Baltymų rūšiavimas sekrecijos procese yra būtinas norint palaikyti ląstelių susiskaldymą ir homeostazę. Be lukšto tarpininkaujamo rūšiavimo, lipidų vaidmuo kinezinų rūšiavime sekrecijos pernašos procese yra ilgalaikis esminis klausimas, į kurį dar nebuvo atsakyta. Šiame tyrime atliekame trimatį vienalaikį daugiaspalvį didelės raiškos realaus laiko vaizdavimą, siekdami in vivo įrodyti, kad naujai susintetinti glikozilfosfatidilinozitolio imobilizuoti baltymai su labai ilgomis keramido lipidų dalimis yra grupuojami ir klasifikuojami į specializuotas endoplazmos tinklo išėjimo vietas, kurios skiriasi nuo transmembraninių baltymų naudojamos. Be to, parodome, kad keramido grandinės ilgis endoplazminio tinklo membranoje yra labai svarbus šiam rūšiavimo selektyvumui. Mūsų tyrimas pateikia pirmąjį tiesioginį in vivo įrodymą, leidžiantį klasifikuoti baltymų krovinius pagal lipidų grandinės ilgį į selektyvias eksporto vietas sekrecijos procese.
Eukariotinėse ląstelėse endoplazminiame tinkle (ER) susintetinti baltymai transportavimo metu sekreciniu keliu yra rūšiuojami, kad būtų pristatyti į atitinkamą ląstelinę paskirties vietą (1). Be rūšiavimo per apvalkalą, ilgą laiką buvo spėliojama, kad tam tikri lipidai taip pat gali būti selektyvūs išėjimo taškai, sugrupuodami juos į specifinius membranos domenus, kurie specifinius baltymus (2–5). Tačiau vis dar trūksta tiesioginių in vivo įrodymų, įrodančių šį galimą lipidų pagrindu veikiantį mechanizmą. Siekdami išspręsti šią pagrindinę problemą, mielėse tyrėme, kaip glikozilfosfatidilinozitolio (GPI) inkaruoti baltymai (GPI-AP) yra skirtingai eksportuojami iš ER. GPI-AP yra įvairūs su lipidais susiję ląstelės paviršiaus baltymai (6, 7). GPI-AP yra sekretuojamas baltymas, pritvirtintas prie išorinių plazminės membranos lapelių per glikolipidų dalį (GPI inkarą). Jie priima GPI inkarus kaip konservatyvias potransliacines modifikacijas ER spindyje (8). Po prisijungimo GPI-AP per Goldžio aparatą (5, 9) pereina iš ER į plazminę membraną. Dėl GPI inkarų buvimo GPI-AP yra transportuojamas atskirai nuo transmembraninių sekretuojamų baltymų (įskaitant kitus plazminės membranos baltymus) sekrecijos keliu (5, 9, 10). Mielių ląstelėse GPI-AP yra atskiriami nuo kitų sekretuojamų baltymų endoplazminiame tinkle, o po to supakuojami į unikalias pūsleles, apvyniotas apvalkalo baltymų kompleksu II (COPII) (6, 7). Šio klasifikavimo proceso ER eksporto procese veiksniai nėra aiškūs, tačiau spėjama, kad šiam mechanizmui gali reikėti lipidų, ypač GPI inkaro lipidinės dalies struktūrinio pertvarkymo (5, 8). Mielėse GPI lipidų pertvarkymas prasideda iškart po GPI prisijungimo, ir daugeliu atvejų dėl to keramidas prisijungia prie 26 anglies atomų ilgos grandinės sočiųjų riebalų rūgšties (C26:0) (11, 12). C26 keramidas yra pagrindinis keramidas, kurį iki šiol gamina mielių ląstelės. Jis sintetinamas ER, o didžioji jo dalis eksportuojama į Goldžio aparatą per COPII pūsleles (13). GPI-AP pernašai į ER būtina nuolatinė ceramido sintezė (14, 15), o ceramido pavertimas inozitolio fosfato ceramidu (IPC) Goldžio aparate priklauso nuo GPI inkaro sintezės (16). Biofizikiniai tyrimai su dirbtinėmis membranomis parodė, kad labai ilgos acilo grandinės ceramidai gali susijungti ir sudaryti tvarkingus domenus su unikaliomis fizinėmis savybėmis (17, 18). Šie duomenys leidžia daryti prielaidą, kad C26 ceramidas ir GPI-AP su C26 ceramidu naudoja savo fizikines savybes, kad susijungtų į tvarkingus regionus arba regionus santykinai netvarkingoje ER membranos lipidų aplinkoje. Ją daugiausia sudaro trumpi ir nesotieji glicerolipidai (C16:1 ir C18:1) (19, 20). Šie regionai bus selektyviai sutelkti į specifines ER išėjimo vietas (ERES), kur ceramidas ir ceramido pagrindu pagamintas GPI-AP gali būti kartu transportuojami į Goldžio aparatą toje pačioje specialioje COPII pūslelėje (5).
Šiame tyrime tiesiogiai išbandėme šį lipidų pagrindu veikiantį mechanizmą, naudodami itin didelės skiriamosios gebos konfokalinę realaus laiko vaizdavimo mikroskopiją (SCLIM) – pažangiausią mikroskopijos techniką, galinčią vienu metu stebėti fluorescenciškai žymėtus baltymus. Trijų spalvų ir trimačiai (3D) vaizdai gyvose ląstelėse pasižymi itin didele skiriamąja geba ir greičiu (21, 22).
Pirmiausia pritaikėme SCLIM technologiją, siekdami toliau apibrėžti, kaip normalus GPI-AP su C26 keramido grupe buvo atrenkamas iš transmembraninių sekretuojamų baltymų, palikusių ER S. cerevisiae ląstelėse. Siekdami patikrinti ER klasifikaciją, panaudojome genetinę sistemą, kuri gali tiesiogiai vizualizuoti naujai susintetintą krovinį, patenkantį į ERES in vivo (7, 23). Kaip krovinį pasirinkome C26 keramido pagrindu pagamintą GPI-AP Gas1, žymėtą žaliai fluorescenciniu baltymu (GFP), ir transmembraniškai sekretuojamą baltymą Mid2, žymėtą artimojo infraraudonojo spektro fluorescenciniu baltymu (iRFP), kurie abu veikia plazminę membraną (24–26). Temperatūrai jautriame sec31-1 mutante šie du kroviniai yra ekspresuojami pagal galaktozės indukuojamą promotorių ir konstitucinį ERES žymeklį. Esant ekstremaliai temperatūrai (37 °C), kadangi sec31-1 mutacija veikia COPII apvalkalo komponento Sec31 funkciją slopinti COPII dygimą ir ER eksportą, naujai susintetintas krovinys kaupiasi ER (23). Atvėsinus iki žemos temperatūros (24 °C), sec31-1 mutantinės ląstelės atsigavo iš sekrecinės srities, o sukauptas naujas sintetinis krovinys pradėjo būti eksportuojamas iš ER. CLIM vizualizacija parodė, kad didžioji dalis naujai susintetintų Gas1-GFP ir Mid2-iRFP vis dar kaupėsi sec31-1 mutantinių ląstelių ER po inkubacijos 37 °C temperatūroje ir po to, kai 5 minutes buvo išleisti 24 °C temperatūroje (1 pav.). Kadangi Mid2-iRFP yra paskirstytas visoje ER membranoje, o Gas1-GFP yra koncentruotas ir kaupiamas netolygioje ER membranos srityje, jų pasiskirstymas yra visiškai kitoks (1 pav., A–C ir 1 papildomas vaizdo įrašas). Be to, kaip parodyta 1D paveiksle, Gas1-GFP klasteryje nėra Mid2-iRFP. Šie rezultatai rodo, kad GPI-AP ir transmembraniniai baltymai anksti buvo atskirti į skirtingus ER membranos regionus. „Gas1-GFP“ klasteris yra greta specifinio ERES, pažymėto „mCherry“ COPII apvalkalo baltymu Sec13 (1 pav., E ir F, ir S1 vaizdo įrašas) (23).
sec31-1 ląstelės ekspresuoja galaktozės sukeltus sekretus, ilgos acilinės grandinės (C26) keramidą GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, žalia) ir transmembraninį baltymą Mid2-iRFP (TMP, mėlyna), ir šis konstruktyvus ERES žymėjimas Sec13-mCherry (ERES, rausvai raudona) buvo inkubuojamas 37 °C temperatūroje 30 minučių, perkeltas į 24 °C ir po 5 minučių vaizduojamas SCLIM. (A–C) rodo reprezentatyvų sujungtą arba vieną plokštumos 2D vaizdą (A), 10 z pjūvių 2D projekcijos vaizdą (B) arba krovinio ir ERES žymeklių 3D ląstelės pusrutulio vaizdą (C). Mastelio juosta 1 μm (A ir B). Mastelio vienetas yra 0,551 μm (C). Gas1-GFP buvo aptiktas atskiruose ER regionuose arba klasteriuose, o Mid2-iRFP buvo aptiktas ir pasiskirstęs visoje ER membranoje (C). (D) Grafike parodytas santykinis Gas1-GFP ir Mid2-iRFP fluorescencijos intensyvumas Gas1-GFP klasteryje išilgai baltos rodyklės linijos (kairėje). AU – savavališkas vienetas. (E ir F) žymi 3D vaizdą, kuriame sujungti „preksai“ ir ERES žymė. Gas1-GFP klasteriai buvo aptikti šalia konkretaus ERES. Mastelio vienetas yra 0,551 μm. (F) Balta ištisinė rodyklė žymi su ERES susietą Gas1-GFP klasterį. Vidurinėje ir dešinėje esančiose panelėse rodomas sujungtas padidintas 3D vaizdas ir pasuktas pasirinkto Gas1-GFP klasterio vaizdas.
Glaudus erdvinis ryšys tarp „Gas1-GFP“ klasterio ir konkretaus ERES rodo, kad „Gas1-GFP“ gali patekti į selektyvų ERES, kuris skiriasi nuo selektyvumo, kurį naudoja Mid2-iRFP, kad paliktų ER. Norėdami įvertinti šią galimybę, kiekybiškai įvertinome ERES santykį tik vienai ar dviem prekėms (2 pav., A–C). Nustatėme, kad daugumoje ERES (70 %) yra tik vieno tipo krovinys. Apatiniame 2C paveikslo paveikslėlyje pateikti du tipiški ERES pavyzdžiai, kuriuose yra tik „Gas1-GFP“ (1 pav.) arba tik „Mid2-iRFP“ (2 pav.). Priešingai, maždaug 20 % ERES yra du kroviniai, kurie persidengia toje pačioje srityje. Nustatyta, kad kai kuriuose ERES (10 %) buvo dviejų tipų kroviniai, tačiau jie buvo izoliuoti aiškiai skirtingose ​​srityse. Todėl ši statistinė analizė rodo, kad eksportavus ER, GPI-AP „Gas1-GFP“ ir transmembraninis krovinys Mid2-iRFP yra padalijami į skirtingus ERES (2D pav.). Šis rūšiavimo efektyvumas labai atitinka ankstesnę biocheminę analizę (6) ir morfologinį nustatymą (7). Taip pat galime stebėti karantino krovinio, patenkančio į ERES, elgseną (2E pav. ir S2 vaizdo įrašas). 2E paveiksle parodyta, kad tik nedidelė Gas1-GFP (3 skydelis) arba Mid2-iRFP (4 skydelis) dalis patenka į ERES iš vienos pusės ir yra apribota atskira sritimi. 2E paveikslo 5 skydelyje parodyta, kad Gas1-GFP ir Mid2-iRFP kartais randami toje pačioje ERES, tačiau jie patenka iš skirtingų pusių ir yra sutelkti atskiruose regionuose, kurie gali reikšti skirtingas COPII pūsleles. Taip pat patvirtinome, kad stebėtas C26 ceramido pagrindu pagaminto GPI-AP Gas1 atskyrimas ir klasifikavimas kaip selektyvus ERES yra specifinis, nes kitas transmembraninis sekrecijos krovinys, GFP žymėtas plazminės membranos baltymas Axl2 (27), pasižymi panašiu elgesiu kaip Mid2-iRFP. (S1 pav. ir S3 vaizdo įrašas). Naujai susintetintas Axl2-GFP pasiskirsto per ER membraną kaip Mid2-iRFP (S1, A ir B paveikslai) ir yra kolokalizuotas su Mid2-iRFP daugumoje ERES (S1, B–D paveikslai). 1 ir 2 paveikslo panelėse. S1C paveiksle pateikti du tipiški ERES pavyzdžiai, kai du transmembraniniai kroviniai persidengia. Tokiais atvejais abi prekės patenka į ERES kartu (S1E paveikslas, 3 panelė ir S3 vaizdo įrašas).
Galaktozės indukuojamus sekretus ekspresuojančios sec31-1 ląstelės, Gas1-GFP (GPI-AP, žalia) ir Mid2-iRFP (TMP, mėlyna) bei konstitucinis ERES žymėjimas Sec13-mCherry (ERES, rausvai raudona), buvo patalpintos 37 °C temperatūroje. Po 30 minučių inkubacijos °C temperatūroje, perkeltos į 24 °C, kad būtų atpalaiduotas sekrecijos blokas, ir po 20 minučių vaizduojamos naudojant SCLIM. (A–C) Tipiniai krovinio ir 10 z pjūvių, pažymėtų ERES, 2D projekcijos vaizdai (A; mastelio juosta, 1 μm) arba 3D ląstelių pusrutulio vaizdai (B ir C; mastelio vienetas, 0,456 μm). Apatinėje (B) ir (C) panelėse rodomi apdoroti vaizdai, kuriuose rodomos tik ERES esančios prekės (rausvai raudona) [Gas1-GFP (pilka) ir Mid2-iRFP (šviesiai mėlyna)]. (C) Atvira rodyklė: ERES gabena tik vieną krovinio vienetą (nuo 1 iki 4). Pilka rodyklė: ERES sudėtyje yra atskirtų krovinių (5). Balta ištisinė rodyklė: ERES sudėtyje yra kartu esančių krovinių. Apačioje: pasirinktame viename ERES yra tik Gas1-GFP (1) arba Mid2-iRFP (2). Mastelio juosta, 100 nm. (D) (C) punkte aprašytos mikrofotografijos kiekybinis įvertinimas. Vidutinis ERES, kuriame yra tik vienas krovinys (Gas1-GFP arba Mid2-iRFP), atskirtų krovinių ir persidengiančių krovinių, procentas. Trijuose nepriklausomuose eksperimentuose n = 432 54 langeliuose. Paklaidos juosta = SD. Dvipusis neporinis t testas. *** P = 0,0002. (E) pasirinkto karantino krovinio ERES 3D vaizdas, pažymėtas (C). Gas1-GFP (žalia) (3) arba Mid2-iRFP (mėlyna) (4) patenka į ERES (rausvai raudona) iš vienos pusės ir yra apribota maža ERES sritimi. Kartais abiejų tipų kroviniai patenka į tą pačią ERES (5) iš tos pačios pusės ir yra apriboti izoliuota ERES sritimi. Skalės juosta, 100 nm.
Toliau patikrinome hipotezę, kad ER membranoje esantis ilgos acilo grandinės keramidas (C26) skatina specifinį Gas1 klasterizavimąsi ir rūšiavimą į selektyvius ERES. Šiuo tikslu panaudojome modifikuotą mielių padermę GhLag1, kurioje dvi endogeninės keramido sintazės Lag1 ir Lac1 buvo pakeistos GhLag1 (medvilnės Lag1 homologu), todėl gauta mielių padermė, kurios ląstelės membranos keramido padermė trumpesnė nei laukinio tipo (3A pav.) (28). Masių spektrometrijos (MS) analizė parodė, kad laukinio tipo padermėse 95 % viso keramido yra labai ilgos (C26) grandinės keramidas, o GhLag1 padermėje 85 % keramido yra labai ilgos (C18 ir C16) grandinės keramidas. Tik 2 % keramido yra labai ilgos (C26) grandinės keramidas. Nors iki šiol GhLag1 membranoje aptikti pagrindiniai keramidai yra C18 ir C16, MS analizė taip pat patvirtino, kad GhLag1 padermėje ekspresuojamo Gas1-GFP GPI inkaras turi C26 keramidą, kuris yra panašus į laukinio tipo lipidus. Kokybė yra tokia pati (3A pav.) (26). Taigi, tai reiškia, kad keramido pertvarkymo fermentas Cwh43 yra labai selektyvus C26 keramidui, kaip parodyta 26 paveiksle, jis pirmiausia įtraukia GPI inkarą iš nedidelio kiekio C26 keramido GhLag1 padermėje. S2 (29). Nepaisant to, GhLag1 ląstelės membranoje iš esmės yra tik C18-C16 keramidas, o Gas1-GFP vis dar turi C26 keramidą. Dėl šios priežasties ši padermė yra ideali priemonė, skirta konkrečiai spręsti membraninio keramido acilo grandinės ilgio problemą ER. Hipotetinis klasės ir rūšiavimo vaidmuo. Tuomet pirmiausia įprastine fluorescencine mikroskopija ištyrėme C26 Gas1-GFP gebėjimą kauptis klasteriuose GhLag1 baltyme su temperatūrai jautriu sec31-1 mutantiniu aleliu, kur ER membranos keramide yra tik ilgoji (C18-C16) grandinė (3 pav.). Pastebėjome, kad sec31-1 baltyme didžioji dalis Gas1-GFP buvo sutelkta klasteriuose, o Gas1-GFP sec31-1 GhLag1 baltyme su ilga (C18-C16) ilga keramido ER membrana daugiausia nebuvo klasterizuotas ir buvo pasiskirstęs po visą ER membraną. Tiksliau sakant, kadangi klasterizacija C26 keramido pagrindu yra glaudžiai susijusi su specifiniu ERES (1 pav.), toliau tyrėme, ar šis procesas gali būti susijęs ir su ER eksporto baltymų mechanizmu. GPI-AP ER eksportui naudoja specialią COPII sistemą, kurią aktyviai reguliuoja Ted1 struktūrinis GPI inkaro glikano dalies pertvarkymas (30, 31). Rekombinantinį GPI-glikaną atpažįsta transmembraninis krovinio receptorių p24 kompleksas, kuris savo ruožtu selektyviai pritraukia Lst1, kuris yra specifinė pagrindinio COPII krovinio surišimo subvieneto Sec24 izoforma, sudarydama GPI-AP turtingą COPII pūslelę (31–33). Todėl sukūrėme dvigubą mutantą, kuris sujungė šių atskirų baltymų (p24 komplekso komponento Emp24, GPI-glikano pertvarkymo fermento Ted1 ir specifinio COPII subvieneto Lst1) deleciją su sec31-1 mutanto paderme, ir ištyrėme, ar įmanoma sudaryti Gas1 klasterį GFP (3 pav.). Pastebėjome, kad sec31-1emp24Δ ir sec31-1ted1Δ mėsoje Gas1-GFP daugiausia yra nesikaupęs ir pasiskirstęs po visą ER membraną, kaip anksčiau buvo pastebėta sec31-1 GhLag1 mėsoje, o sec31-1lst1Δ mėsoje Gas1-GFP panašiai atrodo kaip sec31-1. Šie rezultatai rodo, kad be C26 keramido buvimo ER membranoje, Gas1-GFP klasterizacijai taip pat reikia prisijungti prie p24 komplekso ir nereikalauja specifinio Lst1 pritraukimo. Tada ištyrėme galimybę, kad keramido grandinės ilgis ER membranoje gali reguliuoti Gas1-GFP prisijungimą prie p24. Tačiau nustatėme, kad C18-C16 keramido buvimas membranoje neturi įtakos p24 komplekso rekonstruotiems GPI-glikanams (S3 ir S4, A ir B paveikslai) arba prisijungimui prie GPI-AP ir GPI-AP eksportavimo gebėjimui. Pritraukti COPII potipį Lst1 (S4C paveikslas). Todėl nuo C26 keramido priklausomas klasterizavimas nereikalauja baltymų sąveikos su skirtingais ER baltymų eksporto mechanizmais, bet palaiko alternatyvų rūšiavimo mechanizmą, kurį lemia lipidų ilgis. Tada išanalizavome, ar keramido acilo grandinės ilgis ER membranoje yra svarbus efektyviam Gas1-GFP klasifikavimui kaip selektyviam ERES. Kadangi GhLag1 padermės Gas1 su trumpos grandinės keramidu palieka ER ir patenka į plazminę membraną (S5 pav.), manome, kad jei rūšiavimą lemia keramido acilo grandinės ilgis, GhLag1 padermės Gas1 gali būti nukreiptas ir kirsti. ERES prekės su ta pačia membrana.
(A) GhLag1 ląstelės membranoje daugiausia yra trumpesnių C18-C16 keramidų, o Gas1-GFP GPI inkaras vis dar turi tą patį C26 IPC kaip ir laukinio tipo ląstelės. Viršuje: keramido acilo grandinės ilgio analizė laukinio tipo (Wt) ir GhLag1p padermių ląstelių membranose, atlikta masių spektrometrijos (MS) metodu. Duomenys rodo bendro keramido procentinę dalį. Trijų nepriklausomų eksperimentų vidurkis. Paklaidos juosta = SD. Dvipusis neporinis t testas. **** P <0,0001. Apatinė panelė: MS analizė, skirta Gas1-GFP (GPI-IPC) GPI inkaro IPC acilo grandinės ilgiui, išreikštam laukinio tipo ir GhLag1p padermėse. Duomenys rodo bendro IPC signalo procentinę dalį. Penkių nepriklausomų eksperimentų vidurkis. Paklaidos juosta = SD. Dvipusis neporinis t testas. ns, nesvarbu. P = 0,9134. (B) Galaktozės sukeltą Gas1-GFP ekspresuojančių sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ ir sec31-1lst1Δ ląstelių fluorescencinės mikrografijos buvo inkubuojamos 37 °C temperatūroje 30 minučių ir po 24 °C perduotos įprastinei fluorescencinei mikroskopijai atlikti. Balta rodyklė: ER Gas1-GFP klasteris. Atvira rodyklė: nesusikaupęs Gas1-GFP pasiskirsto po visą ER membraną, rodantis ER būdingą branduolio žiedo dažymą. Skalės juosta, 5 μm. (C) (B) punkte aprašytos fotomikrografijos kiekybinis įvertinimas. Vidutinis ląstelių su taškine Gas1-GFP struktūra procentas. Trijuose nepriklausomuose eksperimentuose n≥300 ląstelių. Paklaidos juosta = SD. Dvipusis neporinis t testas. **** P <0,0001.
Norėdami tiesiogiai išspręsti šią problemą, atlikome Gas1-GFP ir Mid2-iRFP SCLIM vizualizaciją GhLag1 baltyme su temperatūrai jautriu sec31-1 mutanto aleliu (4 pav. ir S4 vaizdo įrašas). Po to, kai ER buvo išlaikytas 37 °C temperatūroje ir vėliau išleistas 24 °C temperatūroje, didžioji dalis naujai susintetinto Gas1-GFP nebuvo susikaupusi ir pasiskirstė po visą ER membraną, kaip buvo galima stebėti įprastiniais mikroskopais (4 pav., A ir B). Be to, didelė ERES dalis (67 %) apima dviejų tipų krovinius, esančius kartu (4D pav.). 4C paveikslo 1 ir 2 panelėse pateikti du tipiški ERES pavyzdžiai su persidengiančiais Gas1-GFP ir Mid2-GFP. Be to, abi prekės buvo įtrauktos į tą pačią ERES (4E pav., 3 panelė ir S4 vaizdo įrašas). Todėl mūsų rezultatai rodo, kad keramido acilo grandinės ilgis ER membranoje yra svarbus ER baltymų agregacijos ir klasifikacijos veiksnys.
Sec31-1 GhLag1 ląstelės, ekspresuojančios galaktozės sukeltus sekretus, Gas1-GFP (GPI-AP, žalia) ir Mid2-iRFP (TMP, mėlyna) bei konstitucinis ERES žymėtas Sec13-mCherry (ERES, rausvai raudona). Inkubuokite 37 °C temperatūroje. Tęskite 30 minučių, sumažinkite temperatūrą iki 24 °C, kad išsiskirtų sekretai, ir po 20 minučių nufotografuokite su SCLIM. (A–C) Tipiniai 2D projekcijos vaizdai (A; mastelio juosta, 1 μm) arba 3D ląstelių pusrutulio vaizdai (B ir C; mastelio vienetas, 0,45 μm) iš 10 z pjūvių, pažymėtų kroviniu ir ERES. Apatinėje panelėje (B) ir panelėje (C) rodomi apdoroti vaizdai, kuriuose rodomos tik ERES esančios prekės (rausvai raudona) [Gas1-GFP (pilka) ir Mid2-iRFP (šviesiai mėlyna)]. (C) Baltai užpildyta rodyklė: ERES, prekės persidengia. Tuščia rodyklė: ERES yra tik vienas elementas. Apatinė panelė: pasirinktame ERES yra persidengiančių krovinių (1 ir 2), pažymėtų (C). Mastelio juosta, 100 nm. (D) (C) punkte aprašytos fotomikrografijos kiekybinis įvertinimas. Į sec31-1 ir sec31-1 GhLag1 vienetus įtrauktas tik vienas krovinys (Gas1-GFP arba Mid2-iRFP) ir vidutinis ERES procentas izoliuotam kroviniui ir persidengiančiam kroviniui. Trijuose nepriklausomuose eksperimentuose n = 432 54 ląstelėse (sec31-1) ir n = 430 47 ląstelėse (sec31-1 GhLag1). Paklaidos juosta = SD. Dvipusis neporinis t testas. *** P = 0,0002 (sec31-1) ir ** P = 0,0031 (sec31-1 GhLag1). (E) pasirinkto ERES 3D vaizdas su persidengiančiu kroviniu (3), pažymėtu (C). „Gas1-GFP“ (žalia) ir „Mid2-iRFP“ (mėlyna) artėja prie ERES (rausvai raudonos) iš tos pačios pusės ir lieka toje pačioje ERES ribojamoje zonoje. Mastelio juosta, 100 nm.
Šis tyrimas pateikia tiesioginių in vivo įrodymų, kad lipidų pagrindu sukaupti baltymų kroviniai sekreciniame kelyje klasifikuojami į selektyvias eksporto vietas, ir atskleidžia acilo grandinės ilgio svarbą klasifikavimo selektyvumui. Naudodami galingą ir pažangiausią mikroskopijos techniką, vadinamą SCLIM, pademonstravome naujai susintetintą Gas1-GFP (pagrindinį plazminės membranos GPI-AP su labai ilga acilo grandinės (C26) keramido lipidų dalimi) mielėse). Atskiruose ER susitelkę regionai yra susiję su specifiniais ERES, o transmembraniniai sekretuojami baltymai yra pasiskirstę visoje ER membranoje (1 pav.). Be to, šių dviejų tipų produktai selektyviai patenka į skirtingus ERES (2 pav.). Ląstelinio keramido acilo grandinės ilgis membranoje sumažinamas nuo C26 iki C18-C16, Gas1-GFP klasteris suardomas į atskirą ER regioną, o Gas1-GFP nukreipiamas iš ER su transmembraniniu baltymu per tą patį ERES (3 pav. ir 34 pav.).
Nors GPI-AP naudoja specializuotą baltymų mechanizmą ER išėjimui, nustatėme, kad nuo C26 keramido priklausomas atskyrimas nepriklauso nuo skirtingų baltymų sąveikų, kurios gali lemti ERES specializaciją (S4 ir S5 paveikslai). Vietoj to, mūsų išvados patvirtina alternatyvų klasifikavimo mechanizmą, kurį lemia lipidų pagrindu veikiantis baltymų klasterizavimas ir vėlesnis kitų krovinių pašalinimas. Mūsų stebėjimai rodo, kad su konkrečiu ERES susijusiame Gas1-GFP regione arba klasteryje trūksta transmembraninio sekreto baltymo Mid2-iRFP, o tai rodo, kad nuo C26 keramido priklausomas GPI-AP klasteris palengvins jų patekimą į atitinkamą ERES ir tuo pačiu metu pašalins transmembraninius sekretus. Sekretai patenka į šį konkretų ERES (1 ir 2 paveikslai). Priešingai, C18-C16 keramidų buvimas ER membranoje nesukelia GPI-AP regionų ar klasterių susidarymo, todėl jie neišskiria ir nepakeičia transmembraninių sekretų baltymų tame pačiame ERES (3 ir 4 paveikslai). Todėl siūlome, kad C26 ceramidas skatintų atskyrimą ir klasifikavimą, palengvindamas su specifiniais ERES susijusių baltymų klasterizaciją.
Kaip pasiekti šį C26 keramido priklausomą klasterizaciją į konkrečią ER sritį? Membraninio keramido polinkis atsiskirti šoniniu būdu gali lemti, kad GPI-AP ir C26 keramidas sudarytų mažus ir akimirksniu sutvarkytus lipidus netaisyklingesnėje ER membranos lipidų aplinkoje, kurioje yra trumpesnių ir nesočiųjų glicerolipidų. Kokybiški klasteriai (17, 18). Šie maži laikini klasteriai, prisijungę prie p24 komplekso, gali būti toliau sulieti į didesnius, stabilesnius klasterius (34). Remdamiesi tuo, parodėme, kad C26 Gas1-GFP turi sąveikauti su p24 kompleksu, kad susidarytų didesni matomi klasteriai (3 pav.). p24 kompleksas yra heterozigotinis oligomeras, sudarytas iš keturių skirtingų p24 transmembraninių baltymų mielėse (35), kuris užtikrina daugiavalentį ryšį, o tai gali lemti mažų GPI-AP klasterių kryžminį susiejimą, taip sukuriant didesnį stabilų klasterį (34). Sąveika tarp GPI-AP baltymų ektodomenų taip pat gali prisidėti prie jų agregacijos, kaip parodyta jų Goldžio transportavimo metu žinduolių poliarizuotose epitelio ląstelėse (36). Tačiau, kai ER membranoje yra C18-C16 keramido, kai p24 kompleksas jungiasi prie Gas1-GFP, dideli atskiri klasteriai nesusidaro. Pagrindinis mechanizmas gali priklausyti nuo specifinių ilgos acilo grandinės keramido fizinių ir cheminių savybių. Dirbtinių membranų biofiziniai tyrimai rodo, kad nors ir ilgos (C24), ir trumpos (C18-C16) acilo grandinės keramidai gali sukelti fazių atskyrimą, tik ilgos acilo grandinės keramidai (C24) gali skatinti didelį kreivumą ir plėvelės lenkimą, kad pakeistų plėvelės formą. Abipusės nuorodos (17, 37, 38). Įrodyta, kad TMED2, žmogaus Emp24 homologo, transmembraninė spiralė selektyviai sąveikauja su C18 keramido pagrindu pagamintu sfingomielinu citoplazminėse skiltelėse (39). Naudodami molekulinės dinamikos (MD) modeliavimą, nustatėme, kad tiek C18, tiek C26 keramidai kaupiasi aplink Emp24 transmembraninės spiralės citoplazmines skilteles ir turi panašias preferencijas (S6 pav.). Verta paminėti, kad tai rodo, jog Emp24 transmembraninė spiralė gali lemti asimetrinį lipidų pasiskirstymą membranoje. Tai naujausi rezultatai, paremti žinduolių ląstelėmis. Panašūs MD modeliavimai taip pat rodo eterinių lipidų buvimą (40). Todėl spėjame, kad C26 keramidas dviejose ER26 skiltelėse yra lokaliai praturtintas. Kai GPI-AP luminalinėse skiltelėse tiesiogiai jungiasi prie daugiavalenčio p24 ir C26 keramidas kaupiasi aplink p24 citoplazminėse skiltelėse, tai gali skatinti lydinčią baltymų agregaciją ir membranos išlinkimą, susidarantį per pirštus (41), dėl ko GPI-AP atsiskiria į atskiras sritis, greta ERES, o tai taip pat palanku labai išlenktoms ER membranos sritims (42). Ankstesnės ataskaitos patvirtino siūlomą mechanizmą (43, 44). Daugiavalentis oligolektinų, patogenų ar antikūnų prisijungimas prie keramido pagrindo glikosfingolipidų (GSL) plazminėje membranoje sukelia didelę GSL agregaciją, sustiprina fazių atsiskyrimą ir sukelia membranos deformaciją bei internalizaciją (44). Iwabuchi ir kt. (43) Nustatyta, kad esant ilgoms (C24), bet ne trumpoms (C16) acilo grandinėms, prie GSL laktozilceramido prisijungęs daugiavalentis ligandas sukėlė didelių sankaupų susidarymą ir membranos invaginaciją, o citoplazmos Lyn tarpininkaujamas signalo perdavimas ant lapelių yra susipynęs su acilo grandinėmis susietuose neutrofiluose.
Žinduolių poliarizuotose epitelio ląstelėse anti-Golgi tinklo (TGN) koncentracija viršūninės plazminės membranos lygyje kontroliuoja GPI-AP atskyrimą ir rūšiavimą (10, 45). Šią agregaciją skatina GPI-AP oligomerizacija (36), tačiau ji taip pat gali priklausyti nuo mielėse randamo keramido grandinės ilgio. Nors žinduolių GPI-AP turi eterio lipidų pagrindu veikiantį inkarą, o jo cheminė struktūra labai skiriasi nuo labai ilgos acilo grandinės keramido, neseniai atliktame tyrime nustatyta, kad abu lipidai turi evoliuciškai panašias fizines ir chemines savybes bei funkciją (40). Todėl eterio lipido dalis žinduolių ląstelėse gali būti panaši į C26 keramidą mielėse, o jos vaidmuo yra jungtis su ilgos grandinės keramidu membranoje, siekiant skatinti GPI-AP agregaciją ir rūšiavimą. Nors ši galimybė dar turi būti tiesiogiai patikrinta, ankstesni duomenys patvirtina, kad ilgos acilo grandinės keramido transportavimas į Golgi kūną nėra atliekamas citoplazminių pernašos baltymų, o priklauso nuo GPI inkarų sintezės, kaip ir mielėse. Todėl atrodo, kad evoliucinis konservatyvus mechanizmas gali selektyviai kartu transportuoti labai ilgą acilo grandinės ceramidą ir GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) toje pačioje transportavimo pūslelėje.
Mielių ir žinduolių poliarizuotų epitelio ląstelių sistemose GPI-AP agregacija ir atsiskyrimas nuo kitų plazminės membranos baltymų vyksta dar prieš pasiekiant ląstelės paviršių. Paladino ir kt. (48) nustatė, kad žinduolių poliarizuotų epitelio ląstelių TGN GPI-AP klasterizacija yra būtina ne tik selektyviai GPI-AP klasifikacijai pagal apikalinę plazminę membraną, bet ir reguliuoja GPI-AP klasterizacijos organizaciją ir jos biologinį aktyvumą. Ląstelės paviršius. Mielėse šis tyrimas parodė, kad nuo C26 keramido priklausomas GPI-AP klasteris ER gali reguliuoti GPI-AP klasterio organizaciją ir funkcinį aktyvumą plazminėje membranoje (24, 49). Remiantis šiuo modeliu, GhLag1 ląstelės yra alergiškos GPI inhibitoriams arba vaistams, kurie veikia ląstelės sienelės vientisumą (28), o funkcinių Gas1-GFP klasterių (49), projektuojamų mielių ląstelių poravimosi metu, poreikis rodo galimas hLag1 ląstelių fiziologines G pasekmes. GPI-AP klaida. Tačiau tolesni tyrimai, ar ląstelės paviršiaus funkcinė organizacija buvo užprogramuota iš ER naudojant lipidų ilgiu pagrįstą rūšiavimo metodą, bus mūsų būsimų tyrimų objektas.
Šiame darbe naudotos Saccharomyces cerevisiae padermės išvardytos S1 lentelėje. Gyvų ląstelių vaizdavimui skirtos SCLIM padermės MMY1583 ir MMY1635 buvo sukonstruotos W303 fone. Šios padermės, ekspresuojančios Sec13-mCherry su fluorescencinio baltymo žyme, buvo sukonstruotos naudojant polimerazės grandininės reakcijos (PGR) metodą, naudojant pFA6a plazmidę kaip šabloną (23). Padermė, ekspresuojanti Mid2-iRFP, pažymėtą fluorescenciniu baltymu, kontroliuojant GAL1 promotoriui, buvo sukonstruota taip: iRFP-KanMx sekos iš pKTiRFP-KAN vektoriaus (E. O'Shea dovana, Addgene plazmidės numeris 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; tyrimų išteklių identifikatorius (RRID): Addgene_64687) PGR amplifikacija ir įterpimas į endogeninio Mid2 C galą. Amplifikavus Mid2-iRFP genomo seką ir klonavus ją į GAL1 promotorių, ji buvo integruota į integracijos plazmidės pRS306 Not I-Sac I vietą. Gauta plazmidė pRGS7 buvo linearizuota su Pst I, kad būtų integruota į URA3 lokusą.
Gas1-GFP susiliejimo genas yra ekspresuojamas kontroliuojant GAL1 promotoriui centromeros (CEN) plazmidėje, kuri sukonstruota taip. Gas1-GFP seka buvo amplifikuota PGR metodu iš pRS416-GAS1-GFP plazmidės (24) (L. Popolo dovana) ir klonuota į CEN plazmidės pBEVY-GL LEU2 (C dovana) Xma I–Xho I vietą. Miller; Addgene plazmidės numeris 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). Gauta plazmidė buvo pavadinta pRGS6. Axl2-GFP susiliejimo genas taip pat yra ekspresuojamas kontroliuojant pBEVY-GL LEU2 vektoriaus GAL1 promotoriui, o jo konstrukcija yra tokia. Axl2-GFP seka buvo amplifikuota iš pRS304-p2HSE-Axl2-GFP plazmidės (23) PGR metodu ir klonuota į pBEVY-GL LEU2 vektoriaus Bam HI-Pst I vietą. Gauta plazmidė buvo pavadinta pRGS12. Šiame tyrime naudotų oligonukleotidų seka pateikta S2 lentelėje.
Padermė buvo papildyta 0,2 % adenino ir 2 % gliukozės [YP-dekstrozės (YPD)], 2 % rafinozės [YP-rafinozės] turtinga mielių ekstrakto baltymų p (YP) terpe (1 % mielių ekstrakto ir 2 % baltymų ept. (YPR)] arba 2 % galaktozės [YP-galaktozės (YPG)] kaip anglies šaltiniu, arba sintetine minimalia terpe (0,15 % mielių azoto bazės ir 0,5 % amonio sulfato), kad būtų papildytos tinkamos aminorūgštys ir bazės, reikalingos mitybai, ir kurioje buvo 2 % gliukozės (sintetinė gliukozės minimali terpė) arba 2 % galaktozės (sintetinė galaktozės minimali terpė) kaip anglies šaltinis.
Realaus laiko vaizdavimui temperatūrai jautrios sec31-1 mutantinės ląstelės, ekspresuojančios konstrukciją su GAL1 promotoriumi, buvo auginamos YPR terpėje 24 °C temperatūroje per naktį iki vidurio log fazės. Po indukcijos YPG terpėje 24 °C temperatūroje 1 valandą, ląstelės buvo inkubuojamos SG terpėje 37 °C temperatūroje 30 minučių, o po to perkeltos į 24 °C temperatūrą, kad išsiskirtų iš sekrecijos bloko. Konkanavalinas A buvo naudojamas ląstelėms fiksuoti ant stiklinio stiklelio ir vaizduoti naudojant SCLIM. SCLIM yra „Olympus IX-71“ apverstos fluorescencijos mikroskopo ir „UPlanSApo 100×1,4“ skaitmeninės apertūros aliejinio lęšio („Olympus“), didelio greičio ir didelio signalo ir triukšmo santykio besisukančio disko konfokalinio skaitytuvo („Yokogawa Electric“), individualaus spektrometro ir individualaus aušinimo derinys. Sistemos vaizdo stiprintuvas („Hamamatsu Photonics“) gali sudaryti didinamųjų lęšių sistemą su galutiniu ×266,7 didinimu ir krūvio susietą kamerą, kuri daugina elektronus („Hamamatsu Photonics“) (21). Vaizdų gavimas atliekamas naudojant specialią programinę įrangą („Yokogawa Electric“). 3D vaizdams gauti naudojome specialiai pagamintą pjezoelektrinę pavarą, kuri vertikaliai vibravo objektyvo lęšį, ir surinkome optines dalis 100 nm atstumu viena nuo kitos į krūvą. Z formos vaizdas konvertuojamas į 3D vokselio duomenis, o teorinė taškų sklaidos funkcija, naudojama besisukančio disko konfokaliniam mikroskopui, dekonvoliucijos apdorojimui naudojama naudojant „Volocity“ programinę įrangą („PerkinElmer“). Naudojant „Volocity“ programinę įrangą, kad būtų automatiškai nustatytos slenksčio vertės kolokacijos analizei, buvo išmatuotas ERES, įskaitant krovinį. Linijinė skenavimo analizė atlikta naudojant „MetaMorph“ programinę įrangą („Molecular Devices“).
Statistiniam reikšmingumui nustatyti naudokite „GraphPad Prism“ programinę įrangą. Taikant dvipusį Stjudento t testą ir paprastą vienfaktorinę dispersinės analizės (ANOVA) testą, skirtumai tarp grupių laikomi turinčiais reikšmingą įtaką P < 0,05 (*).
Gas1-GFP fluorescencinei mikroskopijai log fazės ląstelės buvo auginamos per naktį YPD terpėje ir surenkamos centrifuguojant, du kartus praplaunamos fosfatiniu buferiniu tirpalu ir inkubuojamos ant ledo mažiausiai 15 minučių, o tada tiriamos mikroskopu, kaip aprašyta anksčiau (24). Duomenų gavimui buvo naudojamas „Leica DMi8“ mikroskopas (HCX PL APO 1003/1.40 oil PH3 CS) su objektyvu, L5 (GFP) filtru, „Hamamatsu“ kamera ir „Application Suite X“ (LAS X) programine įranga.
Mėginiai buvo denatūruoti SDS mėginių buferiu 65 °C temperatūroje 10 minučių, o po to atskirti SDS-poliakrilamido gelio elektroforeze (PAGE). Imunoblotinei analizei į kiekvieną juostą buvo įpilta 10 μl mėginio. Pirminis antikūnas: naudojamas triušio polikloninis anti-Gas1, praskiedtas santykiu 1:3000, triušio polikloninis anti-Emp24, praskiedtas santykiu 1:500, ir triušio polikloninis anti-GFP (dovana iš H. Riezman), praskiedtas santykiu 1:3000. Pelės monokloninis anti-Pgk1 antikūnas buvo naudojamas praskiedtas santykiu 1:5000 (dovana iš J. de la Cruz). Antrinis antikūnas: krienų peroksidaze (HRP) konjuguotas ožkos anti-triušio imunoglobulinas G (IgG), naudojamas praskiedtas santykiu 1:3000 (Pierce). HRP konjuguotas ožkos anti-pelės IgG buvo naudojamas praskiedtas santykiu 1:3000 (Pierce). Imuninio atsako zona buvo stebima chemiliuminescencijos metodu naudojant „SuperSignal West Pico“ reagentą („Thermo Fisher Scientific“).
Kaip aprašyta (31), su praturtinta ER frakcija buvo atliktas natūralus imunoprecipitacijos eksperimentas. Trumpai tariant, mielių ląstelės du kartus buvo nuplautos TNE buferiu [50 mM tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM fenilmetilsulfonilfluorido ir proteazės inhibitoriaus mišinys], esant 600 nm bangos ilgiui (OD600) ir 100 optiniam tankiui. Jis buvo sudaužytas stiklo karoliukais, o tada ląstelių nuosėdos ir stiklo karoliukai pašalinti centrifuguojant. Supernatantas buvo centrifuguojamas 17 000 g greičiu 15 minučių 4 °C temperatūroje. Granulės buvo resuspenduotos TNE ir pridėta rusmenės saponino iki 1 % galutinės koncentracijos. Suspensija buvo inkubuojama 1 valandą sukant 4 °C temperatūroje, o tada netirpūs komponentai pašalinti centrifuguojant 13 000 g greičiu 4 °C temperatūroje 60 minučių. Norint atlikti Gas1-GFP imunoprecipitaciją, pirmiausia mėginį 1 valandą inkubuokite su tuščiais agarozės rutuliukais („ChromoTek“) 4 °C temperatūroje, o tada 3 valandas inkubuokite su GFP-Trap_A („ChromoTek“) 4 °C temperatūroje. Imunoprecipituotos rutuliukai buvo penkis kartus plaunamos TNE, kuriame yra 0,2 % digoksigenino, eliuotos SDS mėginio buferiu, atskirtos SDS-PAGE ir analizuojamos imunoblotavimo metodu.
Kaip aprašyta (31), kryžminio sujungimo nustatymas buvo atliktas su praturtinta ER frakcija. Trumpai tariant, praturtinta ER frakcija buvo inkubuojama su 0,5 mM ditiobis(sukcinimidilo propionatu) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, JAV; 20 °C, 20 min.). Kryžminio sujungimo reakcija buvo sustabdyta pridedant glicino (galutinė koncentracija 50 mM, 5 minutės, 20 °C).
Kaip aprašyta anksčiau (50), buvo atlikta keramido MS analizė laukinio tipo ir GhLag1 padermėse. Trumpai tariant, ląstelės buvo auginamos iki eksponentinės fazės (nuo 3 iki 4 OD600 vienetų/ml) YPD terpėje 30 °C temperatūroje ir surinkta 25 × 107 ląstelių. Jų metabolizmas sustabdytas trichloracto rūgštimi. Naudotas ekstrahavimo tirpiklis [etanolis, vanduo, eteris, piridinas ir 4,2 N amonio hidroksidas (15:15:5:1:0,018 v/v)] ir 1,2 nmol vidinio standarto C17 keramido (860517, Avanti polinio lipido kokybės). Naudotas monometilamino reagentas [metanolis, vanduo, n-butanolis ir metilamino tirpalas (4:3:1:5 v/v)], kad būtų atlikta lengva šarminė ekstrakto hidrolizė, o tada druska pašalinama vandeniu prisotintu n-butanoliu. Galiausiai ekstraktas buvo resuspenduotas teigiamo režimo tirpiklyje [chloroformas/metanolis/vanduo (2:7:1) + 5 mM amonio acetatas] ir įšvirkštas į masių spektrometrą. Sfingolipidų molekulėms identifikuoti ir kiekybiškai įvertinti buvo atliktas daugiareakcinis stebėjimas (MRM). TSQ Vantage tretinis kvadrupolinis masių spektrometras („Thermo Fisher Scientific“) aprūpintas robotiniu nanosrautų jonų šaltiniu „Nanomate HD“ („Advion Biosciences“, Itaka, Niujorkas) lipidų analizei. Susidūrimo energija optimizuota kiekvienai ceramidų kategorijai. MS duomenys gauti teigiamu režimu. Kiekvienam biologiniam pakartojimui lipidų signalas yra trijų nepriklausomų matavimų mediana.
Kaip aprašyta (31), ląstelės (800 × 107), ekspresuojančios Gas1-GFP, buvo natūraliai imunoprecipituotos. Išgrynintas Gas1-GFP buvo atskirtas SDS-PAGE metodu ir perkeltas ant polivinilidenfluorido (PVDF) membranos. Baltymas buvo vizualizuotas dažant PVDF juoduoju amidu. Gas1-GFP juosta buvo iškirpta iš PVDF ir 5 kartus plaunama metanoliu ir vieną kartą skysčių chromatografijos-MS (LC-MS) klasės vandeniu. Membranos juostelę inkubuojant su 500 μl 0,3 M NaOAc (pH 4,0), buferiu ir 500 μl šviežiai ištirpinto 1 M natrio nitrito mišinio 37 °C temperatūroje 3 valandas, lipidų frakcija išsiskiria iš Gas1-GFP ir lizuojama. Inozino fosfato keramido išsiskyrimas tarp gliukozamino ir inozitolio (51). Po to membranos juostelė buvo keturis kartus plaunama LC-MS klasės vandeniu, džiovinama kambario temperatūroje ir laikoma azoto atmosferoje -80 °C temperatūroje iki analizės. Kontroliniam bandymui kiekvienam eksperimentui buvo naudojamas tuščias PVDF membranos mėginys. Iš Gas1-GFP išgauti lipidai buvo analizuojami MS metodu, kaip aprašyta (50). Trumpai tariant, PVDF juostelės, kuriose buvo GPI-lipidų, buvo resuspenduotos 75 μl neigiamo pelėsio tirpiklio [chloroformas/metanolis (1:2) + 5 mM amonio acetatas] ir atlikta sfingolipidų rūšių elektrospray jonizacijos (ESI)-MRM/MS analizė (TSQ Vantage). Šiuo atveju MS duomenys buvo gauti neigiamų jonų režimu.
Kaip minėta anksčiau, GPI inkaro lipidinė dalis buvo atskirta nuo [3H]-inozitoliu žymėto GPI-AP (16). Lipidai buvo atskirti plonasluoksnės chromatografijos metodu, naudojant tirpiklių sistemą (55:45:10 chloroformas-metanolis-0,25 % KCl), ir vizualizuoti naudojant FLA-7000 (Fujifilm).
Ląstelės, ekspresuojančios Gas1-GFP (600 × 107), buvo du kartus plaunamos TNE buferiu su TNE buferiu, sudaužytos stiklo karoliukais ir centrifuguotos, kad būtų pašalintos ląstelių nuosėdos ir stiklo karoliukai. Supernatantas buvo centrifuguojamas 17 000 g greičiu 1 valandą 4 °C temperatūroje. Granulės buvo plaunamos TNE ir inkubuojamos su 1 U PI-PLC (Invitrogen) TNE tirpale, kuriame yra 0,2 % rusmenės saponino, 1 valandą 37 °C temperatūroje. Po fermentinio apdorojimo membrana buvo pašalinta centrifuguojant 17 000 g greičiu 4 °C temperatūroje 1 valandą. Norint imunoprecipituoti Gas1-GFP, supernatantas buvo inkubuojamas su GFP-Trap_A (ChromoTek) 4 °C temperatūroje per naktį. Išgrynintas Gas1-GFP, atskirtas SDS-PAGE, buvo nudažytas briliantiniu mėlynuoju Coomassie dažais. Gas1-GFP dažymo juosta buvo nupjauta nuo pilkos spalvos aplink akveduką, o po alkilinimo jodoacetamidu ir redukcijos ditiotreitoliu, atliktas virškinimas gelyje tripsinu. Tripsino peptidai ir peptidai su GPI-glikanais buvo ekstrahuoti ir išdžiovinti. Išdžiovintas peptidas buvo ištirpintas 20 μl vandens. Į skystąjį skystį įšvirkščiama dalis (8 μl). Peptidams atskirti specifinėmis gradiento sąlygomis buvo naudojama oktadecilsilano (ODS) kolonėlė („Develosil 300ODS-HG-5“; vidinis skersmuo 150 mm × 1,0 mm; „Nomura Chemical“, Aičio prefektūra, Japonija). Mobilioji fazė yra tirpiklis A (0,08 % skruzdžių rūgšties) ir tirpiklis B (0,15 % skruzdžių rūgšties 80 % acetonitrilo tirpale). Kolonėlė buvo eliuota tirpikliu A „Accela HPLC“ sistema („Thermo Fisher Scientific“, Bostonas, Masačusetsas) 55 minutes, 50 μl min-1 srauto greičiu, o tada tirpiklio B koncentracija buvo padidinta iki 40 %. (JAV). Eliuatas buvo nuolat pilamas į ESI jonų šaltinį, o tripsiniai peptidai ir peptidai su GPI-glikanais buvo analizuojami naudojant LTQ Orbitrap XL (hibridinį tiesinį jonų gaudyklės-orbitinės gaudyklės masių spektrometrą; „Thermo Fisher Scientific“). MS sistemoje kapiliarinio šaltinio įtampa buvo nustatyta 4,5 kV, o pernešimo kapiliarinio indo temperatūra buvo palaikoma 300 °C. Kapiliarinė įtampa ir vamzdelio lęšio įtampa buvo atitinkamai 15 V ir 50 V. MS duomenys gauti teigiamų jonų režimu (skiriamoji geba – 60 000; masės tikslumas – 10 milijoninių dalių), esant 300/m/z masės ir krūvio santykiui (m/z) 3000. MS/MS duomenys gauti per jonų gaudyklę LTQ Orbitrap XL įrenginyje [pirmieji 3 skaitmenys, nuo kurių priklauso duomenys, yra susidūrimo sukelta disociacija (CID)].
MD modeliavimas buvo atliktas naudojant GROMACS (52) programinę įrangą ir MARTINI 2 jėgos lauką (53–55). CHARMM GUI membranų kūrimo programa (56, 57) buvo panaudota dvisluoksnio, turinčio dioleoilfosfatidilcholiną (DOPC) ir Cer C18 arba DOPC ir Cer C26, sukonstravimui. Cer C26 topologija ir koordinatės gautos iš DXCE, pašalinant papildomus karoliukus nuo sfingozino uodegos. Toliau aprašytu procesu subalansuokite dvigubą sluoksnį ir jį paleiskite, tada, naudodami paskutines sistemos koordinates, sukonstruokite sistemą, kurioje yra Emp24. Mielių Emp24 transmembraninis domenas (173–193 liekanos) buvo sukonstruotas kaip α-spiralė, naudojant vizualinį MD (VMD) molekulinės struktūros įrankį (58). Tada, pašalinus persidengiančius lipidus, baltymas buvo stambiai granuliuotas ir įterptas į dvisluoksnį naudojant CHARMM GUI. Galutinėje sistemoje yra 1202 DOPC ir 302 Cer C26 arba 1197 DOPC ir 295 Cer C18 bei Emp24. Sistema jonizuojama iki 0,150 M koncentracijos. Dviem dvisluoksnėms kompozicijoms atlikti keturi nepriklausomi pakartojimai.
Lipidų dvisluoksnis balansuojamas naudojant CHARMM GUI procesą, kuris apima 405 000 žingsnių sumažinimą ir balansavimą, kur padėties apribojimai palaipsniui mažinami ir panaikinami, o laiko žingsnis padidinamas nuo 0,005 ps iki 0,02 ps. Po balansavimo gaunama 6 µs su 0,02 ps laiko žingsniu. Įterpus Emp24, naudojamas tas pats CHARMM GUI procesas sistemai sumažinti ir subalansuoti, o tada paleidžiamas 8 s gamyboje.
Visose sistemose balansavimo proceso metu slėgį kontroliuoja Berendseno barostatas (59), o gamybos proceso metu – Parrinello-Rahmano barostatas (60). Visais atvejais vidutinis slėgis yra 1 baras ir naudojama pusiau izotropinė slėgio susiejimo schema. Balansavimo ir gamybos procese baltymų, lipidų ir tirpiklio dalelių temperatūrai sujungti naudojamas termostatas (61) su greičio perkalibravimu. Visos operacijos metu tikslinė temperatūra yra 310 K. Nesurišanti sąveika apskaičiuojama sudarant porų sąrašą naudojant Verleto schemą su 0,005 buferio tolerancija. Kulono terminas apskaičiuojamas naudojant reakcijos lauką ir 1,1 nm ribinį atstumą. Vanderio Valso terminas naudoja ribinę schemą su 1,1 nm ribiniu atstumu, o Verleto ribinė schema naudojama galimam dreifui (62).
Naudojant VMD, ribinis bangos ilgis tarp DOPC fosfato granulių arba keramido AM1 granulių ir baltymo yra 0,7 nm, ir apskaičiuojamas lipidų, kurie sąveikauja su baltymu, skaičius. Pagal šią formulę apskaičiuokite išeikvojimo-sotinimo (DE) koeficientą, kaip nurodyta (63): DE koeficientas = (bendras lipidų kiekis baltyme 0,7) baltyme 0,7 (Cer kiekis bendruose lipiduose)
Pateikta vertė gaunama kaip vidurkis, o paklaidų juostos yra keturios nepriklausomos SE kopijos. DE faktoriaus statistinis reikšmingumas apskaičiuojamas t testu [(vidurkis DE-faktorius-1)/SE]. P vertė apskaičiuojama pagal vienpusį skirstinį.
Sistemos, kurioje yra Emp24, dvimatis šoninis tankio žemėlapis per paskutines 250 kreivės ns buvo apskaičiuotas naudojant GROMACS įrankį. Norint gauti ceramido praturtėjimo/sumažėjimo žemėlapį, Cer tankio žemėlapis padalijamas iš Cer ir DOPC žemėlapių sumos, o tada padalijamas iš Cer koncentracijos organizme. Naudojama ta pati spalvų žemėlapio skalė.
Papildomos šio straipsnio medžiagos ieškokite adresu http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
Tai yra atviros prieigos straipsnis, platinamas pagal „Creative Commons Attribution-NonCommercial“ licenciją, kuri leidžia naudoti, platinti ir atgaminti bet kokioje terpėje, jei galutinis panaudojimas nėra skirtas komercinei naudai ir jei prielaida yra ta, kad originalus kūrinys yra teisingas. Nuoroda.
Pastaba: prašome jūsų pateikti savo el. pašto adresą tik tam, kad asmuo, kurį rekomenduojate puslapiui, žinotų, jog norite, kad jis matytų el. laišką ir kad tai nėra šlamštas. Mes neužfiksuosime jokių el. pašto adresų.
Šis klausimas naudojamas norint patikrinti, ar esate lankytojas, ir užkirsti kelią automatiniam šlamšto siuntimui.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez (S.Sergio Lopez), S. (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuelis Munizas
Didelės skiriamosios gebos 3D vaizdavimas realiuoju laiku atskleidžia keramido grandinės ilgio svarbą baltymų rūšiavimui selektyviose išvesties vietose.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez (S.Sergio Lopez), S. (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuelis Munizas
Didelės skiriamosios gebos 3D vaizdavimas realiuoju laiku atskleidžia keramido grandinės ilgio svarbą baltymų rūšiavimui selektyviose išvesties vietose.
©2020 Amerikos mokslo pažangos asociacija. visos teisės saugomos. AAAS yra HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ir COUNTER partneris. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.