp1 prisijungimą prie TNFα promotoriaus, todėl padidėja TNFα transkripcija ir TNFα citokinų gamyba. MNA taip pat sumažina IFN-γ kiekį. T ląstelių funkcijos slopinimas sumažina jų žudymo gebėjimą ir pagreitina naviko augimą.
Remiantis pranešimais, TNFα pasižymi priekiniu ir galiniu priešnavikiniu ir priešnavikiniu poveikiu, tačiau gerai žinomas jo vaidmuo skatinant kiaušidžių vėžio augimą ir metastazes (31–33). Remiantis pranešimais, TNFα koncentracija ascite ir naviko audiniuose pacientams, sergantiems kiaušidžių vėžiu, yra didesnė nei gerybiniuose audiniuose (34–36). Kalbant apie veikimo mechanizmą, TNFα gali reguliuoti baltųjų kraujo kūnelių aktyvaciją, funkciją ir proliferaciją bei keisti vėžio ląstelių fenotipą (37, 38). Remiantis šiais duomenimis, diferencinės genų raiškos analizė parodė, kad TNF reikšmingai padidėjo naviko audinių T ląstelėse, palyginti su ascitu (5C pav.). TNF raiškos padidėjimas buvo pastebimas tik T ląstelių populiacijose, kurių fenotipas nebuvo citotoksinis (S5A pav.). Apibendrinant, šie duomenys patvirtina požiūrį, kad MNA turi dvejopą imunosupresinį ir naviką skatinantį poveikį HGSC atveju.
Fluorescencinis žymėjimas, pagrįstas srauto citometrija, tapo pagrindiniu TIL metabolizmo tyrimo metodu. Šie tyrimai parodė, kad, palyginti su periferinio kraujo limfocitais arba T ląstelėmis iš antrinių limfoidinių organų, pelių ir žmonių TIL turi didesnį polinkį pasisavinti gliukozę (4, 39) ir laipsnišką mitochondrijų funkcijos praradimą (19, 40). Nors šiame tyrime pastebėjome panašius rezultatus, pagrindinis žingsnis yra palyginti naviko ląstelių ir TIL metabolizmą iš to paties rezekuoto naviko audinio. Remiantis kai kuriomis iš šių ankstesnių pranešimų, naviko (CD45-EpCAM+) ląstelės iš ascito ir navikų pasižymi didesniu gliukozės pasisavinimu nei CD8+ ir CD4+ T ląstelės, o tai patvirtina, kad didelį naviko ląstelių gliukozės pasisavinimą galima palyginti su T ląstelėmis. T ląstelių konkurencijos koncepcija. TME. Tačiau naviko ląstelių mitochondrijų aktyvumas yra didesnis nei CD8+ T ląstelių, o mitochondrijų aktyvumas yra panašus į CD4+ T ląstelių. Šie rezultatai sustiprina teiginį, kad oksidacinis metabolizmas yra svarbus naviko ląstelėms (41, 42). Jie taip pat rodo, kad CD8+ T ląstelės gali būti jautresnės oksidacinei disfunkcijai nei CD4+ T ląstelės arba kad CD4+ T ląstelės mitochondrijų aktyvumui palaikyti gali naudoti kitus anglies šaltinius nei gliukozė (43, 44). Reikėtų pažymėti, kad ascite nepastebėjome jokio gliukozės įsisavinimo ar mitochondrijų aktyvumo skirtumo tarp CD4+ T efektorių, T efektorinės atminties ir T centrinės atminties ląstelių. Panašiai ir CD8+ T ląstelių diferenciacijos būsena navikuose neturi nieko bendra su gliukozės įsisavinimo pokyčiais, o tai pabrėžia reikšmingą skirtumą tarp in vitro kultivuojamų T ląstelių ir in vivo kultivuojamų žmogaus TIL (22). Šiuos stebėjimus taip pat patvirtino nešališkas automatinis ląstelių populiacijos paskirstymas, kuris dar labiau atskleidė, kad CD45+ / CD3- / CD4+ / CD45RO+ ląstelės, pasižyminčios didesniu gliukozės įsisavinimu ir mitochondrijų aktyvumu nei naviko ląstelės, yra paplitusios, tačiau turi metaboliškai aktyvią ląstelių populiaciją. Ši populiacija gali atspindėti numatomą mieloidinių slopinamųjų ląstelių arba plazmocitoidinių dendritinių ląstelių subpopuliaciją, nustatytą atliekant scRNR sekos analizę. Nors abu šie reiškiniai buvo aptikti žmogaus kiaušidžių navikuose [45], vis dar reikia toliau dirbti, kad būtų aprašyta ši mieloidinė subpopuliacija.
Nors srauto citometrijos metodai gali paaiškinti bendrus gliukozės ir oksidacinio metabolizmo skirtumus tarp ląstelių tipų, tikslūs metabolitai, kuriuos gamina gliukozė ar kiti anglies šaltiniai mitochondrijų metabolizmui TME, dar nėra nustatyti. Norint priskirti metabolitų buvimą ar nebuvimą tam tikram TIL pogrupiui, reikia išvalyti ląstelių populiaciją iš iškirpto audinio. Todėl mūsų ląstelių praturtinimo metodas kartu su masių spektrometrija gali suteikti įžvalgų apie metabolitus, kurie yra skirtingai praturtinti T ląstelėse ir naviko ląstelių populiacijose atitinkamuose pacientų mėginiuose. Nors šis metodas turi pranašumų, palyginti su fluorescenciniu ląstelių rūšiavimu, tam tikros metabolitų bibliotekos gali būti paveiktos dėl būdingo stabilumo ir (arba) greito apyvartos greičio (22). Nepaisant to, mūsų metodas leido nustatyti du atpažįstamus imunosupresinius metabolitus – adenoziną ir kinureniną, nes jie labai skiriasi tarp mėginių tipų.
Mūsų atlikta navikų ir TIL potipių metabonominė analizė suteikia daugiau įžvalgų apie metabolitų vaidmenį kiaušidžių TME. Pirma, naudodami srauto citometriją, nustatėme, kad mitochondrijų aktyvumas tarp navikų ir CD4 + T ląstelių nesiskiria. Tačiau LC-MS/MS analizė atskleidė reikšmingus metabolitų gausumo pokyčius šiose populiacijose, o tai rodo, kad išvadas apie TIL metabolizmą ir bendrą metabolinį aktyvumą reikia atidžiai interpretuoti. Antra, MNA yra metabolitas, kurio skirtumas tarp CD45 ląstelių ir T ląstelių yra ascite, o ne navikuose. Todėl susiskaldymas į kompartmentus ir naviko vieta gali turėti skirtingą poveikį TIL metabolizmui, o tai pabrėžia galimą heterogeniškumą tam tikroje mikroaplinkoje. Trečia, MNA gaminančio fermento NNMT ekspresija daugiausia apsiriboja CAF, kuris yra naviko ląstelėse mažesniu mastu, tačiau aptinkami MNA kiekiai stebimi naviko kilmės T ląstelėse. NNMT per didelė raiška kiaušidžių CAF turi žinomą vėžį skatinantį poveikį, iš dalies dėl CAF metabolizmo skatinimo, naviko invazijos ir metastazių (27). Nors bendras TIL lygis yra vidutinis, NNMT raiška CAF yra glaudžiai susijusi su vėžio genomo atlaso (TCGA) mezenchiminiu potipiu, kuris yra susijęs su prasta prognoze (27, 46, 47). Galiausiai, fermento AOX1, atsakingo už MNA skaidymą, raiška taip pat apsiriboja CAF populiacija, o tai rodo, kad T ląstelės nesugeba metabolizuoti MNA. Šie rezultatai patvirtina mintį, kad nors šiam atradimui patvirtinti reikia tolesnių tyrimų, didelis MNA kiekis T ląstelėse gali rodyti imunosupresinės CAF mikroaplinkos buvimą.
Atsižvelgiant į žemą MNA transporterių raiškos lygį ir neaptinkamus pagrindinių MNA metabolizme dalyvaujančių baltymų kiekius, MNA buvimas T ląstelėse yra netikėtas. Nei NNMT, nei AOX1 nepavyko aptikti atliekant scRNR sekoskaitos analizę ir tikslinę kiekybinę kiekybinę analizę dviejose nepriklausomose kohortose. Šie rezultatai rodo, kad MNA nėra sintetinama T ląstelių, o absorbuojama iš aplinkinių TME. In vitro eksperimentai rodo, kad T ląstelės linkusios kaupti egzogeninę MNA.
Mūsų in vitro tyrimai parodė, kad egzogeninė MNA indukuoja TNFα ekspresiją T ląstelėse ir sustiprina Sp1 prisijungimą prie TNFα promotoriaus. Nors TNFα atlieka ir priešnavikines, ir priešnavikines funkcijas, kiaušidžių vėžio atveju TNFα gali skatinti kiaušidžių vėžio augimą (31–33). TNFα neutralizavimas kiaušidžių naviko ląstelių kultūroje arba TNFα signalo eliminavimas pelių modeliuose gali pagerinti TNFα sukeltą uždegiminių citokinų gamybą ir slopinti naviko augimą (32, 35). Todėl šiuo atveju iš TME gauta MNA gali veikti kaip uždegimą skatinantis metabolitas per nuo TNFα priklausomą mechanizmą per autokrinę kilpą, taip skatindama kiaušidžių vėžio atsiradimą ir plitimą (31). Remiantis šia galimybe, TNFα blokada tiriama kaip potencialus terapinis agentas kiaušidžių vėžiui gydyti (37, 48, 49). Be to, MNA silpnina CAR-T ląstelių citotoksiškumą kiaušidžių naviko ląstelėms, pateikdama papildomų įrodymų apie MNA sukeltą imunosupresiją. Apibendrinus šiuos rezultatus, galima teigti, kad yra modelis, kuriame navikai ir CAF ląstelės išskiria MNA į tarpląstelinę TME. Dėl (i) TNF sukeltos kiaušidžių vėžio augimo stimuliacijos ir (ii) MNA sukeltos T ląstelių citotoksinio aktyvumo slopinimo tai gali turėti dvejopą poveikį navikui (5D pav.).
Apibendrinant, taikant greito ląstelių praturtinimo, pavienių ląstelių sekoskaitos ir metabolinio profiliavimo derinį, šis tyrimas atskleidė didžiulius imunometabolominius skirtumus tarp navikų ir ascito ląstelių HGSC pacientams. Ši išsami analizė parodė, kad T ląstelėse yra gliukozės įsisavinimo ir mitochondrijų aktyvumo skirtumų, ir nustatė, kad MNA yra ne ląstelių autonominis imuninę sistemą reguliuojantis metabolitas. Šie duomenys turi įtakos tam, kaip TME veikia T ląstelių metabolizmą žmogaus vėžio atveju. Nors buvo pranešta apie tiesioginę T ląstelių ir vėžio ląstelių konkurenciją dėl maistinių medžiagų, metabolitai taip pat gali veikti kaip netiesioginiai reguliatoriai, skatinantys naviko progresavimą ir galbūt slopinantys endogeninius imuninius atsakus. Tolesnis šių reguliuojančių metabolitų funkcinio vaidmens aprašymas gali atverti alternatyvias strategijas priešnavikiniam imuniniam atsakui sustiprinti.
Pacientų mėginiai ir klinikiniai duomenys buvo gauti per BC vėžio naviko audinių saugyklą, sertifikuotą Kanados audinių saugyklų tinklo. Pagal BC vėžio tyrimų etikos komiteto ir Britų Kolumbijos universiteto patvirtintą protokolą (H07-00463), iš visų pacientų mėginių ir klinikinių duomenų buvo gautas informuotas rašytinis sutikimas arba oficialiai atsisakyta jo sutikimo. Mėginiai saugomi sertifikuotoje biobanko saugykloje (BRC-00290). Išsamios pacientų charakteristikos pateiktos S1 ir S5 lentelėse. Kriokonservavimui skalpeliu mechaniškai suskaidomas paciento naviko mėginys, o po to jis stumiamas per 100 mikronų filtrą, kad būtų gauta vienos ląstelės suspensija. Paciento ascitas buvo centrifuguojamas 1500 aps./min. greičiu 10 minučių 4 °C temperatūroje, kad būtų sugranuluotos ląstelės ir pašalintas supernatantas. Iš naviko ir ascito gautos ląstelės buvo kriokonservuotos 50 % karščiu inaktyvuoto žmogaus AB serumo („Sigma-Aldrich“), 40 % RPMI-1640 („Thermo Fisher Scientific“) ir 10 % dimetilsulfoksido tirpale. Šios konservuotos vienaląsčių suspensijos buvo atšildytos ir panaudotos toliau aprašytai metabolomikai ir metabolitų nustatymui.
Pilną terpę sudaro 0,22 μm filtruotas 50:50 papildytas RPMI 1640:AimV. RPMI 1640 + 2,05 mM l-glutamino („Thermo Fisher Scientific“), papildyto 10 % karščiu inaktyvuoto žmogaus AB serumo („Sigma-Aldrich“), 12,5 mM Hepes („Thermo Fisher Scientific“), 2 mM l-glutamino („Thermo Fisher Scientific“), 1 x penicilino streptomicino (PenStrep) tirpalo („Thermo Fisher Scientific“) ir 50 μMB-merkaptoetanolio. AimV („Invitrogen“) papildyta 20 mM Hepes („Thermo Fisher Scientific“) ir 2 mM l-glutamino („Thermo Fisher Scientific“). Srauto citometro dažymo buferį sudarė 0,22 μm filtruotas fosfatu buferuotas fiziologinis tirpalas (PBS; „Invitrogen“), papildytas 3 % karščiu inaktyvuoto AB žmogaus serumo („Sigma“). Ląstelių praturtinimo buferis sudarytas iš 0,22 μm filtruoto PBS ir papildytas 0,5 % karščiu inaktyvuoto žmogaus AB serumo (Sigma-Aldrich).
37 °C temperatūros pilnoje terpėje ląstelės 30 minučių buvo dažomos 10 nM MT DR ir 100 μM 2-NBDG. Po to ląstelės 15 minučių buvo dažomos gyvybingumo dažikliu eF506 4 °C temperatūroje. Ląsteles resuspenduokite FC bloke (eBioscience) ir Brilliant dažymo buferyje (BD Biosciences), praskieskite srauto citometro dažymo buferiu (pagal gamintojo instrukcijas) ir inkubuokite 10 minučių kambario temperatūroje. Ląsteles nudažykite antikūnų rinkiniu (S2 lentelė) srauto citometrijos dažymo buferyje 4 °C temperatūroje 20 minučių. Prieš analizę ląsteles resuspenduokite srauto citometrijos dažymo buferyje („Cytek Aurora“; 3L-16V-14B-8R konfigūracija). Ląstelių skaičiaus duomenims analizuoti naudokite „SpectroFlo“ ir „FlowJo V10“, o duomenims sukurti naudokite „GraphPad Prism 8“. 2-NBDG ir MT DR medianinis fluorescencijos intensyvumas (MFI) buvo normalizuotas logaritmu, o tada statistinei analizei atlikti buvo naudojamas porinis t testas, siekiant atsižvelgti į sutapusius pacientus. Iš analizės pašalinkite visas populiacijas, kuriose buvo mažiau nei 40 įvykių; prieš atlikdami statistinę analizę ir duomenų vizualizaciją, bet kokioms neigiamoms reikšmėms įveskite MFI reikšmę 1.
Siekdami papildyti aukščiau pateikto proceso skydelio rankinio sinchronizavimo strategiją, panaudojome pilną anotaciją formos apribojimų medžiu (FAUST) (21), kad automatiškai priskirtume ląsteles populiacijai, pašalinę negyvas ląsteles „FlowJo“ programoje. Rankiniu būdu tvarkome išvestį, kad sujungtume populiacijas, kurios, atrodo, yra neteisingai paskirstytos (sujungiant PD1+ su PD1-naviko ląstelėmis) ir išsaugotas populiacijas. Kiekviename mėginyje vidutiniškai yra daugiau nei 2 % ląstelių, iš viso 11 populiacijų.
Ficoll gradientinio tankio centrifugavimas buvo naudojamas PBMC atskirti nuo leukocitų atskyrimo produktų (STEMCELL Technologies). CD8+ T ląstelės buvo išskirtos iš PBMC naudojant CD8 MicroBeads (Miltenyi) ir 2 savaites padaugintos pilnoje terpėje naudojant TransAct (Miltenyi) pagal gamintojo instrukcijas. Ląstelės buvo paliktos 5 dienas pastovėti pilnoje terpėje, kurioje buvo IL-7 (10 ng/ml; PeproTech), o po to pakartotinai stimuliuojamos TransAct. 7 dieną, vadovaujantis gamintojo instrukcijomis, žmogaus CD45 MicroBeads (Miltenyi) buvo naudojamos ląstelėms praturtinti trimis iš eilės etapais. Ląstelės buvo padalintos į alikvotines dalis srauto citometrijos analizei (kaip aprašyta aukščiau), o vienas milijonas ląstelių buvo padalintos į alikvotines dalis tris kartus LC-MS/MS analizei. Mėginiai buvo apdoroti LC-MS/MS, kaip aprašyta toliau. Trūkstamo metabolito vertę įvertinome naudodami 1000 jonų skaičių. Kiekvienas mėginys normalizuojamas pagal bendrą jonų skaičių (TIC), logaritmiškai konvertuojamas ir automatiškai normalizuojamas „MetaboAnalystR“ prieš analizę.
Kiekvieno paciento pavienių ląstelių suspensija buvo atšildyta ir filtruojama per 40 μm filtrą į pilną terpę (kaip aprašyta aukščiau). Pagal gamintojo protokolą, trys iš eilės teigiamos atrankos etapai magnetinių granulių atskyrimu naudojant „MicroBeads“ („Miltenyi“) buvo panaudoti mėginiams praturtinti CD8+, CD4+ ir CD45- ląstelėmis (ant ledo). Trumpai tariant, ląstelės resuspenduojamos ląstelių praturtinimo buferyje (kaip aprašyta aukščiau) ir suskaičiuojamos. Ląstelės buvo inkubuojamos su žmogaus CD8 granulėmis, žmogaus CD4 granulėmis arba žmogaus CD45 granulėmis („Miltenyi“) 4 °C temperatūroje 15 minučių, o po to plaunamos ląstelių praturtinimo buferiu. Mėginys perleidžiamas per LS kolonėlę („Miltenyi“), o teigiamos ir neigiamos frakcijos surenkamos. Siekiant sutrumpinti trukmę ir maksimaliai padidinti ląstelių regeneravimo etapą, CD8 frakcija naudojama antrajam CD4+ praturtinimo etapui, o CD4 frakcija – vėlesniam CD45 praturtinimui. Viso atskyrimo proceso metu tirpalą laikykite ant ledo.
Norint paruošti mėginius metabolitų analizei, ląstelės buvo vieną kartą perplautos lediniu druskos tirpalu, į kiekvieną mėginį įpilta 1 ml 80 % metanolio, tada sumaišytos sūkuriniame maišytuve ir greitai užšaldytos skystame azote. Mėginiai buvo tris kartus užšaldyti ir atšildyti, centrifuguoti 14 000 aps./min. greičiu 15 minučių 4 °C temperatūroje. Viršslanis, kuriame yra metabolitų, išgarinamas iki sausumo. Metabolitai buvo vėl ištirpinti 50 μl 0,03 % skruzdžių rūgšties, sumaišyti sūkuriniame maišytuve, o tada centrifuguoti, kad būtų pašalintos nuosėdos.
Išskirkite metabolitus, kaip aprašyta aukščiau. Perkelkite supernatantą į efektyviosios skysčių chromatografijos butelį metabolomikos tyrimams. Naudokite atsitiktinio apdorojimo protokolą, kad kiekvienas mėginys būtų apdorotas panašiu ląstelių skaičiumi, siekiant išvengti partijos poveikio. Atlikome kokybinį bendrų metabolitų vertinimą, anksčiau paskelbtą AB SCIEX QTRAP 5500 trigubo kvadrupolinio masių spektrometru (50). Chromatografinė analizė ir smailės ploto integravimas buvo atlikti naudojant „MultiQuant“ 2.1 versijos programinę įrangą („Applied Biosystems SCIEX“).
Trūkstamo metabolito vertei įvertinti buvo naudojamas 1000 jonų skaičius, o kiekvieno mėginio TIC buvo naudojamas normalizuotam kiekvieno aptikto metabolito smailės plotui apskaičiuoti, siekiant pakoreguoti pokyčius, atsiradusius dėl instrumentinės analizės apdorojimo metu. Normalizavus TIC, logaritminei konversijai ir automatiniam norminės linijos mastelio keitimui naudojamas „MetaboAnalystR(51)“ (numatytasis parametras). Tiriamajai metabolomų skirtumų tarp mėginių tipų analizei atlikti naudojome PCA su vegan R paketu, o pacientams analizuoti naudojome dalinę perteklinę analizę. Wardo metodą naudojome šilumos žemėlapio dendrogramai sudaryti, kad sugrupuotume euklidinį atstumą tarp mėginių. Standartizuotam metabolitų gausumui nustatyti visame ląstelių tipe ir mikroaplinkoje naudojome limmos (52) metodą. Siekdami supaprastinti paaiškinimą, modeliui nurodyti naudojame grupės vidurkio parametrą ir kiekvienai grupei (n = 6 grupės) priskiriame ląstelių tipus mikroaplinkoje; reikšmingumo testui atlikome tris pakartotinius kiekvieno metabolito matavimus. Siekiant išvengti klaidingo pakartojimo, pacientas į limmos dizainą buvo įtrauktas kaip kliūtis. Siekdami patikrinti metabolitų skirtumus tarp skirtingų pacientų, pakoregavome limmos modelį, įtraukdami pacientus fiksuotu būdu. Pateikiame iš anksto nustatyto kontrasto tarp ląstelių tipo ir Padj < 0,05 mikroaplinkos reikšmingumą (Benjamini-Hochbergo korekcija).
Po vigor praturtinimo naudojant „Miltenyi“ negyvų ląstelių šalinimo rinkinį (>80 % gyvybingumas), naudojant 10x 5′geno raiškos protokolą, buvo atlikta vienos ląstelės transkriptomo sekvencija visuose gyvuose užšaldytuose ascito ir naviko mėginiuose. Buvo analizuojami penki atvejai su sutampančiais navikais ir ascitu, nors mažas vieno naviko mėginio gyvybingumas neleido jo įtraukti. Siekdami atrinkti kelis pacientus, sujungėme kiekvieno paciento mėginius 10x chromo valdiklio juostose ir atskirai analizavome ascito ir naviko vietas. Po sekvenavimo [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp suporuotas galas (PE), Kvebeko genomas; vidutiniškai 73 488 ir 41 378 nuskaitymai vienai ląstelei atitinkamai naviko ir ascito atveju]], naudojome CellSNP ir Vireo (53) (remiantis CellSNP, nes GRCh38 pateiktas bendras žmogaus SNP (VCF) priskiriamas donoro tapatybei. Mes naudojame SNPRelate, kad nustatytume artimiausią paciento genotipo būsenos (IBS) tapatybę (IBS), neįtraukdami nepriskirtų ląstelių ir ląstelių, identifikuotų kaip dupleksai, ir suderindami donorus tarp ascito ir naviko mėginių (54). Remdamiesi šia užduotimi, tolesnei analizei pasirinkome tris atvejus, kai naviko ir ascito ląstelės buvo gausiai reprezentuotos. Atlikus masinio filtravimo etapą scater (55) ir scran (56) BioConductor pakuotėse, analizei gavome 6975 ląsteles (atitinkamai 2792 ir 4183 ląsteles iš naviko ir ascito). Mes naudojame igraph (57) Louvain klasterizaciją bendram artimiausių kaimynų tinklui (SNN), pagrįstą Jaccard atstumu iki klasterio ląstelių pagal išraišką. Klasteriai buvo rankiniu būdu priskirti galimiems ląstelių tipams, remiantis žymenų genų raiška, ir vizualizuoti naudojant t-SNE. Citotoksinės T ląstelės apibrėžiamos pagal CD8A ir GZMA raišką, išskyrus subklasterius, kuriuose ribosominių baltymų raiška yra maža. Mes pasinaudojome Izar ir kt. (16) paskelbtais duomenimis, įskaitant jų t-SNE įterpimą, kuris gali kontroliuoti imuninių ląstelių žymenų ir NNMT raiškos persidengimą.
PBMC buvo atskirtos nuo leukocitų atskyrimo produktų (STEMCELL Technologies) naudojant Ficoll gradiento tankio centrifugavimą. CD3+ ląstelės buvo išskirtos iš PBMC naudojant CD3 granules (Miltenyi). Esant arba nesant MNA, CD3+ ląstelės buvo aktyvuotos prie plokštelės surištu CD3 (5 μg/ml), tirpiu CD28 (3 μg/ml) ir IL-2 (300 U/ml; Proleukinas). Paskutinę dauginimo dieną gyvybingumas (fiksuojamas gyvybingumo dažiklis eFluor450, eBioscience) ir proliferacija (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) buvo įvertinti srauto citometrija. Efektorinė funkcija įvertinama stimuliuojant ląsteles PMA (20 ng/ml) ir jonomicinu (1 μg/ml) naudojant GolgiStop 4 valandas ir stebint CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4, BioLegend) ir TNFα-fluoresceino izotiocianatą (FITC) (MAb11, BD). qPGR ir ChIP ląstelės stimuliuojamos PMA (20 ng/ml) ir jonomicinu (1 μg/ml) 4 valandas. ELISA supernatantas buvo surenkamas prieš ir po stimuliacijos PMA (20 ng/ml) ir jonomicinu (1 μg/ml) 4 valandas.
Laikykitės gamintojo protokolo, kad išskirtumėte RNR naudodami „RNeasy Plus Mini Kit“ (QIAGEN). Mėginiui homogenizuoti naudokite „QIAshredder“ (QIAGEN). Komplementariai DNR (kDNR) susintetinti naudokite didelės talpos RNR į kDNR rinkinį („Thermo Fisher Scientific“). Genų raiškai kiekybiškai įvertinti naudokite „TaqMan Rapid Advanced Master Mix“ („Thermo Fisher Scientific“) (pagal gamintojo protokolą) su šiais zondais: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [gliceraldehido-3-fosfatas be vandenilio (GAPDH)] ir Hs01010726_m1 (SLC22A2). Mėginiai buvo tiriami „StepOnePlus“ realaus laiko PGR sistemoje („Applied Biosystems“) („Applied Biosystems“) greitos optinės 96 šulinėlių reakcijos plokštelėje „MicroAmp“ („Applied Biosystems“) su „MicroAmp“ optine plėvele. Bet kokia Ct vertė, viršijanti 35, laikoma viršijančia aptikimo slenkstį ir žymima kaip neaptinkama.
Atlikite ChIP, kaip aprašyta anksčiau (58). Trumpai tariant, ląstelės buvo apdorotos formaldehidu (galutinė koncentracija 1,42 %) ir inkubuojamos kambario temperatūroje 10 minučių. 10 minučių ant ledo naudokite papildytą brinkinimo buferį (25 mM Hepes, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl ir 0,1 % NP-40), tada resuspenduokite imunoprecipitacijos buferyje, kaip aprašyta (58). Tada mėginys buvo sonikuojamas šiais ciklais: 10 ciklų (20 1 sekundės impulsų) ir statinis laikas 40 sekundžių. Inkubuokite ChIP klasės imunoglobulino G (ląstelių signalizavimo technologija; 1 μl), histono H3 (ląstelių signalizavimo technologija; 3 μl), NFAT (Invitrogen; 3 μl) ir SP1 (ląstelių signalizavimo technologija; 3 μl) antikūnus su mėginiu 4 °C temperatūroje ir kratykite per naktį. Baltymo A granules („Thermo Fisher Scientific“) inkubuokite su mėginiu 4 °C temperatūroje 1 valandą švelniai kratydami, tada DNR praturtinkite chelex granulėmis („Bio-Rad“) ir baltymams virškinti naudokite proteinazę K („Thermo Fisher“). TNFα promotorius buvo aptiktas PGR metodu: tiesioginis – GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; priešingai – GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (207 bp produktas). Vaizdus sukūrė „Image Lab“ („Bio-Rad“) ir kiekybiškai įvertino naudodami „ImageJ“ programinę įrangą.
Ląstelių kultūros supernatantas buvo surinktas, kaip aprašyta aukščiau. Nustatymas buvo atliktas pagal žmogaus TNFα ELISA rinkinio („Invitrogen“), žmogaus IL-2 ELISA rinkinio („Invitrogen“) ir žmogaus IFN-γ ELISA rinkinio („Abcam“) gamintojo procedūras. Pagal gamintojo protokolą, supernatantas buvo praskiestas santykiu 1:100, siekiant aptikti TNFα ir IL-2, ir santykiu 1:3, siekiant aptikti IFN-γ. Absorbcijai matuoti esant 450 nm bangos ilgiui, naudojamas „EnVision 2104 Multilabel Reader“ („PerkinElmer“).
PBMC buvo atskirtos nuo leukocitų atskyrimo produktų (STEMCELL Technologies) naudojant Ficoll gradiento tankio centrifugavimą. CD3+ ląstelės buvo išskirtos iš PBMC naudojant CD3 granules (Miltenyi). Esant arba nesant MNA, CD3+ ląstelės 3 dienas buvo aktyvuojamos prie plokštelės surištu CD3 (5 μg/ml), tirpiu CD28 (3 μg/ml) ir IL-2 (300 U/ml; Proleukinas). Po 3 dienų ląstelės buvo surinktos ir nuplautos 0,9 % fiziologiniu tirpalu, o granulės buvo greitai užšaldytos. Ląstelių skaičius buvo atliktas srauto citometrijos metodu (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R konfigūracija) naudojant 123count eBeads.
Išskirkite metabolitus, kaip aprašyta aukščiau. Džiovintas ekstraktas buvo atkurtas iki 4000 ląstelių ekvivalentų/μl koncentracijos. Mėginį analizuokite atvirkštinės fazės chromatografija („1290 Infinity II“, „Agilent Technologies“, Santa Klara, Kalifornija) ir CORTECS T3 kolonėle (2,1 × 150 mm, dalelių dydis 1,6 μm, porų dydis 120 Å; #186008500, „Waters“). Poliarinis masių spektrometras („6470“, „Agilent“), kuriame elektropurškimo jonizacija veikia teigiamu režimu. Mobilioji fazė A yra 0,1 % skruzdžių rūgšties (H2O), mobilioji fazė B yra 90 % acetonitrilo, 0,1 % skruzdžių rūgšties. LC gradientas yra 0–2 minutės 100 % A, 2–7,1 minutės 99 % B ir 7,1–8 minutės 99 % B. Tada kolonėlė vėl subalansuojama mobiliąja faze A, esant 0,6 ml/min. srauto greičiui 3 minutes. Srauto greitis yra 0,4 ml/min., o kolonėlės kamera įkaitinama iki 50 °C. Sulaikymo laikui (RT) ir transformacijai (RT = 0,882 minutės, 1 transformacija = 137→94,1, 2 transformacija = 137→92, 3 konversija = 137→78) nustatyti naudojamas MNA grynas cheminis standartas (M320995, „Toronto Research Chemical Company“, North York, Ontarijas, Kanada). Kai visi trys perėjimai įvyksta tinkamu sulaikymo laiku, specifiškumui užtikrinti kiekybiniam nustatymui naudojamas 1 perėjimas. MNA (Toronto tyrimų chemijos kompanija) standartinė kreivė buvo gauta šešiais nuosekliais pradinio tirpalo (1 mg/ml) skiedimais, siekiant gauti atitinkamai 0,1, 1,0, 10 ir 100 ng/ml bei 1,0 ir 10 μg/ml skysčio standartus. Aptikimo riba yra 1 ng/ml, o tiesinis atsakas yra nuo 10 ng/ml iki 10 μg/ml. Kiekviena dviejų mikrolitrų mėginio ir standarto injekcija naudojama LC/MS analizei, o mišrus kokybės kontrolės mėginys atliekamas kas aštuonias injekcijas, siekiant užtikrinti analizės platformos stabilumą. Visų MNA apdorotų ląstelių mėginių MNA atsakai buvo tyrimo tiesiniame diapazone. Duomenų analizė atlikta naudojant „MassHunter“ kiekybinės analizės programinę įrangą (9.0 versija, „Agilent“).
Antros kartos αFR-CAR konstrukcija buvo paimta iš Song ir kt. (59). Trumpai tariant, konstrukciją sudaro: CD8a lyderio seka, žmogaus αFR specifinis vienos grandinės kintamasis fragmentas, CD8a vyrio ir transmembraninė sritis, CD27 viduląstelinis domenas ir CD3z viduląstelinis domenas. Visa CAR seka buvo susintetinta naudojant „GenScript“, o po to klonuota į antros kartos lentivirusinį raiškos vektorių prieš GFP raiškos kasetę, naudojamą transdukcijos efektyvumui įvertinti.
Lentivirusas gaminamas transfekuojant HEK293T ląsteles [Amerikos tipų kultūrų kolekcija (ATCC); auginamos Dulbecco modifikuotoje Eagle terpėje, kurioje yra 10 % vaisiaus galvijų serumo (FBS) ir 1 % PenStrep, ir naudojamas CAR-GFP vektorius, o pakavimo plazmidėse (psPAX2 ir pMD2.G, Addgene) naudojamas lipofekcijos aminas (Sigma-Aldrich). Virusą turintis supernatantas buvo surinktas praėjus 48 ir 72 valandoms po transfekcijos, filtruojamas ir sukoncentruojamas ultracentrifuguojant. Koncentruotą virusinį supernatantą laikyti -80 °C temperatūroje iki transdukcijos.
PBMC nuo sveikų donorų leukocitų atskyrimo produktų (STEMCELL Technologies) atskiriami Ficoll gradiento tankio centrifugavimo būdu. CD8+ ląstelėms iš PBMC išskirti naudojamos teigiamos atrankos CD8 mikrogranulės (Miltenyi). T ląstelės stimuliuojamos TransAct (Miltenyi) ir TexMACS terpėje [Miltenyi; papildyta 3 % karščiu inaktyvuoto žmogaus serumo, 1 % PenStrep ir IL-2 (300 U/ml)]. Praėjus dvidešimt keturioms valandoms po stimuliacijos, T ląstelės buvo transdukuotos lentivirusu (10 μl koncentruoto viruso supernatanto 106 ląstelėms). Praėjus 1–3 dienoms po transdukcijos Cytek Aurora terpėje (FSC (tiesioginė sklaida) / SSC (šoninė sklaida), Singlet, GFP+), įvertinama ląstelių GFP raiška, siekiant parodyti bent 30 % transdukcijos efektyvumą.
CAR-T ląstelės buvo kultivuojamos 24 valandas „Immunocult“ terpėje (STEMCELL Technologies; papildyta 1 % PenStrep) tokiomis sąlygomis: neapdorotos, apdorotos 250 μM adenozinu arba 10 mM MNA. Po išankstinio apdorojimo CAR-T ląstelės buvo plaunamos PBS ir sujungtos su 20 000 SK-OV-3 ląstelių [ATCC; McCoy 5A terpėje (Sigma-Aldrich), papildytoje 10 % FBS ir 1 % PenStrep, esant 10:10: efektoriaus ir taikinio santykis 1 buvo amplifikuotas trimis egzemplioriais papildytoje „Immunocult“ terpėje. SK-OV-3 ląstelės ir SK-OV-3 ląstelės, lizuotos rusmenės saponinu (0,5 mg/ml; Sigma-Aldrich), buvo naudojamos kaip neigiamos ir teigiamos kontrolės. Po 24 valandų bendro kultivavimo supernatantas buvo surinktas ir laktatdehidrogenazės (LDH) kiekis buvo išmatuotas pagal gamintojo instrukcijas (LDH Glo citotoksiškumo tyrimo rinkinys, Promega). LDH supernatantas buvo praskiestas santykiu 1:50 LDH buferiu. Naikinimo procentas buvo apskaičiuotas pagal šią formulę: žūimo procentas = korekcijos procentas / maksimalus žūimo greitis x 100 %, kur korekcijos procentas = tik bendra kultūra – T ląstelės, o maksimalus žūimo greitis = teigiama kontrolė – neigiama kontrolė.
Kaip aprašyta tekste arba medžiagose ir metoduose, statistinei analizei naudokite „GraphPad Prism 8“, „Microsoft Excel“ arba „R v3.6.0“. Jei iš to paties paciento surinkti keli mėginiai (pvz., ascitas ir navikas), naudojame porinį t testą arba pacientą įtraukiame kaip atsitiktinį efektą į tiesinį arba apibendrintą modelį, jei tinka. Metabolomikos analizei svarbos testas atliekamas trimis egzemplioriais.
Papildomos šio straipsnio medžiagos ieškokite adresu http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
Tai yra atviros prieigos straipsnis, platinamas pagal „Creative Commons Attribution-NonCommercial“ licenciją, kuri leidžia naudoti, platinti ir atgaminti bet kokioje terpėje, jei galutinis panaudojimas nėra skirtas komercinei naudai ir jei prielaida yra ta, kad originalus kūrinys yra teisingas. Nuoroda.
Pastaba: prašome jūsų pateikti savo el. pašto adresą tik tam, kad asmuo, kurį rekomenduojate puslapiui, žinotų, jog norite, kad jis matytų el. laišką ir kad tai nėra šlamštas. Mes neužfiksuosime jokių el. pašto adresų.
Šis klausimas naudojamas norint patikrinti, ar esate lankytojas, ir užkirsti kelią automatiniam šlamšto siuntimui.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), Johnas Staggas (Johnas Staggas), Bradas H. Nelsonas (Bradas H. Nelsonas), Bradas H. Nelsonas (Bradas H. Nelsonas), Ralphas J.B.R. G. Jonesas (Russellas G. Jonesas), Phineasas T. Hamiltonas (Phineasas T.
MNA prisideda prie T ląstelių imuninio slopinimo ir yra potencialus imunoterapijos taikinys žmogaus vėžio gydymui.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), Johnas Staggas (Johnas Staggas), Bradas H. Nelsonas (Bradas H. Nelsonas), Bradas H. Nelsonas (Bradas H. Nelsonas), Ralphas J.B.R. G. Jonesas (Russellas G. Jonesas), Phineasas T. Hamiltonas (Phineasas T.
MNA prisideda prie T ląstelių imuninio slopinimo ir yra potencialus imunoterapijos taikinys žmogaus vėžio gydymui.
©2021 Amerikos mokslo pažangos asociacija. visos teisės saugomos. AAAS yra HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ir COUNTER partneris. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.