Dėkojame, kad apsilankėte Nature.com. Jūsų naudojama naršyklės versija turi ribotą CSS palaikymą. Kad užtikrintumėte geriausią patirtį, rekomenduojame naudoti atnaujintą naršyklę (arba išjungti suderinamumo režimą „Internet Explorer“). Tuo tarpu, siekdami užtikrinti nuolatinį palaikymą, svetainę rodysime be stilių ir „JavaScript“.
Skirtingai nuo stuburinių, vabzdžiams plačiai manoma, kad trūksta patinams palankių lytinių steroidinių hormonų. Anopheles gambiae atveju ekdizono steroidas 20-hidroksiekdizonas (20E), regis, išsivystė taip, kad kontroliuotų kiaušinėlių vystymąsi, kai jį sintetina patelės2, ir sukeltų poravimosi atsparumo periodą, kai jį lytiškai perduoda patinai3. Kadangi kiaušinėlių vystymasis ir poravimasis yra esminiai reprodukciniai požymiai, supratimas, kaip Anopheles uodų patelės integruoja šiuos hormoninius signalus, galėtų palengvinti naujų maliarijos kontrolės programų kūrimą. Čia atskleidžiame, kad šias reprodukcines funkcijas reguliuoja skirtingi lytiniai steroidai per sudėtingą ekdisteroidus aktyvuojančių / inaktyvuojančių fermentų tinklą. Nustatėme patinams būdingą oksiduotą ekdizoną, 3-dehidro-20E (3D20E), kuris apsaugo tėvystę, sustabdydamas patelių lytinį imlumą po lytinio perdavimo ir aktyvavimo defosforilinimo būdu. Pažymėtina, kad 3D20E perdavimas taip pat sukėlė reprodukcinių genų, kurie palaiko kiaušinėlių vystymąsi Plasmodium infekcijos metu, raišką, užtikrindamas užkrėstų patelių sveikatą. Iš patelių gautas 20E nesukelia seksualinio atsako, bet leidžia poruotis individams deda kiaušinėlius po to, kai yra slopinamos 20E slopinančios kinazės. Šio patinams būdingo vabzdžių steroidinio hormono identifikavimas ir jo vaidmuo reguliuojant patelių lytinį imlumą, vaisingumą ir sąveiką su Plasmodium rodo, kad jis gali sumažinti maliariją platinančių uodų reprodukcinę sėkmę.
Maliarijos atvejų ir mirčių skaičius vėl auga4 dėl plačiai paplitusio Anopheles uodų, vienintelių žmonių maliarijos parazitų pernešėjų, atsparumo insekticidams. Šių uodų poravimosi biologija yra ypač patrauklus taikinys naujoms maliarijos kontrolės intervencijoms, nes patelės poruojasi tik vieną kartą5; šio vieno poravimosi atvejo sterilumas turėtų didelį potencialą sumažinti uodų populiacijas lauke.
Moterys tampa lytiškai nedarbingos, gavusios iš vyrų didelio titro steroidinių hormonų. Tyrimai parodė, kad sunkumų tolesniam poravimuisi sukelia 20-hidroksiekdizonas (20E) – steroidinis hormonas, geriau žinomas kaip lervos stadijos šėrimosi ciklo reguliatorius. Patinų gebėjimas sintetinti ir perduoti 20E išsivystė būtent Anopheles rūšyse, kurios priklauso Cellia7 pogenčiui, paplitusiam Afrikoje ir apimančiam pavojingiausius maliarijos vektorius, įskaitant Anopheles gambiae. Tai ypač verta paminėti, nes šių rūšių patelės taip pat gamina 20E po kiekvieno kraujo maitinimosi, o 20E skatina oogenezės ciklą (žr. 8 nuorodą). Tačiau mažai žinoma apie tai, kaip patelės integruoja signalus iš dviejų skirtingų ekdizono šaltinių (patinų perdavimo ir kraujo maitinimo indukcijos), nepakenkdamos savo gebėjimui poruotis. Tiesą sakant, jei patelių gaminamas 20E sukelia seksualinę netoleranciją, tai sukels nevaisingumą nekaltiems individams – labai dažnas šių uodų elgesys5.
Galimas paaiškinimas yra tas, kad A. gambiae patinai perneša modifikuotą patinams būdingą ekdizoną, kuris aktyvuoja signalizacijos kaskadą patelių reprodukciniame trakte, sukeldamas poravimosi nestabilumą. Tačiau, nors stuburiniai gyvūnai turi daug steroidinių hormonų, tokių kaip estrogenas ir androgenas (apžvelgta 9 nuorodoje), mūsų žiniomis, vabzdžiams androgenų veikiamų steroidų nenustatyta.
Ieškodami galimų modifikuojančių steroidų, siekėme nustatyti lytiškai subrendusių A. gambiae vyriškosios liaukos (MAG) steroidinių hormonų repertuarą. Naudodami efektyviąją skysčių chromatografiją kartu su tandemine masių spektrometrija (HPLC-MS/MS), o ne anksčiau naudotą mažiau specifinį metodą, šiame audinyje aptikome ekdizoną (E) ir 20E, patvirtindami ankstesnį rezultatą. Tačiau mėginyje vyravo oksiduoti fosforilinti steroidai, atitinkantys formulę 3-dehidro-20E-22-fosfatas (3D20E22P)12 (1 pav.). Kitos formos yra 3-dehidro-20E (3D20E) ir 20E-22-fosfatas (20E22P). 3D20E22P HPLC-MS/MS signalo intensyvumas buvo dviem dydžio eilėmis didesnis nei jo defosforilintos formos 3D20E ir trimis dydžio eilėmis didesnis nei E ir 20E (1 pav.). Nors kitose kūno dalyse ir apatinėje reprodukcinėje dalyje (LRT; išplėstiniai duomenys, 1 pav.) 1a). Taip pat analizavome ekdisteroidus naujai apvaisintuose (<1 dienos amžiaus) patinuose ir patelėse ir aptikome 3D20E ir 3D20E22P tik MAG; E, 20E ir 20E22P buvo abiejų lyčių organizmuose (išplėstiniai duomenys, 1b pav.). Šie duomenys rodo, kad suaugę A. gambiae patinai savo MAG gamina didelius modifikuojančių hormonų titrus, kurių patelės nesintezuoja.
Iš 4 dienų (4 dienų) nekaltybių patinų ir nekaltybių bei poruotų patelių (0,5, 3 ir 12 hpm) buvo išpreparuoti MAG ir patelių LRT (įskaitant prieširdžius, sėklines pūsleles ir parovariumą). Šiuose audiniuose esantis ekdizonas buvo analizuojamas HPLC-MS/MS metodu (vidurkis ± standartinė paklaida; neporinis t testas, dvipusis, klaidingų atradimų dažnis (FDR) pakoreguotas; NS, nereikšmingas; *P < 0,05, **P < 0,01. 3D20E: 3 valandos ir 0,5 valandos, P = 0,035; 12 valandų ir 3 valandos, P = 0,0015; 12 valandų ir 0,5 valandos, P = 0,030. 3D20E22P: 3 valandos ir 0,5 valandos, P = 0,25; 12 valandų ir 3 valandos, P = 0,0032; 12 valandų ir 0,5 valandos, P = 0,015). Duomenys gauti iš trijų biologinių pakartojimų. Kiekvieno dominančio ekdizono smailės plotas buvo apskaičiuotas ir normalizuotas pagal uodų skaičių. Ekdizonas vaizduojamas taip: E, žalia; 20E, oranžinė; 20E22P, violetinė; 3D20E, mėlyna; 3D20E22P, rožinė. Įdėklas padidina skalę y ašyje, kad būtų parodyti mažesni ekdizono lygiai.
Norėdami ištirti, ar 3D20E22P ir 3D20E perduodami poravimosi metu, įvairiais laiko momentais po poravimosi išpreparavome patelių LRT. Nors mergelių organizme ekdizono nerasta, iškart po poravimosi (0,5 val. po poravimosi, hpm) LRT pastebėjome didelį 3D20E22P kiekį, kuris laikui bėgant mažėjo, o 3D20E lygis reikšmingai padidėjo (1 pav.). Naudodami chemiškai susintetintą 3D20E kaip standartą, nustatėme, kad šio steroidinio hormono lygis poruojančiuose LRT buvo bent 100 kartų didesnis nei 20E (išplėstinių duomenų 1 lentelė). Taigi, 3D20E22P yra pagrindinis patinų ekdizonas, kuris poravimosi metu perkeliamas į patelių LRT, o jo defosforilinta forma 3D20E tampa labai gausi netrukus po poravimosi. Tai rodo svarbų pastarojo ekdizono vaidmenį patelių biologijoje po poravimosi.
Sukūrę naują RNR sekoskaitos (RNR-sekvenavimo) duomenų rinkinį (2a pav.), naudodami specialiai sukurtą bioinformatikos kanalą, ieškojome ekdizono kinazės (EcK), ekdizono oksidazės (EO) ir ekdizono, koduojančio 20E modifikuotą fosfatazės geną. EPP) yra ekspresuojamas reprodukciniuose audiniuose. Nustatėme vieną EPP geno kandidatą ir du potencialius EcK genus (EcK1 ir EcK2), tačiau nepavyko rasti gero EO geno kandidato. Pažymėtina, kad atskiri EPP genai buvo ekspresuojami aukštu lygiu (98,9 procentilės) Gambijos MAG, bet ne patelių LRT (2b pav.), priešingai nei tikėjomės, nes šiame patelės audinyje įvyko 3D20E22P defosforilinimas. Todėl manome, kad patininis EPP gali būti perduotas poravimosi metu. Iš tiesų, po poravimosi panaudojome in vivo stabilių izotopų žymėjimą, kad užmaskuotume patelės baltymą – fermentą, kurį MS identifikuoja patelės prieširdyje (2c pav. ir 1 papildoma lentelė). EPP buvimas MAG ir Porautoje (bet ne nekaltumo) patelių LRT buvimas taip pat buvo patvirtintas naudojant specifinius antikūnus (2d pav.).
a, Individualiai sukurtas bioinformatikos kanalas, skirtas kiekvienos lyties reprodukciniuose audiniuose ieškoti genų, koduojančių EcK, EO ir EPP. Skaičiai šalia rodyklių rodo vyriškos ir moteriškos lyties kandidatų skaičių kiekviename etape. Ši analizė nustatė vieną EPP geną (EPP) ir vieną EcK geną (EcK1), kurie yra ekspresuojami patinų organizmuose, ir vieną EcK geną (EcK2), kuris yra ekspresuojamas abiejų lyčių organizmuose, bet nesuteikia kandidato EO geno. b, Šilumos žemėlapis, kuriame lyginama kandidato genų raiška nekaltų (V) ir poruojančių (M) Anopheles gambiae ir Anopheles albicans audiniuose. Spca, apvaisinimas; MAG, pagalbinės liaukos patinų organizmuose; kitos kūno dalys, įskaitant krūtis, sparnus, kojas, riebalinius kūnus ir vidaus organus abiejų lyčių asmenims, o patelių – kiaušides. EcK2 yra labai ekspresuojamas tiek Gambijos MAG, tiek prieširdžiuose, o EPP randamas tik MAG.c, patinų ejakuliato grupės perkėlimo į patelių prieširdžius proteominė analizė 3, 12 ir 24 hpm, rodanti 67 gausiausius baltymus. Patelės buvo auginamos su dieta, kurioje buvo 15N, kad būtų pažymėti (ir užmaskuoti) visi baltymai. Nepažymėti patinai buvo sukryžminti su pažymėtomis patelėmis, o patelių LRT buvo išpreparuotos 3, 12 ir 24 hpm proteominei analizei (žr. 1 papildomą lentelę, kurioje pateikiamas visas ejakuliacinių baltymų sąrašas). Įdėkle: EPP, Eck1 ir EcK2 buvo aptikti nekaltų patinų MAG, atlikus šių audinių proteominę analizę.d, EPP buvo aptiktas Western bloto metodu poruotų patelių MAG ir LRT, bet ne nekaltose patelėse ar patinuose ar likusioje patelės kūno dalyje. Membranos buvo vienu metu zonduota anti-aktinu (įkrovos kontrolė) ir anti-EPP antikūnais. Visi vyrai yra nekaltybės nepraradę. Žr. 1 papildomą paveikslą, kuriame pateikti gelio šaltinio duomenys. Western blotai buvo atlikti du kartus, rezultatai buvo panašūs.
EPP ekdisteroidinės fosfofosfatazės aktyvumas buvo patikrintas po inkubacijos HPLC-MS/MS metodu su 3D20E22P, išskirtu iš MAG (išplėstiniai duomenys, 2a pav.). Be to, kai nutildėme EPP RNR sukelta interferencija (RNAi), aptikome stiprų fosfatazės aktyvumo sumažėjimą šių patinų reprodukciniuose audiniuose (3a pav.), o patelės, poruotos su EPP nutildytais patinais, parodė reikšmingai mažesnę defosforilinto 3D20E dalį (3b pav.), nepaisant dalinio genų nutildymo (išplėstiniai duomenys, 2b, c pav.). Priešingai, neaptikome reikšmingų 20E22P/20E santykio pokyčių tuose pačiuose uoduose, o tai gali rodyti, kad fermentas yra specifinis 3D20E22P (3b pav.).
a, Sumažėjęs fosfatazės aktyvumas MAG, kurį sukėlė EPP nutildymas naudojant dvigrandes EPP RNR (dsEPP) arba dvigrandes GFP RNR (dsGFP) kontrolines grupes. Kiekviename pakartojime buvo panaudota dvidešimt MAG grupių (P = 0,0046, porinis t-testas, dvipusis), pavaizduotos atskirais taškais. b, Patelės, poruotos su EPP nutildytais patinais, turėjo žymiai mažesnę defosforilinto 3D20E dalį esant 3 hpm (P = 0,0043, neporinis t-testas, dvipusis), o 20E lygiai nepakito (P = 0,063, neporiniai). t-testas, dvipusis). Duomenys pateikiami kaip vidurkis ± standartinė paklaida iš trijų grupių, kurių kiekvienoje buvo po 13, 16 ir 19 patelių.c, Patelės, sukryžmintos su EPP nutildytais patinais, turėjo žymiai didesnį pakartotinio poravimosi dažnį (P = 0,0002, Fisher'o tikslusis testas, dvipusis). Patelės pirmiausia buvo verčiamos poruotis, siekiant užtikrinti jų poravimosi statusą; Po 2 dienų jos buvo susisiektos su kitais patinais, turinčiais transgeninių spermos nešėjų, kad būtų galima įvertinti pakartotinio poravimosi dažnį kiekybine transgeno PGR aptikimu.d, Krauju maitinamos patelės, poruotos su EPP nutildytais patinais, turėjo žymiai sumažėjusį vaisingumą (P < 0,0001; dvipusis Mann-Whitney testas) ir šiek tiek sumažėjusį kiaušinėlių skaičių (P = 0,088, dvipusis Mann-Whitney testas), o neršto dažnis nepakito (P = 0,94, dvipusis Fisher'o tikslus testas). Visose diagramose n reiškia biologiškai nepriklausomų uodų mėginių skaičių.NS, nereikšmingas.*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001.
Toliau įvertinome, ar ekdizono defosforilinimas yra svarbus sukeliant patelių atsparumą poravimuisi. Pažymėtina, kad patelės, poravusios su EPP neturinčiais patinais, pakartotinai poravosi daug dažniau (44,9 %) nei kontrolinės grupės patelės (10,4 %), kai buvo veikiamos papildomų (transgeninių) patinų (3c pav.). Taip pat pastebėjome reikšmingą vaisingumo sumažėjimą (3d pav., kairėje) ir nedidelį šių patelių padėtų kiaušinėlių skaičiaus sumažėjimą (3d pav., viduryje), o patelių padėtų kiaušinėlių procentinė dalis (kita reakcija, kurią patelės sukelia poravimosi metu) nepakito (3d pav., dešinėje). Atsižvelgiant į pastebėtą EPP specifiškumą 3D20E22P, šie rezultatai rodo, kad 3D20E aktyvacija poravimosi metu pernešamo EPP gali atlikti svarbų vaidmenį išjungiant patelių imlumą tolesniam poravimuisi – elgesį, kuris anksčiau buvo siejamas su lytiniu 20E perdavimu. Todėl šis patinams būdingas hormonas taip pat stipriai veikia patelių vaisingumą.
Toliau palyginome 20E ir 3D20E aktyvumą injekcijos eksperimentuose su lytiškai subrendusiomis mergelėmis, naudodami chemiškai susintetintą 3D20E (4a–c pav.) ir komerciškai prieinamą 20E. Pastebėjome, kad 3D20E buvo žymiai veiksmingesnis nei 20E slopinant patelių jautrumą poravimuisi esant abiem koncentracijoms (4d pav.). Pažymėtina, kad pusė fiziologinio 3D20E lygio apatiniame kvėpavimo takuose (1 066 pg po injekcijos, palyginti su 2 022 pg po poravimosi) sukėlė 20 kartų didesnę atsparių patelių dalį nei fiziologinis 20E lygis (361 pg po injekcijos) praėjus 24 valandoms po injekcijos, esant didžiausiai koncentracijai (18 pg po poravimosi); Išplėstiniai duomenys (1 lentelė). Šis rezultatas atitinka mintį, kad lytinis 20E perdavimas nesukelia poravimosi refrakterinių periodų, ir dar labiau rodo, kad 3D20E yra pagrindinis veiksnys, užtikrinantis tėvų ir vaikų ryšį. 3D20E taip pat buvo žymiai aktyvesnis nei 20E kiaušinėlių dėjimo tyrimuose su nekaltomis patelėmis (4e pav.), o tai rodo, kad normalus kiaušinėlių dėjimo greitis, kurį stebėjome po dalinio EPP nutildymo, buvo susijęs su likusiu 3D20E aktyvumu, kurį vis dar sukėlė poravimosi sukelti patelių veiksniai.
(a, b) 3D20E, chemiškai susintetintas iš 20E (a), pasižymintis labai didele konversija / efektyvumu (duomenys pateikti kaip vidurkis ± standartinė nuokrypa iš trijų nepriklausomų sintezės reakcijų) (b).c, Masių spektras (apatinė pusė) tiksliai atitinka ekdizoną, rastą poruotose LRT patelėse (viršutinė pusė).d, Palyginti su 20E (0,63 µg, P = 0,02; 0,21 µg, P < 0,0001; dvipusis Fisher'o tikslusis testas) ir 10 % etanoliu (0,63 µg, P < 0,0001; 0,21 µg, P < 0,0001; dvipusis Fisher'o tikslusis testas), tuo tarpu 20E buvo žymiai didesnis už kontrolinę grupę tik esant didesnėms dozėms (0,63 µg, P = 0,0002; 0,21 µg, P = 0,54; dvipusis Fisher'o tikslusis testas).e, 3D20E injekcija sukėlė žymiai didesnis neršto dažnis nekaltoms patelėms nei 10 % etanolio kontrolinėse grupėse (0,21 µg, P < 0,0001; 0,13 µg, P = 0,0003; dvipusis Fisher'o tikslusis testas), tuo tarpu 20E, palyginti su kontrolinėmis grupėmis, tik esant didesnėms dozėms (0,21 µg, P = 0,022; 0,13 µg, P = 0,0823; dvipusis Fisher'o tikslusis testas). 3D20E sukėlė žymiai didesnį neršto dažnį nei 20E esant didesnėms dozėms (0,21 µg, P = 0,0019; 0,13 µg, P = 0,075; dvipusis Fisher'o tikslusis testas). Visose grupėse n reiškia biologiškai nepriklausomų uodų mėginių skaičių. NS, nereikšmingas. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001. Duomenys gauti iš trijų pakartojimų.
Ankstesniuose tyrimuose nustatėme, kad lytinis steroidinių hormonų perdavimas sukelia MISO (Poravimosi sukelto oogenezės stimuliatoriaus 11), patelių reprodukcinio geno, apsaugančio A. gambiae pateles nuo P. falciparum infekcijos, ekspresiją. 13, mirtiniausio žmonių maliarijos parazito, sukeliamos sveikatos išlaidos. Atsižvelgdami į MISO svarbą Anopheles reprodukciniam tinkamumui maliarijos endeminėse vietovėse, nusprendėme nustatyti, kuris hormonas – 3D20E ar 20E – sukelia šio geno ekspresiją. Nustatėme, kad nors 20E injekcija specifiškai arba stipriau indukavo kai kuriuos branduolinius hormonų receptorius (HR), tokius kaip HR3 ir HR4, ir tipinius steroidų taikinius, tokius kaip yologeniniai genai Vg14, 15, 16, MISO stipriau indukavo 3D20E (išplėstiniai duomenys, 3 pav.). Taigi, atrodo, kad lytinis šio androgeninio steroidinio hormono perdavimas sukelia mechanizmus, kurie apsaugo pateles nuo parazitinės infekcijos keliamų išlaidų. Be to, 3D20E skirtingai veikia abi izoformas. E receptorius EcR, indukuojantis EcR-A ir slopinantis EcR-B, ir dar stipriau suaktyvinantis kitus poravimąsi skatinančius genus, įskaitant HPX15, kuris veikia patelių vaisingumą. Tai galėtų paaiškinti reikšmingą nevaisingumą, pastebėtą patelėms, poruojamoms su EPP nutildytais patinais (išplėstiniai duomenys, 3 pav.). Šie duomenys rodo, kad egzistuoja tolesni keliai, kuriuos pirmiausia aktyvuoja du ekdizono hormonai, kurie gali būti lyčiai būdingos funkcijos pagrindas.
Toliau išbandėme dviejų EcK genų, identifikuotų mūsų bioinformatikos tyrimų cikle, funkciją. EcK1 arba EcK2 nutildymas lėmė didelį patinų mirtingumą (išplėstiniai duomenys, 4a pav.), o tai rodo, kad ekdizono fosforilinimas ir tokiu būdu inaktyvavimas yra svarbūs išgyvenimui. Kadangi EcK2 buvo ekspresuojamas didesniu lygiu nei EcK1 ir buvo aptiktas MAG proteomika (2b, c pav. ir 2 papildoma lentelė), patvirtinome jo ekdisteroidų kinazės aktyvumą inkubuodami jį su 20E, dėl ko buvo fosforilintas 20E22P (išplėstiniai duomenys, 2 pav.). 4b). Naudojant 3D20E kaip substratą, negalėjome aptikti fosforilinto produkto 3D20E22P (išplėstiniai duomenys, 4c pav.), o tai rodo, kad 20E, o ne 3D20E gali būti pageidaujamas EcK2 taikinys.
Remiantis mūsų atlikta RNR sekoskaitos analize, EcK2 taip pat buvo labai ekspresuojamas nekaltybių patelių apatinėje kūno dalyje (LRT), kur jis išsijungė po poravimosi (2b pav.). Mes patvirtinome šiuos duomenis ir nustatėme, kad EcK2 ekspresijai įtakos neturėjo kraujo davimas (išplėstiniai duomenys, 5a pav.). Išplėsdami pradinius MS eksperimentus, nustatėme, kad 20E22P pikas buvo glaudžiai susijęs su 20E piku (22–26 val. po kraujo davimo; išplėstiniai duomenys, 5b pav.). EcK2 nutildymas nekaltybės patelėms lėmė 3 kartus padidėjusį santykinį 20E ir 20E22P santykį praėjus 26 val. po kraujo davimo (išplėstiniai duomenys, 2c ir 5c pav.), patvirtinantį, kad EcK2 taip pat fosforilina 20E patelių organizme. Pažymėtina, kad nekaltybės patelės, kurioms sumažėjo EcK2, išlaikė visišką lytinį imlumą (išplėstiniai duomenys, 5d,e pav.), o tai dar labiau rodo, kad patelių 20E gamyba nesukelia poravimosi atsparumo periodams. Tačiau šių patelių reikšmingai padidėjo kiaušinėlių dėjimo rodikliai, palyginti su kontrolinėmis grupėmis, kai daugiau nei 30 % mergelių deda kiaušinėlius (išplėstiniai duomenys, 5f pav.). Jei dvigrandės Eck2 RNR (dsEcK2) injekcijos buvo atliktos po kraujo šėrimo, nerštas neįvyko, o tuo metu 20E pikas dėl kraujo nurijimo sumažėjo. Apskritai šie rezultatai patvirtina modelį, kad po kraujo čiulpimo pagamintas 20E gali sukelti nerštą, bet tik tada, kai neršto blokavimas (EcK2 ir galbūt kiti veiksniai) išjungiamas poravimusi. Nei 20E, nei 3D20E injekcijos neslopino EcK2 ekspresijos mergelėms (išplėstiniai duomenys, 5g pav.), o tai rodo, kad šios kinazės slopinimą tarpininkauja kiti veiksniai. Tačiau 20E lygis po kraujo šėrimo nebuvo pakankamas, kad sukeltų poravimosi diskomfortą, bet jį veiksmingai sukėlė dideli lytiniu būdu perneštų 3D20E titrai.
Mūsų rezultatai suteikia svarbių įžvalgų apie mechanizmus, reguliuojančius A. gambiae reprodukcinę sėkmę. Sukurtas modelis, kuriame patinai evoliucionavo sintetindami didelius 3D20E titrus – patinams būdingą modifikuotą ekdizoną, kuris užtikrina tėvystę, desensibilizuodamas pateles tolesniam poravimuisi. Tuo pačiu metu šie maliarijos vektoriai taip pat sukūrė efektyvią sistemą, skirtą aktyvuoti 3D20E patelių organizme, reaguojant į patinams būdingo EPP lytinį perdavimą. Mūsų žiniomis, tai pirmasis pavyzdys, kai patinų ir patelių dominuojama steroidinių hormonų sistema atlieka unikalią ir svarbią funkciją vabzdžiams. Patinams būdinga ekdizono funkcija buvo postuluojama, bet nėra galutinai įrodyta. Pavyzdžiui, iš esmės paneigta hipotezė18 yra ta, kad šias funkcijas gali atlikti 20E pirmtakas E1. Gerai žinoma, kad Drosophila monandrija sužadinama lytiniu mažų lytinių peptidų19,20, kurie sąveikauja su neuronais, inervuojančiais moters reprodukcinį traktą, per specifinius lytinių peptidų receptorius21,22, perdavimu. Reikia atlikti tolesnius darbus, kad būtų galima nustatyti signalizacijos kaskadas, kurias kontroliuoja 3D20E A. gambiae patelėse ir nustatyti, ar šias kaskadas galima išsaugoti tarp uodų ir Drosophila.
Atsižvelgiant į svarbų 3D20E vaidmenį patelių vaisingumui ir elgesiui, nustatytą mūsų tyrime, keliai, vedantys į 3D20E sintezę ir aktyvaciją, atveria naujų galimybių būsimoms uodų kontrolės strategijoms, tokioms kaip konkurencingų sterilių patinų generavimas sterilių vabzdžių technologijų strategijose, naudojamos laisvam paleidimui į laisvę arba 3D20E imitavimui nekaltybės žaidimuose. Patinams būdinga 3D20E funkcija galėjo išsivystyti, kai A. gambiae ir kitos Cellia rūšys įgijo gebėjimą koaguliuoti savo spermą į poravimosi kamščius, nes tai leidžia efektyviai perduoti didelį kiekį hormonų ir hormonus aktyvuojančių fermentų. Savo ruožtu 3D20E evoliucija, įgyvendinanti monandriją, suteikia patelėms mechanizmą (per didelę MISO ekspresiją), skatinantį jų reprodukcinį tinkamumą didelės maliarijos paplitimo vietovėse, o tai netiesiogiai prisideda prie Plasmodium perdavimo. Atsižvelgiant į tai, kad įrodyta, jog patelių 20E daro didelį poveikį P. falciparum išgyvenimui ir augimui Anopheles uodų patelėse,24 tiek vyriškų, tiek moteriškų steroidinių hormonų keliai dabar yra pagrindiniai uodų ir parazitų sąveikos aspektai.
A. gambiae G3 padermės buvo auginamos standartinėmis vabzdžių sąlygomis (26–28 °C, 65–80 % santykinė drėgmė, 12:12 val. šviesos/tamsos fotoperiodas). Lervos buvo šeriamos miltelių pavidalo žuvų lesalu („TetraMin Tropical Flakes“, „Koi Pellets“ ir „Tetra Pond Sticks“ santykiu 7:7:2). Suaugę uodai buvo šeriami neribotą laiką 10 % dekstrozės tirpalu ir kas savaitę žmogaus krauju (tiriamas kraujo komponentas). Neapdoroti uodai buvo gauti atskiriant lytis lėliukės stadijoje, ištyrus galus mikroskopu. Patinai, turintys DsRed transgeną, jau buvo aprašyti anksčiau.
Priverstinio poravimosi eksperimentai buvo atlikti pagal anksčiau aprašytus protokolus. Natūralaus poravimosi metu 4 dienų amžiaus nekaltybės patelės dvi naktis buvo laikomos santykiu 1:3 su lytiškai subrendusiais nekaltybės patinais. Eksperimentuose, kuriuose patinams buvo suleista dsEPP, laikymas narveliuose sutapo su 3–4 dienomis po injekcijos, kai fosfatazės aktyvumas buvo maksimaliai nuslopintas (išplėstiniai duomenys, 2b pav.).
Uodų audiniai, likę lavonai (likusi kūno dalis) arba visas kūnas buvo išpreparuoti 100 % metanolyje ir homogenizuoti granuliatoriumi (2 mm stiklo karoliukai, 2400 aps./min., 90 sek.). Audinių kiekiai ir metanolio tūriai buvo tokie: likusi kūno dalis – 50 1000 µl; MAG – 50–100 80 µl; patelių LRT – 25–50 80 µl. Nuosėdos buvo antrą kartą ekstrahuotos metanoliu tokiu pačiu metanolio tūriu. Ląstelių nuosėdos buvo pašalintos centrifuguojant. Abiejų ekstrakcijų metanolis buvo sujungtas ir džiovintas azoto sraute, o tada resuspenduotas tokiuose 80 % metanolio vandens tūriuose: likusi kūno dalis – 50 µl; MAG ir patelių LRT – 30 µl.
Mėginiai buvo analizuojami masių spektrometru (ID-X, „Thermo Fisher“), prijungtu prie LC prietaiso (Vanquish, „Thermo Fisher“). 5 µl mėginio buvo įšvirkšta į 3 µm, 100 × 4,6 mm kolonėlę (Inspire C8, „Dikma“), palaikomą 25 °C temperatūroje. Mobiliosios LC fazės buvo A (vanduo, 0,1 % skruzdžių rūgštis) ir B (acetonitrilas, 0,1 % skruzdžių rūgštis). LC gradientas buvo toks: 5 % B 1 minutę, tada padidintas iki 100 % B per 11 minučių. Po 8 minučių esant 100 %, kolonėlė vėl balansuojama 5 % B temperatūroje 4 minutes. Srauto greitis buvo 0,3 ml min-1. Jonizacija MS šaltinyje atliekama kaitinama elektropurškimo jonizacija teigiamu ir neigiamu režimais.
Masių spektrometras matuoja duomenis m/z diapazone nuo 350 iki 680, esant 60 000 skiriamajai gebai, pilnos MS režimu. MS/MS duomenys buvo gauti [M + H]+ (visi taikiniai), [M - H2O + H]+ (visi taikiniai) ir [M - H]- (fosforilinti taikiniai). MS/MS duomenys buvo panaudoti taikinių, kuriems nebuvo standarto, ekdizono savybėms patvirtinti. Siekiant nustatyti netikslinius ekdisteroidus, buvo analizuojami visų HPLC pikų, kurių santykinis gausumas >15 %, MS/MS duomenys. Kiekybiškai įvertinkite naudodami standartines kreives, sukurtas iš grynų standartų (20E, 3D20E), kad apskaičiuotumėte absoliučius vieno konkretaus mėginio (visų kitų taikinių) kiekius arba skiedinius, kad apskaičiuotumėte jų ekvivalentiškumą vienam vyrui nustatytiems kiekiams. 3D20E atveju kiekybinis įvertinimas buvo atliktas naudojant šių aduktų sumą: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-. Duomenys buvo išskirti ir kiekybiškai įvertintas naudojant „Tracefinder“ (4.1 versija). MS/MS duomenys buvo analizuojami naudojant „Xcalibur“ (4.4 versija). E, 20E ir 3D20E MS spektrai buvo palyginti su atitinkamais standartais. 3D20E22P buvo analizuojamas derivatizacijos būdu naudojant Girardo reagentą. 20E22P buvo analizuojamas pagal m/z santykį.
3D20E22P buvo išgrynintas iš MAG. Gryninimas buvo atliktas analitiniu mastu, naudojant itin efektyvų skysčių chromatografą („Acquity“, „Waters“) su kvadrupolio masės pagrindu veikiančiu detektoriumi („QDa“, „Acquity“, „Waters“), tomis pačiomis LC sąlygomis kaip ir atliekant HPLC-MS/MS analizę. Frakcijos buvo pradėtos rinkti, kai tuo pačiu sulaikymo laiku, kaip ir anksčiau nustatytas, buvo aptiktas 3D20E22P atitinkantis m/z. Ekstrahuotų junginių grynumas buvo patikrintas HPLC-MS/MS, kaip aprašyta aukščiau.
Bendra RNR buvo išskirta iš 10–12 reprodukcinių audinių arba kitų kūno dalių (be galvų), naudojant TRI reagentą („Thermo Fisher“), laikantis gamintojo instrukcijų. RNR buvo apdorota TURBO DNRaze („Thermo Fisher“). kDNR buvo susintetinta naudojant Moloney pelių leukemijos viruso atvirkštinę transkriptazę (M-MLV RT; „Thermo Fisher“), laikantis gamintojo instrukcijų. Pradmenys atvirkštinės transkripcijos kiekybinei PGR (RT-qPCR; išplėstinė duomenų lentelė 2) buvo anksčiau paskelbti24 arba sukurti naudojant Primer-BLAST26, pirmenybę teikiant 70–150 bp dydžio produktams, apimantiems egzonų-egzonų jungtis arba pradmenų porų pradmenims, atskiriantiems egzonus. kDNR mėginiai iš trijų ar keturių biologinių pakartojimų buvo keturis kartus praskiesti vandenyje RT-qPCR. Kiekybinis įvertinimas buvo atliktas 15 µl pakartojimų reakcijose, kuriose buvo 1× „PowerUp SYBR Green Master Mix“ („Thermo Fisher“), pradmenys ir 5 µl praskiestos kDNR. Reakcijos buvo vykdomos naudojant „QuantStudio 6 Pro“ realaus laiko PGR sistemą („Thermo Fisher“), o duomenys buvo surinkti ir... analizuota naudojant „Design and Analysis“ (2.4.3 versija). Kaip parodyta šiame tyrime, santykiniai kiekiai buvo normalizuoti pagal ribosominį geną RpL19 (AGAP004422), kurio raiška reikšmingai nepakito maitinantis krauju27 ar poruojantis3.
RNR kokybė buvo patikrinta naudojant „Agilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer“ („Agilent“). „Illumina“ porinių galų bibliotekos buvo paruoštos ir paleistos MIT ir Harvardo Broad institute. Sekvenavimo nuskaitymai buvo suderinti su A. gambiae genomu (PEST padermė, 4.12 versija) naudojant HISAT2 (2.0.5 versija) su numatytaisiais parametrais. Nuskaitymai, kurių atvaizdavimo kokybės (MAPQ) balai buvo <30, buvo pašalinti naudojant „Samtools“ (1.3.1 versija). Su genais susietų nuskaitymų skaičius buvo suskaičiuotas naudojant htseq-count (0.9.1 versija) su numatytaisiais parametrais. Normalizuoti nuskaitymų skaičiai buvo apskaičiuoti ir diferencinė genų raiška analizuota naudojant DESeq2 paketą (1.28.1 versija) R (4.0.3 versija).
Ekdizoną modifikuojančių genų kandidatai buvo identifikuoti pirmiausia ieškant A. gambiae genomo naudojant PSI-BLAST algoritmą (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/), naudojant numatytąsias parametrų vertes su šiomis užklausos baltymų sekomis: iš Bombyx mori (prisijungimo Nr. NP_001038956.1), Musca domestica (prisijungimo Nr. XP_005182020.1, XP_005175332.1 ir XP_011294434.1) ir Microplitis demolitor (prisijungimo Nr. XP_008552646.1 ir XP_008552645.1); EcK iš B. mori (prisijungimo Nr. NP_001036900), Drosophila melanogaster (prisijungimo Nr. NP_651202), Apis mellifera (prisijungimo Nr. XP_394838) ir Acyrthosiphon pisum (prisijungimo Nr. XP_001947166); ir EPP iš B. mori (prisijungimo Nr. XP_001947166) NP_001177919.1 ir NP_001243996.1) ir EO iš D. melanogaster (prisijungimo Nr. NP_572986.1) (1 žingsnis). Toliau filtruokite atitikmenis pagal didelę mRNR raišką (>100 fragmentų / kilobazių egzonų milijonui suderintų skaitymų (FPKM) arba >85 %) reprodukciniame audinyje (patelių LRT arba MAG) Gambijoje (2 žingsnis). Siekdami pagerinti specifiškumą, pasirinkome kandidatų fermentus, kurie taip pat ekspresuojami A. albimanus, anopheles rūšies, kuri poravimosi metu nesintezuoja ir neperduoda ekdizono, reprodukciniame audinyje. Kandidatų genai buvo filtruojami pagal žemą ekspresiją (<100 FPKM arba <85 procentilė) A. albimanus reprodukciniame audinyje (3 žingsnis). Kaip galutinis filtras (4 žingsnis), kandidatų genai turi atitikti bent vieną iš šių kriterijų: (1) reikšmingai padidėję po poravimosi (P < 0,05), remiantis skirtingai ekspresuojamų genų analize, ir (2) nereprodukciniuose audiniuose (< 85 % arba <100 FPKM).
Anksčiau aprašytus metodus 28, 29, 30 modifikavome, kad pasiektume viso organizmo izotopinį žymėjimą. Trumpai tariant, laukinio tipo Saccharomyces cerevisiae II tipo (YSC2, „Sigma“) buvo išbandytas mielių azoto bazėje (BD Difco, DF0335), kurioje buvo (svorio/tūrio) 2 % gliukozės (G7528, „Sigma“), 1,7 % aminorūgščių neturinčios kultūros terpės) ir 5 % 15N amonio sulfato (NLM-713, >99 %, „Cambridge Isotope Laboratories“) kaip vienintelis azoto šaltinis. Mielės buvo išskirtos centrifuguojant, o uodų lervos buvo šeriamos neribotai iki lėliukės išsiritimo. Papildyta žuvų miltais (0,5 mg 300 lervų), siekiant išvengti ketvirtojo stadijos mirtingumo. Poravimosi eksperimentuose buvo naudojamos tik patelės su nežymėtais patinais, siekiant analizuoti poravimosi metu perneštą patinų proteomą.
4–6 dienų amžiaus 15N žymėtomis nekaltomis patelėmis buvo priverstos poruotis su atitinkamo amžiaus nežymėtais nekaltomis patinais. Sėkmingas poravimasis buvo patvirtintas aptinkant poravimosi kamščius epifluorescencinės mikroskopijos būdu. 3, 12 ir 24 val./min. 45–55 suporuotų patelių prieširdžiai buvo išpreparuoti į 50 µl amonio bikarbonato buferio (pH 7,8) ir homogenizuoti piesta. Homogenatas buvo centrifuguotas, o supernatantas sumaišytas su 50 µl 0,1 % RapiGest (186001860, Waters) 50 mM amonio bikarbonato tirpale. Kiekvieno mėginio supernatantas ir granulės buvo užšaldytos ant sauso ledo ir per naktį išsiųsti į Vašingtono universiteto MacCoss laboratoriją, kur buvo baigtas mėginio paruošimas LC-MS/MS. Granulės buvo resuspenduotos 50 µl 0,1 % RapiGest 50 mM amonio bikarbonato tirpale ir sonikuotos vandens vonelėje. Granulių ir supernatanto baltymų koncentracija buvo matuojama BCA. Atliekant tyrimą, mėginiai buvo redukuoti 5 mM ditiotreitoliu (DTT; „Sigma“), alkilinti 15 mM jodoacetamidu (Sigma) ir inkubuoti 37 °C temperatūroje (1:0 50) 1 valandą tripsinu: tripsino ir substrato santykiu). „RapiGest“ buvo lizuojamas pridedant 200 mM HCl, po to inkubuojamas 37 °C temperatūroje 45 minutes ir centrifuguojamas 14 000 aps./min. greičiu 10 minučių 4 °C temperatūroje, kad būtų pašalintos šiukšlės. Mėginiai buvo plaunami dvigubo režimo kietosios fazės ekstrakcija („Oasis MCX“ kasetės, „Waters“) ir resuspenduojami 0,1 % skruzdžių rūgštyje, kad galutinė baltymų koncentracija būtų 0,33 µg µl-1. Nežymėti MAG proteomai buvo panašiai analizuojami iš nekaltų patinų. Kiekvienam mėginiui buvo analizuojami du analitiniai pakartojimai. Tada po 1 µg kiekvieno buvo analizuojamas naudojant 25 cm lydyto silicio dioksido 75 μm kolonėlę su 4 cm lydyto silicio dioksido 75 μm kolonėle su Silikagelio „Kasil1“ (PQ) frito gaudyklė, pripildyta „Jupiter C12“ atvirkštinės fazės derva („Phenomenex“), ir 180 minučių skysčių chromatografija. Mėginių skaidymas – MS/MS buvo atlikta Q-Exactive HF masių spektrometru („Thermo Fisher“) su nanoACQUITY UPLC sistema („Waters“). Kiekvienam tyrimui gauti duomenys buvo konvertuoti į mzML formatą naudojant „Proteowizard“ (3.0.20287 versija) ir „Comet31“ (3.2 versija) FASTA duomenų bazėje, kurioje yra baltymų sekos iš „Anopheles gambiae“ (VectorBase 54 versija), „Anopheles coluzzi“. Paieška buvo atlikta Mali-NIH (VectorBase 54 versija), „Saccharomyces cerevisiae“ (Uniprot, 2021 m. kovas), „A. gambiae“ RNR sekoskaitos ir žinomų žmogaus teršalų trijų kadrų transliacijose. Peptidų žemėlapiuose sutapę FDR buvo nustatyti naudojant „Percolator32“ (3.05 versija) su 0,01 slenksčiu, o peptidai buvo surinkti į baltymų identifikatorius naudojant baltymų parsimonija programoje „Limelight33“ (2.2.0 versija). Santykinis baltymų gausumas. buvo įvertintas naudojant normalizuotą spektrinio gausumo koeficientą (NSAF), apskaičiuotą kiekvienam baltymui kiekviename bandyme, kaip aprašyta anksčiau. Kiekvieno baltymo NSAF buvo vidurkintas tarp mėginių iš dviejų skirtingų biologinių pakartojimų.15N žymėjimas sėkmingai užmaskavo moteriškąją proteomą, nors iš paženklintų nekaltybių buvo galima aptikti nedidelį kiekį nežymėtų baltymų. Patinų baltymų redukcijos aptikimą (1-5 spektrai) neapdorotuose patelių mėginiuose užfiksavome tik techniniuose bandymuose, kai neapdoroti mėginiai buvo tiriami po patinų/poravimosi mėginių dėl HPLC „perkėlimo“. Retkarčiais paženklintų nekaltybių „teršaluose“ randami baltymai išvardyti 1 papildomoje lentelėje.
Du antigeniniai peptidai – QTTDRVAPAPDQQQ (PA izotipo ribose) ir MESDGTTPSGDSEQ (PA ir PB izotipo ribose) „Genscript“ aplinkoje. Du peptidai buvo sujungti, tada konjuguoti su nešiklio baltymu KLH ir suleisti į Naujosios Zelandijos triušius. Triušiai buvo numarinti po ketvirtos injekcijos, o bendras IgG buvo išskirtas afininio gryninimo būdu. Tolesniam Western blotavimui buvo naudojamas labiausiai EPP specifiškai priklausančio triušio IgG.
Vakarų blotams MAG (n = 10, kur n reiškia biologiškai nepriklausomų uodų mėginių skaičių) ir patelių LRT (n = 30) iš 4 dienų amžiaus nekaltų patinų ir nekaltų arba priverstinai sukergtų patelių (<10 po poravimosi), baltymų ekstrakcijos buferis (50 mM Tris, pH 8,0; 1 % NP-40; 0,25 % natrio deoksicholato; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1× proteazės inhibitorių kokteilis (Roche)) buvo pridėtas atskirai. Mėginiai buvo homogenizuoti iš karto po išpjaustymo granuliatoriumi (2 mm stiklo karoliukai, 2400 aps./min., 90 sek.). Netirpios šiukšlės buvo pašalintos centrifuguojant 20 000 g greičiu 4 °C temperatūroje. Baltymai buvo kiekybiškai įvertinti Bradfordo metodu (Bio-Rad). Tada 20 µg MAG baltymo, 40 µg LRT baltymo ir 20 µg likusio baltymo buvo denatūruoti ir atskirti 10 % Bis-Tris. NuPAGE naudojant MOPS buferį. Baltymai buvo perkelti į polivinilidenfluorido membranas naudojant „iBlot2“ perkėlimo sistemą („Thermo Fisher“). Membranos buvo du kartus plaunamos 1× PBS-T (0,1 % Tween-20 PBS tirpale) ir blokuojamos „Odyssey“ blokavimo buferyje (Li-Cor) 1 valandą 22 °C temperatūroje. Membranos buvo kratomos per naktį 4 °C temperatūroje su individualiai parinktu triušio anti-EPP polikloniniu pirminiu antikūnu (1:700 blokavimo buferyje) ir žiurkės anti-aktino monokloniniu pirminiu antikūnu MAC237 („Abeam“; 1:4000). Membranos buvo plaunamos PBS-T ir inkubuojamos su antriniais antikūnais (asilo anti-triušio 800CW ir ožkos anti-žiurkės 680LT (Li-Cor), abu 1:20 000) blokavimo buferyje, kuriame yra 0,01 % SDS ir 0,2 % Tween-20, 1 valandą 22 °C temperatūroje. Membranos buvo plaunamos PBS-T ir vaizduojamos naudojant „Odyssey CLx“. skaitytuvu. Vaizdai buvo surinkti ir apdoroti naudojant „Image Studio“ (5.2 versija). Specifinė juosta, atitinkanti EPP-RA izoformą (82 kDa), nebuvo aptikta.
EPP (kaip izoforma AGAP002463-RB, turinti histidino fosfatazės domeną, NCBI konservuoto domeno paieška 34) ir EcK2 (AGAP002181) koduojantys regionai buvo klonuoti į pET-21a(+) plazmidę („Novagen Millipore Sigma“); pradmenys išvardyti 2 išplėstinėje duomenų lentelėje. Prieš pET-21a(+)-EcK2 konstrukto C-galo 6xHis žymę buvo įterpti aštuoni GS4 jungikliai (tandeme). Rekombinantiniai baltymai buvo gauti naudojant NEBExpress beląstelinę E. coli baltymų sintezės reakciją („New England BioLabs“). Rekombinantiniai baltymai buvo išgryninti naudojant NEBExpress Ni centrifugines kolonėles („New England BioLabs“). Dihidrofolato reduktazės (DHFR) kontrolinis baltymas buvo gautas naudojant DNR šabloną iš NEBExpress beląstelinio E. coli baltymų sintezės rinkinio. Baltymai buvo laikomi 50 % glicerolyje PBS tirpale -20 °C temperatūroje iki 3 mėnesių.
EPP ir audinių ekstraktų fosfatazės aktyvumas buvo matuojamas naudojant 4-nitrofenilfosfatą (pNPP; „Sigma-Aldrich“). Reakcijos buferyje buvo 25 mM Tris, 50 mM acto rūgšties, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA ir 1 mM DTT. Audinys buvo homogenizuotas reakcijos buferyje, o ląstelių nuosėdos pašalintos centrifuguojant. Reakcija inicijuota į reakcijos buferį, kuriame yra 2,5 mg ml-1 pNPP, įpilant fermento arba audinių ekstrakto. Reakcijos mišinys buvo inkubuojamas kambario temperatūroje tamsoje, o iš pNPP konvertuoto pNP kiekis buvo kiekybiškai įvertintas matuojant absorbciją esant 405 nm įvairiu laiku.
EcK aktyvumui in vitro nustatyti baltymas buvo inkubuojamas su 0,2 mg 20E arba 3D20E 200 µl buferyje (pH 7,5), kuriame yra 10 mM HEPES-NaOH, 0,1 % BSA, 2 mM ATP ir 10 mM MgCl2, 2 val. 27 °C temperatūroje. Reakcija buvo sustabdyta pridedant 800 µl metanolio, po to 1 valandą atvėsinta -20 °C temperatūroje, o tada centrifuguota 20 000 g greičiu 10 minučių 4 °C temperatūroje. Viršslanis buvo analizuojamas HPLC-MS/MS metodu. Kontrolinėje grupėje naudoti baltymai buvo inaktyvuojami karščiu, todėl jie buvo inkubuojami 50 % glicerolyje PBS tirpale 20 min. 95 °C temperatūroje.
EPP aktyvumui in vitro nustatyti baltymas buvo inkubuojamas su 3D20E22P (atitinkančiu kiekį, esantį 18 MAG porų, išgrynintų HPLC-MS/MS metodu) 100 µl buferyje (pH 7,5), kuriame yra 25 mM Tris, 50 mM acto rūgšties, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA ir 1 mM DTT, 3 valandas 27 °C temperatūroje. Reakcija buvo sustabdyta pridedant 400 µl metanolio ir 1 valandą atvėsinta -20 °C temperatūroje, po to 10 minučių centrifuguota 20 000 g greičiu 4 °C temperatūroje. Supernatantas buvo analizuojamas HPLC-MS/MS metodu.
Iš mišrios lyties begalvių uodų lavonų paruoštos kDNR buvo amplifikuoti EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp) ir EcK2 (556 bp) PGR fragmentai. Kontrolinio eGFP PGR fragmentas (495 bp) buvo amplifikuotas iš anksčiau aprašyto pCR2.1-eGFP; PGR pradmenys išvardyti 2 išplėstinėje duomenų lentelėje. PGR fragmentas buvo įterptas tarp invertuotų T7 promotorių pL4440 plazmidėje. Plazmidės konstruktai buvo gauti iš NEB 5-α kompetentingos E. coli (New England Biolabs) ir prieš naudojimą patikrinti DNR sekos nustatymu (įterpimo seką žr. 1 papildomuose duomenyse). Įterpimui iš pL4440 pagrindu sukurtos plazmidės amplifikuoti buvo naudojami pradmenys, atitinkantys T7 promotorių (2 išplėstinių duomenų lentelė). PGR produkto dydis buvo patvirtintas agarozės gelio elektroforeze. dsRNR buvo transkribuota iš PGR šablonų naudojant „Megascript T7 Transcription Kit“ („Thermo Fisher“) ir išgryninta pagal gamintojo instrukcijas su anksčiau aprašytais pakeitimais.
dsRNR injekcijai į suaugusių patinų arba patelių (Nanoject III, Drummond) krūtinės ląstą per 1 dieną po užsidarymo buvo suleista 1380 ng dsRNR (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP), kurios koncentracija buvo 10 ng nl-1. Genų slopinimo lygiai buvo nustatyti bent trijuose biologiniuose pakartojimuose, naudojant RNR ekstrakciją, kDNR sintezę ir RT-kPGR. Ekdizono injekcijai 4 dienų arba 6 dienų amžiaus krauju maitinamoms patelėms buvo suleista 0,13, 0,21 arba 0,63 µg 20E arba 3D20E (Nanoject III, Drummond), kurių koncentracijos buvo atitinkamai 1,3, 2,1, priklausomai nuo eksperimento plano, arba 6,3 ng nl-1. Sušvirkšta 100 nl 10 % (tūrio/tūrio) etanolio vandenyje; 100 nl 3D20E22P 10 % etanolyje (atitinka 75 % kiekio, esančio MAG poroje). Uodai buvo atsitiktinai priskirti injekcijų grupei.
Neršto tyrimams 3 dienų patelės buvo šeriamos neribotą laiką žmogaus krauju. Pašalinkite dalinai pamaitintus arba nemaitintus uodus. Priklausomai nuo apdorojimo, patelės buvo dedamos į atskirus neršto indelius keturioms naktims, praėjus mažiausiai 48 valandoms po kraujo davimo. Ikrai buvo skaičiuojami stereoskopu („Stemi 508“, „Zeiss“); susiporavusioms patelėms lervos buvo laikomos vaisingomis.
Poravimosi bandymams patelėms buvo leista bent 2 dienas, priklausomai nuo gydymo, išsivystyti atsparumą poravimuisi, o vėliau į tą patį narvelį buvo perkelti atitinkamo amžiaus laukinio tipo patinai. Po dviejų naktų apvaisintos patelių pūslelės buvo išpreparuotos, o genominė DNR buvo išskirta užšaldant-atšildant ir ultragarsu sonikuojant buferyje, kuriame yra 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA ir 25 mM NaCl (pH 8,2). Mėginiai buvo inkubuojami su proteinaze K (0,86 µg µl-1) 15 minučių 55 °C temperatūroje, po to 10 minučių 95 °C temperatūroje. Neapdoroti genominės DNR preparatai buvo praskiesti 10 kartų ir atlikti Y chromosomų sekų aptikimo qPCR metodu; pradmenys išvardyti 2 išplėstinėje duomenų lentelėje. Y chromosomos sekos nebuvimas rodo, kad poravimasis neįvyko.
Pakartotinio poravimosi tyrimams priverstinai sukryžmintos patelės buvo tiriamos dėl poravimosi kamščių buvimo, siekiant patvirtinti poravimosi būseną, ir joms buvo leista 2 dienas išsivystyti atsparumui poravimuisi be patinų, kaip aprašyta anksčiau36. Patinai, turintys DsRed transgeninę spermą, buvo įdėti į patelių narvus. Po dviejų naktų apvaisinimo pūslelės buvo išpjaustytos iš patelių, genominė DNR buvo paruošta, kaip aprašyta aukščiau, ir atlikta DsRed transgeno aptikimas qPCR metodu; pradmenys išvardyti 2 išplėstinėje duomenų lentelėje. DsRed transgeno nebuvimas rodė, kad pakartotinio poravimosi nebuvo.
3D20E buvo susintetintas, kaip aprašyta anksčiau 37. Trumpai tariant, 10 mg 20E (Sigma-Aldrich) buvo ištirpinta 10 ml vandens, po to pridėta 30 mg platinos juodojo (miltelių pavidalo, Sigma-Aldrich). Į reakcijos mišinį, maišomą kambario temperatūroje, nuolat burbuliavo silpna O2 srovė. Po 6 valandų reakcijai sustabdyti buvo įpilta 30 ml metanolio. Mišinys buvo centrifuguotas, kad būtų pašalintos katalizatoriaus dalelės. Viršslanis buvo išgarintas vakuume kambario temperatūroje. Išdžiovintas reakcijos produktas buvo ištirpintas 10 % etanolyje ir metanolyje injekcijoms HPLC-MS/MS analizei. Konversijos greitis (iš 20E į 3D20E) buvo maždaug 97 % (4b pav.), o susintetinto 3D20E MS spektras atitiko rastą poruotose patelėse (4c pav.).
Legendoje pateikiama konkreti atliktų statistinių testų informacija. Fišerio tiksliajam testui, Mantelio-Kokzo testui ir Stjudento t testui atlikti buvo naudojama programa „GraphPad“ (9.0 versija). Kochrano-Mantelio-Haenszelo testai buvo atlikti naudojant pasirinktinį R skriptą (pasiekiamas adresu https://github.com/duopeng/mantelhaen.test). Duomenų pasiskirstymo normalumas buvo patikrintas naudojant Šapiro-Vilko testą su 0,05 reikšmingumo riba. Kai duomenys neatitiko normalumo testo, buvo atliktas Manno-Vitnio testas. Išgyvenamumo duomenys buvo analizuojami naudojant Mantelio-Kokzo testą. RNR sekos genų lygmens diferencinės raiškos analizei atlikti buvo naudojamas DESeq2 paketas (1.28.1 versija). Horizontali juosta grafike rodo medianą. Visiems testams kaip riba buvo naudojama reikšmingumo vertė P = 0,05.
Daugiau informacijos apie tyrimo dizainą rasite su šiuo straipsniu susietoje „Nature Research Report“ santraukoje.
MS proteominiai duomenys buvo perduoti „ProteomeXchange“ konsorciumui (//proteomecentral.proteomexchange.org) per PRIDE partnerių saugyklą (//www.ebi.ac.uk/pride/) su duomenų rinkinio identifikatoriumi PXD032157.
RNR sekos duomenų rinkinys yra saugomas genų ekspresijos išsamioje bibliotekoje (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) pagal serijos įrašą GSE198665.
Papildomus duomenų rinkinius, sugeneruotus ir (arba) analizuotus šio tyrimo metu, galima gauti iš atitinkamų autorių, pateikus pagrįstą prašymą. Šiame straipsnyje pateikiami šaltinių duomenys.
De Loof, A. Ekdisteroidai: apleisti vabzdžių lytiniai steroidai? Vyras: Juodoji dėžė. Vabzdžių mokslas. 13, 325–338 (2006).
Redfern, CPF 20-hidroksiekdizonas ir kiaušidžių vystymasis Anopheles stephens. J. Insect Physiology. 28, 97–109 (1982).