Šiuo metu jūsų naršyklėje išjungtas „Javascript“. Kai kurios šios svetainės funkcijos neveiks, kai „Javascript“ bus išjungtas.
Užsiregistruokite nurodydami savo konkrečius duomenis ir konkretų jus dominantį vaistą, ir mes sulyginsime jūsų pateiktą informaciją su straipsniais mūsų plačioje duomenų bazėje ir nedelsdami atsiųsime jums PDF kopiją el. paštu.
„Ban-Lan-Gen“ granulės slopina dekstrano natrio sulfato sukeltą lėtinį recidyvuojantį kolitą pelėms, moduliuodamos žarnyno mikrobiotą ir atkurdamos žarnyno SCFA išvestinių GLP-1 gamybą.
Jiao Peng,1-3,*Li Xi,4,*Zheng Lin,3,5 Duan Lifang,1 Gao Zhengxian,2,5 Diehu,1 Li Jie,6 Li Xiaofeng,6 Shen Xiangchun,5 Xiao Haitao21Pekino universiteto Šendženo ligoninės Farmacijos katedra, Šendženas, Kinijos Liaudies Respublika; 2Šendženo universiteto Sveikatos mokslų centro Farmacijos mokykla, Šendženas, Kinijos Liaudies Respublika; 3Guidžou medicinos universiteto Etninės medicinos ir tradicinės kinų medicinos plėtros ir taikymo inžinerinių technologijų tyrimų centras, Švietimo ministerija, Guidžou provincijos pagrindinė farmacijos laboratorija, Guidžou medicinos universitetas, Guijangas, Kinijos Liaudies Respublika; 4 Gastroenterologijos katedra, Pekino universiteto Šendženo ligoninė, Šendženas, Kinijos Liaudies Respublika; 5Farmacijos mokykla, Guidžou medicinos universitetas, Valstybinė vaistinių augalų funkcijų ir taikymo laboratorija, Guijangas; 6 Pekino universiteto Šendženo ligoninės laboratorinės medicinos skyrius, Šendženas, Kinija [email protected] Shen Xiangchun, Farmacijos mokykla, Guidžou medicinos universitetas, Guidžou, Kinijos Liaudies Respublika, 550004, el. paštas [email protected] Tikslas: GLP-1 pagrįsta terapija yra nauja uždegiminės žarnyno ligos gydymo galimybė. Ban-Lan-Gen (BLG) granulės yra žinoma antivirusinė TCM formulė, pasižyminti potencialiu priešuždegiminiu aktyvumu gydant įvairias uždegimines ligas. Tačiau jos priešuždegiminis poveikis kolitui ir veikimo mechanizmas vis dar neaiškūs. METODAI: Nustatyti dekstrano natrio sulfato (DSS) sukeltą lėtinį recidyvuojantį kolitą pelėms. Buvo atlikti ligos aktyvumo indeksai, histologiniai pažeidimo žymenys ir uždegimą skatinančių citokinų kiekiai, siekiant įvertinti apsauginį BLG poveikį. BLG poveikis žarnyno mikrobiotai ir žarnynui buvo apibūdintas serumo GLP-1 kiekiais ir storosios žarnos Gcg, GPR41 ir GRP43 raiška, žarnyno mikrobiotos sudėtimi, išmatų trumpųjų grandinės riebalų rūgščių kiekiais ir GLP-1 išsiskyrimu iš pirminių pelių storosios žarnos epitelio ląstelių. Iš SCFA išskirto GLP-1 gamyba. Rezultatai: BLG gydymas reikšmingai sumažino kūno svorio kritimą, DAI, gaubtinės žarnos sutrumpėjimą, gaubtinės žarnos audinių pažeidimus ir uždegiminių citokinų TNF-α, IL-1β ir IL-6 kiekį gaubtinės žarnos audinyje. Be to, BLG gydymas gali reikšmingai atkurti gaubtinės žarnos Gcg, GPR41 ir GRP43 raišką bei GLP-1 kiekį serume kolito pelėms, padidindamas SCFA gaminančių bakterijų, tokių kaip Akkermansia ir Prevotellaceae_UCG-001, kiekį ir sumažindamas tokių bakterijų kaip Eubacterium_xylanophilum_group, Ruminococcaceae_UCG-014, Intestinimonas ir Oscillibacter, gausą. Be to, BLG gydymas gali reikšmingai padidinti SCFA kiekį kolito pelių išmatose. Tuo pačiu metu in vitro eksperimentai taip pat parodė, kad BLG gydytų pelių išmatų ekstraktas gali labai stimuliuoti pirmines mažas pelių gaubtinės žarnos epitelio ląsteles, išskiriančias GLP-1. Išvados: Šie duomenys rodo, kad BLG turi antikolitinį poveikį. BLG turi potencialo būti plėtojama kaip terapija, bent iš dalies moduliuojant žarnyno mikrobiotą ir atkuriant žarnyno trumpųjų grandinių riebalų rūgščių (SCFA) išskiriamą GLP-1 gamybą. Tai perspektyvūs vaistai nuo lėtinio recidyvuojančio kolito. Raktiniai žodžiai: kolitas, Ban-Lan-Gen granulės, žarnyno mikrobiota, trumpųjų grandinių riebalų rūgštys, GLP-1.
Opinis kolitas (OK) yra ilgalaikė uždegiminė gaubtinės ir tiesiosios žarnos liga, kuriai būdingas pasikartojantis viduriavimas, pilvo skausmas, svorio kritimas ir pūlingos išmatos su krauju.1 Pastaruoju metu OK paplitimas didėja anksčiau mažai sergamose šalyse, įskaitant Kiniją, dėl populiarėjančio vakarietiško gyvenimo būdo.2 Šis padidėjimas kelia didelių problemų visuomenės sveikatai ir turi rimtų pasekmių pacientų darbingumui ir gyvenimo kokybei. Pažymėtina, kad OK patogenezė išlieka iš esmės neaiški, tačiau visuotinai pripažįstama, kad genetika, aplinkos veiksniai, žarnyno mikrobiota ir imuninė sistema prisideda prie OK vystymosi.3 Net ir dabar nėra OK išgydoma, o gydymo tikslas yra kliniškai kontroliuoti klinikinius simptomus, sukelti ir palaikyti remisiją, skatinti gleivinės gijimą ir sumažinti recidyvus. Klasikiniai gydymo būdai apima aminosalicilatus, kortikosteroidus, imunosupresantus ir biologinius preparatus. Tačiau šie vaistai negali pasiekti norimo poveikio dėl įvairių šalutinių poveikių.4 Pastaruoju metu daugelis atvejų tyrimų parodė, kad tradicinė kinų medicina (TKM) parodė didelį potencialą padėti palengvinti OK simptomus mažai toksiškai, o tai rodo, kad vystymasis Nauji TCM gydymo metodai yra perspektyvi opinio kolito gydymo strategija.5-7
Banlangen granulės (BLG) yra tradicinės kinų medicinos preparatas, gaminamas iš Banlangen šaknų vandeninio ekstrakto.8 Be antivirusinio veiksmingumo, BLG pasižymi potencialiu priešuždegiminiu aktyvumu gydant įvairias uždegimines ligas.9,10 Be to, iš Radix isatidis vandeninių ekstraktų buvo išskirti ir identifikuoti gliukozinolatai (R,S-goitrinas, progoitrinas, epiprorubinas ir gliukozidas) ir nukleozidai (hipoksantinas, adenozinas, uridinas ir guanozinas) bei indigo alkaloidai, tokie kaip indigo ir indirubinas.11,12 Ankstesni tyrimai gerai dokumentavo, kad junginiai adenozinas, uridinas ir indirubinas pasižymi stipriu antikolitiniu poveikiu skirtinguose kolito gyvūnų modeliuose.13–17 Tačiau nebuvo atlikta jokių įrodymais pagrįstų tyrimų, skirtų BLG veiksmingumui kolito atveju įvertinti. Šiame tyrime nagrinėjome apsauginį BLG poveikį dekstrano natrio sulfato (DSS) sukeltam lėtiniam recidyvuojančiam kolitui C57BL/6 pelėms ir nustatėme, kad peroralinis BLG vartojimas reikšmingai... Susilpnintas DSS sukeltas lėtinis recidyvuojantis gaubtinės žarnos uždegimas pelėms. Uždegimas, jo reguliavimo mechanizmai yra susiję su žarnyno mikrobiotos moduliacija ir žarnyne gaminamo gliukagono tipo peptido-1 (GLP-1) gamybos atkūrimu.
BLG granulės (be cukraus, patvirtintos NMPA Z11020357; „Beijing Tongrentang Technology Development Co., Ltd.“, Pekinas, Kinija; partijos numeris: 20110966) buvo įsigytos iš vaistinių. DSS (molekulinė masė: 36 000–50 000 daltonų) buvo įsigyta iš „MP Biologicals“ (Santa Ana, JAV). Sulfasalazinas (SASP) (≥ 98 % grynumo), hematoksilinas ir eozinas buvo įsigyti iš „Sigma-Aldrich“ (Sent Luisas, Misūris, JAV). Pelių TNF-α, IL-1β ir IL-6 „luminex“ Elisa tyrimo rinkiniai buvo įsigyti iš „R&D systems“ (Mineapolis, Minesota, JAV). Acto rūgštis, propiono rūgštis ir sviesto rūgštis buvo įsigyta iš „Aladdin Industries“ (Šanchajus, Kinija). 2-etilsviesto rūgštis buvo įsigyta iš „Merck KGaA“ (Darmštatas, Vokietija).
6–8 savaičių amžiaus C57BL/6 pelių patinai (kūno svoris 18–22 g) buvo įsigyti iš „Beijing Wetahe Laboratory Animal Technology Co., Ltd.“ (Pekinas, Kinija) ir laikomi 22 ± 2 °C temperatūroje su 12 val. šviesos ir tamsos ciklu. Pelėms buvo duodamas standartinis graužikų pašaras su laisva prieiga prie geriamojo vandens vieną savaitę, kad jos priprastų prie naujos aplinkos. Tada pelės buvo atsitiktinai suskirstytos į keturias grupes: kontrolinę grupę, DSS modelio grupę, SASP gydytą grupę (200 mg/kg, per burną) ir BLG gydytą grupę (1 g/kg, per burną). Kaip parodyta 1A paveiksle, remiantis mūsų ankstesniu tyrimu, eksperimentinis lėtinis recidyvuojantis kolitas pelėms buvo sukeltas trimis 1,8 % DSS ciklais 5 dienas, po to distiliuotu vandeniu 7 dienas, remiantis mūsų ankstesniu tyrimu.18 SASP ir BLG gydytų grupių pelės buvo gydomos atitinkamai SASP ir BLG kiekvieną dieną, pradedant nuo 0 dienos. Remiantis preliminariais eksperimentais, BLG dozė buvo nustatyta 1 g/kg. Tuo tarpu SASP dozė, remiantis literatūra, buvo nustatyta ties 200 mg/kg.4 Kontrolinė ir DSS modelio grupės viso eksperimento metu gavo tokį patį vandens kiekį.
1 pav. BLG palengvina DSS sukeltą lėtinį recidyvuojantį kolitą pelėms. (A) Lėtinio pasikartojančio kolito ir gydymo eksperimentinis planas, (B) kūno svorio pokytis, (C) ligos aktyvumo indekso (DAI) balas, (D) gaubtinės žarnos ilgis, (E) reprezentatyvus gaubtinės žarnos vaizdas, (F) H&E dažymas gaubtinėje žarnoje (padidinimas, ×100) ir (G) histologinis balas. Duomenys pateikiami kaip vidurkis ± SEM (n = 6). ##p < 0,01 arba ###p < 0,001, palyginti su kontroline (Con) grupe; *p < 0,05 arba **p < 0,01 arba ***p < 0,001, palyginti su DSS grupe.
Kūno svoris, išmatų konsistencija ir kraujavimas iš tiesiosios žarnos buvo registruojami kasdien. Ligos aktyvumo indeksas (LAI) buvo nustatytas sujungiant kūno svorio, išmatų konsistencijos ir kraujavimo iš tiesiosios žarnos balus, kaip aprašyta anksčiau.19 Eksperimento pabaigoje visos pelės buvo užmigdytos, o kraujas, išmatos ir gaubtinė žarna surinkti tolesniems eksperimentams.
Storosios žarnos audinys buvo fiksuotas formalinu ir įterptas į parafiną. Padaryti 5 mikrono pjūviai, nudažyti hematoksilino eozinu (H&E), tada atlikti aklieji tyrimai ir įvertinti, kaip aprašyta anksčiau.19
Bendra storosios žarnos audinio RNR buvo išskirta naudojant „Trizol“ reagentą („Invitrogen“, Karlsbadas, Kalifornija), o po to atlikta kDNR ekstrakcija atvirkštine transkriptaze („TaKaRa“, Kusatsu, Šiga, Japonija). Kiekybinė PGR buvo atlikta naudojant realaus laiko PGR sistemą su SYBR Green Master („Roche“, Bazelis, Šveicarija). Tikslinių genų transkriptai buvo normalizuoti pagal β-aktiną, o duomenys analizuoti naudojant 2-ΔΔCT metodą. Genų pradmenų sekos pateiktos 1 lentelėje.
Pirminis pelių gaubtinės žarnos epitelio ląstelių išskyrimas ir kultivavimas buvo atliktas, kaip aprašyta anksčiau.20 Trumpai tariant, 6–8 savaičių amžiaus pelių gaubtinės žarnos pirmiausia buvo išpjautos po numarinimo atliekant kaklo išnirimą, po to išilgai atvertos, apdorotos Hanks subalansuotu druskos tirpalu (HBSS, be kalcio ir magnio) ir supjaustytos į 0,5–1 mm mažus gabalėlius. Vėliau audiniai buvo suvirškinti 0,4 mg/ml kolagenazės XI (Sigma, Poole, JK) laisvoje DMEM terpėje ir centrifuguoti 300 xg greičiu 5 minutes kambario temperatūroje. Nuosėdos buvo resuspenduotos DMEM terpėje (papildytos 10 % vaisiaus galvijų serumu, 100 vienetų/ml penicilino ir 100 µg/ml streptomicino) 37 °C temperatūroje ir perleistos per nailono tinklelį (porų dydis ~250 µm). Storosios žarnos epitelio ląstelių alikvotinės dalys buvo dedamos į stiklinius indus ir inkubuojamos su acto rūgštimi, propiono rūgštimi, sviesto rūgštimi ir pelių išmatų ekstraktais 2 valandas 37 °C temperatūroje, 5 %... CO2.
Storosios žarnos audinys buvo homogenizuotas PBS tirpalu, o citokinų IL-6, TNF-α ir IL-1β kiekiai storosios žarnos audinyje buvo nustatyti naudojant „luminex ELISA“ tyrimo rinkinius („R&D systems“, Mineapolis, MN, JAV). Taip pat GLP-1 kiekiai pirminių pelių storosios žarnos epitelio ląstelių serume ir kultūros terpėje buvo nustatyti naudojant ELISA rinkinį („Bioswamp“, Uhanas, Kinija) pagal gamintojo instrukcijas.
Bendra DNR iš išmatų buvo išskirta naudojant DNR ekstrakcijos rinkinį (Tiangen, Kinija). DNR kokybė ir kiekis buvo išmatuoti atitinkamai esant 260 nm / 280 nm ir 260 nm / 230 nm santykiams. Vėliau, naudojant kiekvieną išskirtą DNR kaip šabloną, specifiniai pradmenys 338F (ACTCCTACGGGAGGCAGCAG) ir 806R (GGACTACHVGGGTWTCTAAT) buvo panaudoti 16S rRNR geno V3-V4 regionams amplifikuoti skirtinguose regionuose. PGR produktai buvo išgryninti naudojant QIAquick gelio ekstrakcijos rinkinį (QIAGEN, Vokietija), kiekybiškai įvertinti realaus laiko PGR ir sekvenuoti naudojant „IlluminaMiseq PE300“ sekvenavimo platformą („Illumina Inc.“, Kalifornija, JAV). Bioinformatikos analizei duomenų apdorojimas buvo atliktas pagal anksčiau aprašytus protokolus.21,22 Trumpai tariant, naudokite „Cutadapt“ (V1.9.1), kad filtruotumėte neapdorotus ekspreso failus. OTU buvo grupuojami naudojant UPARSE (7.0.1001 versija). su 97 % panašumo riba, o UCHIME buvo naudojamas chimerinėms sekoms pašalinti. Bendruomenės sudėties analizė ir klasifikacija atlikta naudojant RDP klasifikatorių (http://rdp.cme.msu.edu/), pagrįstą SILVA ribosominės RNR genų duomenų baze.
Trumpųjų grandinių riebalų rūgščių (acto rūgšties, propiono rūgšties ir sviesto rūgšties) kiekis buvo matuojamas, kaip anksčiau aprašė Tao ir kt., su tam tikrais pakeitimais.23 Trumpai tariant, 100 mg išmatų pirmiausia buvo suspenduotos 0,4 ml dejonizuoto vandens, po to 0,1 ml 50 % sieros rūgšties ir 0,5 ml 2-etilsviesto rūgšties (vidinis standartas), tada homogenizuotos ir kaitinamos 4 °C temperatūroje. Centrifuguokite 12 000 aps./min. greičiu 15 minučių C temperatūroje. Viršslanis buvo ekstrahuotas 0,5 ml eterio ir įpurškiamas į dujų chromatografą analizei. Dujų chromatografijos (GC) analizei mėginiai buvo analizuojami naudojant GC-2010 Plus dujų chromatografą („Shimadzu, Inc.“) su liepsnos jonizacijos detektoriumi (FID). Atskyrimas buvo atliktas naudojant ZKAT-624 kolonėlę, 30 m × 0,53 mm × 0,3 μm („Lanzhou Zhongke Antai Analytical Technology Co., Ltd.“, Kinija). Duomenys buvo gauti naudojant GC tirpalo programinę įrangą („Shimadzu, Inc.“). Padalijimo santykis buvo 10:1, nešiklio dujos buvo azotas, o srauto greitis buvo 6 ml/min. Įpurškimo tūris buvo 1 μL. Injektoriaus ir detektoriaus temperatūra buvo 300 °C. Krosnies temperatūra buvo palaikoma 140 °C 13,5 minutės, po to padidinta iki 250 °C 120 °C/min greičiu; temperatūra buvo palaikoma 5 minutes.
Duomenys pateikiami kaip vidurkis ± vidurkio standartinė paklaida (SEM). Duomenų reikšmingumas buvo įvertintas vienfaktorine ANOVA analize, po kurios buvo atliktas Duncano daugiaplanis testas. Visiems skaičiavimams buvo naudojama „GraphPad Prism 5.0“ programinė įranga („GraphPad Software Inc.“, San Diegas, Kalifornija, JAV), o p < 0,05 buvo laikoma statistiškai reikšminga.
Gerai žinoma, kad opinis kolitas (OK) yra lėtinė recidyvuojanti kolito liga, pasireiškianti stipriu pilvo skausmu, viduriavimu ir kraujavimu. Todėl, siekiant įvertinti BLG veiksmingumą nuo kolito, buvo nustatytas DSS sukeltas lėtinis recidyvuojantis kolitas pelėms (1A pav.). Palyginti su kontroline grupe, DSS modelio grupės pelės turėjo žymiai mažesnį kūno svorį ir didesnį DAI, o šie pokyčiai reikšmingai išnyko po 24 dienų BLG gydymo (1B ir C pav.). Storosios žarnos sutrumpėjimas yra svarbus OK požymis. Kaip parodyta 1D ir E paveiksluose, pelių, gavusių DSS, storosios žarnos ilgis buvo žymiai sutrumpėjęs, tačiau gydymas BLG palengvino jo atsiradimą. Vėliau buvo atlikta histopatologinė analizė, siekiant įvertinti storosios žarnos uždegimą. H&E dažyti vaizdai ir patologiniai balai parodė, kad DSS vartojimas reikšmingai sutrikdė storosios žarnos architektūrą ir sukėlė kriptų sunaikinimą, o BLG gydymas reikšmingai sumažino kriptų sunaikinimą ir patologinius balus (1F ir G pav.). Pažymėtina, kad apsauginis BLG poveikis 1 g/kg doze buvo panašus į SASP poveikį 200 mg/kg dozėje. mg/kg. Apibendrinus šiuos duomenis, galima teigti, kad BLG veiksmingai mažina DSS sukelto lėtinio recidyvuojančio kolito sunkumą pelėms.
TNF-α, IL-1β ir IL-6 yra svarbūs gaubtinės žarnos uždegimo žymenys. Kaip parodyta 2A paveiksle, DSS sukėlė reikšmingą TNF-α, IL-1β ir IL-6 genų ekspresijos padidėjimą gaubtinėje žarnoje, palyginti su kontroline grupe. BLG skyrimas gali reikšmingai panaikinti šiuos DSS sukeltus pokyčius. Toliau ELISA metodu nustatėme uždegiminių citokinų TNF-α, IL-1β ir IL-6 kiekį gaubtinės žarnos audinyje. Rezultatai taip pat parodė, kad pelėms, gydytoms DSS, TNF-α, IL-1β ir IL-6 kiekis gaubtinėje žarnoje buvo reikšmingai padidėjęs, o BLG gydymas šį padidėjimą sumažino (2B paveikslas).
2 pav. BLG slopina uždegimą skatinančių citokinų TNF-α, IL-1β ir IL-6 genų ekspresiją ir gamybą DSS gydytų pelių gaubtinėje žarnoje. (A) TNF-α, IL-1β ir IL-6 genų ekspresija gaubtinėje žarnoje; (B) TNF-α, IL-1β ir IL-6 gaubtinės žarnos baltymų lygiai. Duomenys pateikiami kaip vidurkis ± SEM (n = 4–6). #p < 0,05 arba ##p < 0,01 arba ###p < 0,001, palyginti su kontroline (Con) grupe; *p < 0,05 arba **p < 0,01, palyginti su DSS grupe.
Žarnyno disbiozė yra labai svarbi opinio kolito patogenezėje.24 Norint ištirti, ar BLG moduliuoja DSS gydytų pelių žarnyno mikrobiotą, buvo atlikta 16S rRNR sekoskaita, siekiant išanalizuoti žarnyno turinio bakterijų bendruomenę. Venno diagrama rodo, kad trys grupės turi 385 bendras OTU. Tuo pačiu metu kiekviena grupė turėjo unikalius OTU (3A pav.). Be to, 3B ir C paveiksluose parodyti Chao1 indeksas ir Shannon indeksas parodė, kad BLG gydytų pelių žarnyno mikrobiotos bendruomenės įvairovė buvo sumažėjusi, nes Shannon indeksas buvo reikšmingai sumažėjęs BLG gydytoje grupėje. Pagrindinių komponenčių analizė (PCA) ir pagrindinių koordinačių analizė (PCoA) buvo naudojamos klasterizacijos modeliams tarp trijų grupių nustatyti ir parodė, kad DSS gydytų pelių bendruomenės struktūra buvo aiškiai atskirta po BLG gydymo (3D ir E paveikslai). Šie duomenys rodo, kad BLG gydymas reikšmingai paveikė pelių, sergančių DSS sukeltu kolitu, bendruomenės struktūrą.
3 pav. BLG keičia žarnyno mikrobiotos įvairovę pelėms, sergančioms DSS sukeltu kolitu. (A) OTU Venno diagrama, (B) Chao1 indeksas, (C) Šenono turtingumo indeksas, (D) OTU pagrindinių komponenčių analizės (PCA) balų grafikas, (E) OTU pagrindinių koordinačių analizės (PCoA) balas. Duomenys pateikiami kaip vidurkis ± SEM (n = 6). **p < 0,01, palyginti su DSS grupe.
Norėdami įvertinti specifinius išmatų mikrobiotos pokyčius, analizavome žarnyno mikrobiotos sudėtį visais taksonominiais lygmenimis. Kaip parodyta 4A paveiksle, pagrindinės visų grupių filos buvo Firmicutes ir Bacteroidetes, po jų sekė Verrucomicrobia. Santykinis Firmicutes gausumas ir Firmicutes/Bacteroidetes santykis DSS gydytų pelių išmatų mikrobų bendrijose buvo reikšmingai padidėjęs, palyginti su kontrolinėmis pelėmis, ir šie pokyčiai reikšmingai išnyko po gydymo BLG. Visų pirma, gydymas BLG reikšmingai padidino santykinį Verrucobacterium gausumą pelių, sergančių DSS sukeltu kolitu, išmatose. Namų ūkių lygmenyje išmatų mikrobų bendrijas užėmė Lachnospiriaceae, Muribaculaceae, Akkermansiaceae, Ruminococcaceae ir Prevotellaceae (4B pav.). Palyginti su DSS grupe, BLG sumažėjimas padidino Akkermansiaceae gausą, tačiau sumažino Lachnospiraceae ir Ruminococcaceae gausą. Pažymėtina, kad genties lygmenyje išmatų mikrobiotą užėmė Lachnospira_NK4A136_grupė, Akkermansia ir Prevotellaceae_UCG-001 (4C pav.). Šis atradimas taip pat parodė, kad BLG gydymas veiksmingai panaikino mikrobiotos disbalansą reaguojant į DSS poveikį, kuriam būdingas Eubacterium_xylanophilum_grupės, Ruminococcaceae_UCG-014, Intestinimonas ir Oscillibacter sumažėjimas bei Akkermansia ir Prevotellaceae_UCG-001 padidėjimas.
4 pav. BLG keičia žarnyno mikrobiotos gausą DSS sukelto kolito pelėms. (A) Žarnyno mikrobiotos gausa tipo lygmeniu; (B) Žarnyno mikrobiotos gausa šeimos lygmeniu; (C) Žarnyno mikrobiotos gausa genties lygmeniu. Duomenys pateikiami kaip vidurkis ± SEM (n = 6). #p < 0,05 arba ###p < 0,001, palyginti su kontroline (Con) grupe; *p < 0,05 arba **p < 0,01 arba ***p < 0,001, palyginti su DSS grupe.
Atsižvelgiant į tai, kad trumpos grandinės riebalų rūgštys (SCFA) yra pagrindiniai Akkermansia ir Prevotellaceae_UCG-001 metabolitai, o acetatas, propionatas ir butiratas yra gausiausios SCFA žarnyno spindyje,25–27 mes vis dar tęsiame tyrimą. Kaip parodyta 5 paveiksle, išmatų acetato, propionato ir butirato koncentracijos DSS gydytoje grupėje buvo reikšmingai sumažintos, o BLG gydymas galėjo iš esmės slopinti šį sumažėjimą.
5 pav. BLG padidina trumpųjų grandinės riebalų rūgščių (SCFA) kiekį pelių, sergančių DSS sukeltu kolitu, išmatose. (A) Acto rūgšties kiekis išmatose; (B) propiono rūgšties kiekis išmatose; (C) sviesto rūgšties kiekis išmatose. Duomenys pateikiami kaip vidurkis ± SEM (n = 6). #p < 0,05 arba ##p < 0,01, palyginti su kontroline (Con) grupe; *p < 0,05 arba **p < 0,01, palyginti su DSS grupe.
Taip pat apskaičiavome Pearsono koreliacijos koeficientą tarp genties lygmens diferencinių trumpųjų grandinės riebalų rūgščių (SCFA) ir išmatų mikrobiotos. Kaip parodyta 6 paveiksle, Akkermansia teigiamai koreliavo su propiono rūgšties (Pearson = 0,4866) ir sviesto rūgšties (Pearson = 0,6192) gamyba. Tuo tarpu tiek Enteromonas, tiek Oscillobacter neigiamai koreliavo su acetato gamyba, Pearsono koeficientai atitinkamai buvo 0,4709 ir 0,5104. Panašiai Ruminococcaceae_UCG-014 neigiamai koreliavo su propiono rūgšties (Pearson = 0,4508) ir sviesto rūgšties (Pearson = 0,5842) gamyba.
6 pav. Pearsono koreliacijos analizė tarp skirtingų trumpai apibrėžtų riebalų rūgščių (SCFA) ir gaubtinės žarnos mikrobų. (A) Enteromonas su acto rūgštimi; (B) Smegenų sukrėtimo bacila su acto rūgštimi; (C) Akkermansia ir propiono rūgštis; (D) Ruminococcus_UCG-014 su propiono rūgštimi; (E) Akkermansia su sviesto rūgštimi; (F) Ruminococcus_UCG-014 su sviesto rūgštimi.
Gliukagono tipo peptidas-1 (GLP-1) yra ląstelių tipui būdingas progliukagono (Gcg) potransliacinis produktas, pasižymintis priešuždegiminėmis savybėmis.28 Kaip parodyta 7 paveiksle, DSS sukėlė reikšmingą Gcg mRNR ekspresijos sumažėjimą. Storosios žarnos ir BLG gydymas galėjo reikšmingai panaikinti DSS sukeltą Gcg sumažėjimą, palyginti su kontroline grupe (7A pav.). Tuo pačiu metu GLP-1 kiekis serume buvo reikšmingai sumažėjęs DSS gydytoje grupėje, o BLG gydymas galėjo iš esmės užkirsti kelią šiam sumažėjimui (7B pav.). Kadangi trumpos grandinės riebalų rūgštys gali stimuliuoti GLP-1 sekreciją aktyvuodamos su G baltymu sujungtą 43 receptorių (GRP43) ir su G baltymu sujungtą 41 receptorių (GRP41), mes taip pat ištyrėme GPR41 ir GRP43 kolito pelių gaubtinėje žarnoje ir nustatėme, kad GRP43 ir GPR41 gaubtinės žarnos mRNR ekspresija reikšmingai sumažėjo po DSS poveikio, o BLG gydymas galėjo veiksmingai panaikinti šį sumažėjimą (7C ir D pav.).
7 pav. BLG padidina GLP-1 kiekį serume ir Gcg, GPR41 ir GRP43 mRNR raišką DSS paveiktose pelėse. (A) Gcg mRNR raiška gaubtinės žarnos audinyje; (B) GLP-1 kiekis serume; (C) GPR41 mRNR raiška gaubtinės žarnos audinyje; (D) GPR43 mRNR raiška gaubtinės žarnos audinyje. Duomenys pateikiami kaip vidurkis ± SEM (n = 5–6). #p < 0,05 arba ##p < 0,01, palyginti su kontroline (Con) grupe; *p < 0,05, palyginti su DSS grupe.
Kadangi gydymas BLG galėjo padidinti GLP-1 kiekį serume, storosios žarnos Gcg mRNR raišką ir išmatų SCFA kiekį DSS gydytose pelėse, toliau tyrėme acetato, propionato ir butirato, taip pat kontrolinių (F-Con), DSS kolito (F-Con) (DSS) ir BLG gydytų kolito (F-BLG) pelių GLP-1 išsiskyrimą iš pirminių pelių storosios žarnos epitelio ląstelių. Kaip parodyta 8A paveiksle, pirminės pelių storosios žarnos epitelio ląstelės, apdorotos atitinkamai 2 mM acto rūgštimi, propiono rūgštimi ir sviesto rūgštimi, reikšmingai stimuliavo GLP-1 išsiskyrimą, kas atitinka ankstesnius tyrimus.29,30 Panašiai visi F-Con, F-DSS ir F-BLG (atitinka 0,25 g išmatų) labai stimuliavo GLP-1 išsiskyrimą iš pirminių pelių storosios žarnos epitelio ląstelių. Pažymėtina, kad F-DSS gydytų pirminių pelių storosios žarnos epitelio ląstelių išskiriamo GLP-1 kiekis buvo daug mažesnis nei F-Con ir F-BLG gydytų pirminių pelių storosios žarnos epitelio ląstelių.(8A paveikslas) 8B). Šie duomenys rodo, kad gydymas BLG reikšmingai atkūrė žarnyno iš SCFA gautos GLP-1 gamybą.
8 pav. Iš BLG gautos trumpos grandinės riebalų rūgštys (SCFA) stimuliuoja GLP-1 išsiskyrimą iš pirminių pelių storosios žarnos epitelio ląstelių. (A) Acto rūgštis, propiono rūgštis ir sviesto rūgštis stimuliavo GLP-1 išsiskyrimą iš pirminių pelių storosios žarnos epitelio ląstelių; (B) išmatų ekstraktai F-Con, F-DSS ir F-BLG stimuliavo pirmines pelių storosios žarnos epitelio ląsteles. Išsiskyrusio GLP-1 kiekis. Storosios žarnos epitelio ląstelių alikvotinės dalys buvo dedamos į stiklinio dugno Petri lėkšteles ir apdorotos atitinkamai 2 mM acto rūgštimi, propiono rūgštimi, sviesto rūgštimi ir išmatų ekstraktais F-Con, F-DSS ir F-BLG (atitinka 0,25 g išmatų). 2 valandos 37 °C temperatūroje, 5 % CO2. Iš pirminių pelių storosios žarnos epitelio ląstelių išsiskyrusio GLP-1 kiekis buvo nustatytas ELISA metodu. Duomenys pateikiami kaip vidurkis ± SEM (n = 3). #p < 0,05 arba ##p < 0,01, palyginti su tuščiuoju arba F-Con; *p < 0,05, palyginti su F-DSS.
Santrumpos: Ace – acto rūgštis; Pro – propiono rūgštis; tačiau sviesto rūgštis; F-Con – kontrolinių pelių išmatų ekstraktas; F-DSS – kolitu sergančių pelių išmatų ekstraktas; F-BLG – iš BLG gydytos gaubtinės žarnos. Uždegiminių pelių išmatų ekstraktai.
Pasaulio sveikatos organizacijos įtraukta į atsparių gydymui ligų sąrašą, opinis kolitas tampa pasauliniu pavojumi; Tačiau veiksmingų ligos prognozavimo, prevencijos ir gydymo metodų vis dar yra riboti. Todėl reikia skubiai ištirti ir sukurti naujas saugias ir veiksmingas opinio kolito (OK) gydymo strategijas. Tradicinės kinų medicinos preparatai yra perspektyvus pasirinkimas, nes per šimtmečius daugelis tradicinės kinų medicinos preparatų buvo veiksmingi gydant OK Kinijos populiacijoje, ir jie visi yra biologinės organinės ir natūralios medžiagos, kurios dažniausiai yra nekenksmingos žmonėms ir gyvūnams.31,32 Šio tyrimo tikslas buvo ieškoti saugaus ir veiksmingo tradicinės kinų medicinos preparato OK gydymui ir ištirti jo veikimo mechanizmą. BLG yra gerai žinoma kinų žolelių formulė, naudojama gripui gydyti.8,33 Mūsų ir kitų laboratorijų darbai parodė, kad indigo, perdirbtas tradicinės kinų medicinos produktas, pagamintas iš tos pačios žaliavos kaip ir BLG, pasižymi dideliu veiksmingumu gydant OK žmonėms ir gyvūnams.4,34 Tačiau BLG antikolitinis poveikis ir jo poveikis. Mechanizmas nėra aiškus. Šiame tyrime mūsų rezultatai rodo, kad BLG veiksmingai slopina DSS sukeltą gaubtinės žarnos uždegimą, kuris yra susijęs su žarnyno mikrobiotos moduliacija ir atkūrimu. žarnyne gaminama GLP-1.
Gerai žinoma, kad opiniam kolitui būdingi recidyvuojantys laikotarpiai su tipiniais klinikiniais požymiais, tokiais kaip svorio kritimas, viduriavimas, kraujavimas iš tiesiosios žarnos ir didelis gaubtinės žarnos gleivinės pažeidimas.35 Taigi, lėtinis recidyvuojantis kolitas buvo gydomas skiriant tris 1,8 % DSS ciklus penkias dienas, po to septynias dienas geriant vandenį. Kaip parodyta 1B paveiksle, svyruojantis svorio kritimas ir DAI balai rodė sėkmingą lėtinio recidyvuojančio kolito sukėlimą. BLG gydytos grupės pelės nuo 8 dienos parodė pagerėjimą, kuris reikšmingai skyrėsi nuo 24 dienos. Tie patys pokyčiai buvo pastebėti ir DAI bale, o tai rodo kolito klinikinio pagerėjimo pagerėjimą. Kalbant apie gaubtinės žarnos pažeidimą ir uždegiminę būseną, po gydymo BLG taip pat labai pagerėjo gaubtinės žarnos ilgis, gaubtinės žarnos audinio pažeidimas, genų raiška ir uždegimą skatinančių citokinų TNF-α, IL-1β ir IL-6 gamyba gaubtinės žarnos audinyje. Apibendrinus, šie rezultatai aiškiai rodo, kad BLG yra veiksmingas gydant lėtinį recidyvuojantį kolitą pelėms.
Kaip BLG veikia farmakologiškai? Daugybė ankstesnių tyrimų parodė, kad žarnyno mikrobiota vaidina pagrindinį vaidmenį opinio kolito patogenezėje, o mikrobiomu paremta ir į mikrobiomą nukreipta terapija tapo labai patrauklia opinio kolito gydymo strategija. Šiame tyrime parodėme, kad gydymas BLG lėmė reikšmingus žarnyno mikrobiotos sudėties pokyčius, o tai rodo, kad apsauginis BLG poveikis nuo DSS sukelto kolito yra susijęs su žarnyno mikrobiotos moduliacija. Šis stebėjimas atitinka mintį, kad žarnyno mikrobiotos homeostazės perprogramavimas yra svarbus būdas suprasti TCM preparatų veiksmingumą.36,37 Pažymėtina, kad Akkermansia yra gramneigiama ir griežtai anaerobinė bakterija, gyvenanti žarnyno gleivių sluoksnyje, kuri skaido mucinus, gamina propioninę rūgštį, stimuliuoja taurinių ląstelių diferenciaciją ir palaiko gleivinės barjero vientisumo funkciją.26 Daugybiniai klinikiniai ir su gyvūnais atlikti duomenys rodo, kad Akkermansia yra labai susijusi su sveika gleivine38 ir peroraliniu Akkermansia spp. vartojimu. gali žymiai pagerinti gleivinės uždegimą.39 Mūsų dabartiniai duomenys rodo, kad po gydymo BLG reikšmingai padidėja santykinė Akkermansia gausa. Be to, Prevotellaceae_UCG-001 yra SCFA gaminanti bakterija.27 Daugybė tyrimų parodė, kad Prevotellaceae_UCG-001 santykinė gausa buvo rasta gyvūnų, sergančių kolitu, išmatose.40,41 Mūsų dabartiniai duomenys taip pat rodo, kad gydymas BLG gali reikšmingai padidinti santykinę Prevotellaceae_UCG-001 gausą DSS gydytų pelių storojoje žarnoje. Priešingai, Oscillibacter yra mezofilinė, griežtai anaerobinė bakterija.42 Pranešta, kad santykinė Oscillibacter gausa UC pelėse buvo reikšmingai padidėjusi ir buvo reikšmingai teigiamai koreliuojama su IL-6 ir IL-1β lygiais bei patologiniais balais.43,44 Pažymėtina, kad gydymas BLG reikšmingai sumažino santykinę Oscillibacter gausą DSS gydytų pelių išmatose. Svarbu atkreipti dėmesį, kad šios BLG pakeistos bakterijos buvo daugiausiai SCFA gaminančios bakterijos. Daugybė ankstesnių tyrimų parodė galimą teigiamą SCFA poveikį. dėl gaubtinės žarnos uždegimo ir žarnyno epitelio vientisumo apsaugos.45,46 Mūsų dabartiniai duomenys taip pat parodė, kad BLG gydytų pelių išmatose DSS gydytų SCFA acetato, propionato ir butirato koncentracijos buvo labai padidėjusios. Apibendrinus šiuos duomenis, aiškiai matyti, kad BLG gydymas gali veiksmingai sustiprinti DSS sukeltas SCFA gaminančias bakterijas pelėms, sergančioms lėtiniu recidyvuojančiu kolitu.
GLP-1 yra inkretinas, daugiausia gaminamas klubinėje žarnoje ir gaubtinėje žarnoje, ir atlieka svarbų vaidmenį sulėtinant skrandžio ištuštinimą bei mažinant gliukozės kiekį kraujyje po valgio.47 Įrodymai rodo, kad dipeptidilpeptidazė (DPP)-4, GLP-1 receptorių agonistas ir GLP-1 nanomedicina gali veiksmingai sumažinti žarnyno uždegimą pelėms.48–51 Kaip pranešta ankstesniuose tyrimuose, didelė trumpųjų grandinės riebalų rūgščių (SCFA) koncentracija buvo susijusi su GLP-1 kiekiu plazmoje žmonėms ir pelėms.52 Mūsų dabartiniai duomenys rodo, kad po gydymo BLG reikšmingai padidėjo GLP-1 kiekis serume ir Gcg mRNR raiška.Panašiai ir GLP-1 sekrecija reikšmingai padidėjo gaubtinės žarnos kultūrose po stimuliacijos BLG gydytų kolitu sergančių pelių išmatų ekstraktais, palyginti su stimuliacija DSS gydytų kolitu sergančių pelių išmatų ekstraktais.Kaip SCFA veikia GLP-1 išsiskyrimą?Gwen Tolhurst ir kt. pranešė, kad SCFA gali stimuliuoti GLP-1 sekreciją per GRP43 ir GPR41.29 Mūsų dabartiniai duomenys taip pat rodo, kad gydymas BLG reikšmingai padidina GRP43 ir GPR41 mRNR ekspresiją DSS gydytų pelių gaubtinėje žarnoje. Šie duomenys rodo, kad gydymas BLG gali atkurti SCFA skatinamą GLP-1 gamybą aktyvuodamas GRP43 ir GPR41.
BLG yra ilgalaikis nereceptinis vaistas Kinijoje. Didžiausia toleruojama BLG dozė Kunmingo pelėms yra 80 g/kg, ir nebuvo pastebėtas joks ūminis toksiškumas.53 Šiuo metu rekomenduojama BLG (be cukraus) dozė žmonėms yra 9–15 g per parą (3 kartus per dieną). Mūsų tyrimas parodė, kad 1 g/kg BLG palengvino DSS sukeltą lėtinį recidyvuojantį kolitą pelėms. Ši dozė yra artima kliniškai naudojamai BLG dozei. Mūsų tyrimas taip pat nustatė, kad jo veikimo mechanizmas bent iš dalies yra susijęs su žarnyno mikrobiotos pokyčiais, ypač SCFA gaminančių bakterijų, tokių kaip Akkermansia ir Prevotellaceae_UCG-001, pokyčiais, siekiant atkurti žarnyne išskiriamą GLP-1 gamybą. Šie duomenys rodo, kad BLG nusipelno tolesnio svarstymo kaip potencialus terapinis agentas klinikiniam kolito gydymui. Tačiau tikslus mechanizmas, kuriuo jis moduliuoja žarnyno mikrobiotą, dar turi būti patvirtintas atliekant mikrobiotos trūkumo turinčias peles ir išmatų bakterijų transplantaciją.
Ace, acto rūgštis; but, sviesto rūgštis; BLG, pandanas; DSS, dekstrano natrio sulfatas; DAI, ligos aktyvumo indeksas; DPP, dipeptidilpeptidazė; FID, liepsnos jonizacijos detektorius; F-Con, kontrolinė grupė. Pelių išmatų ekstraktai; F-DSS, DSS kolitu sergančių pelių išmatų ekstraktai; F-BLG, BLG gydytų kolitu pelių išmatų ekstraktai; GLP-1, gliukagono tipo peptidas-1; Gcg, gliukagonas; dujų chromatografija, dujų chromatografija; GRP43, su G baltymu susijęs receptorius 43; GRP41, su G baltymu susijęs receptorius 41; H&E, hematoksilino eozinas; HBSS, Hankso subalansuotas druskos tirpalas; OTC, OTC; PCA, pagrindinių komponentų analizė; PCoA, pagrindinių koordinačių analizė; Pro, propioninė rūgštis; SASP, sulfasalazinas; SCFA, trumpos grandinės riebalų rūgštys; kinų medicina, tradicinė kinų medicina; opinis kolitas, opinis kolitas.
Visus eksperimentinius protokolus patvirtino Pekino universiteto Šendženo ir Honkongo mokslo ir technologijų universiteto medicinos centro (Šendženas, Kinija) gyvūnų etikos komitetas pagal Institucines gaires ir gyvūnų reglamentus (etikos numeris A2020157).
Visi autoriai reikšmingai prisidėjo prie koncepcijos ir dizaino, duomenų rinkimo ar duomenų analizės ir interpretavimo; dalyvavo rengiant straipsnį arba kritiškai peržiūrint svarbų intelektinį turinį; sutiko pateikti rankraštį šiam žurnalui; galiausiai patvirtino versiją publikavimui; buvo atsakingi už visus darbo aspektus.
Šį darbą rėmė Kinijos nacionalinis gamtos mokslų fondas (81560676 ir 81660479), pirmos klasės Šendženo universiteto projektas (86000000210), Šendženo mokslo ir technologijų inovacijų komiteto fondas (JCYJ20210324093810026), Guangdongo provincijos medicinos mokslo ir technologijų tyrimų fondas (A2020157 ir A2020272), Guidžou medicinos universiteto vaistinė, finansuojama „Key Laboratory“ (YWZJ2020-01), ir Pekino universitetinė Šendženo ligoninė (JCYJ2018009).
1. Tang B, Zhu J, Zhang B ir kt. Triptolido, kaip priešuždegiminio agento, terapinis potencialas dekstrano natrio sulfato sukelto eksperimentinio kolito metu pelėms. pre-immune.2020;11:592084.doi: 10.3389/fimmu.2020.592084
2. Kaplan GG. Pasaulinė uždegiminių žarnyno ligų (UŽL) našta: nuo 2015 iki 2025 m. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2015; 12: 720–727. doi: 10.1038/nrgastro. 2015. 150
3. Peng J, Zheng TT, Li Xue ir kt. Augalinės kilmės alkaloidai: perspektyvūs uždegiminės žarnyno ligos modifikatoriai. Prepharmacology.2019;10:351.doi:10.3389/fphar.2019.00351
4. Xiao Haiteng, Peng Jie, Wen B ir kt. „Indigo Naturalis“ slopina gaubtinės žarnos oksidacinį stresą ir Th1/Th17 atsakus DSS sukelto kolito metu pelėms. Oxid Med Cell Longev. 2019; 2019: 9480945. doi: 10.1155/2019/9480945
5. Chen M, Ding Y, Tong Z. Sophora flavescens (Sophora flavescens) veiksmingumas ir saugumas gydant opinį kolitą: klinikiniai įrodymai ir galimi mechanizmai. Prepharmacology.2020;11:603476.doi:10.3389/fphar.2020.603476
6. Cao Fang, Liu Jie, Sha Benxing, Pan HF. Natūralūs produktai: eksperimentiškai veiksmingi vaistai uždegiminei žarnyno ligai gydyti. Curr Pharmaceuticals. 2019;25:4893–4913. doi: 10.2174/1381612825666191216154224
7. Zhang C, Jiang M, Lu A. Apmąstymai apie opinio kolito adjuvantinį gydymą tradicine kinų medicina. „Clinical Rev Allergy Immunization“. 2013; 44: 274–283. doi: 10.1007/s12016-012-8328-9
8. Li Zhongteng, Li Li, Chen TT ir kt. Banlangen granulių veiksmingumas ir saugumas gydant sezoninį gripą: atsitiktinių imčių kontroliuojamo tyrimo protokolas. trial.2015;16:126.doi: 10.1186/s13063-015-0645-x