Dėkojame, kad apsilankėte nature.com. Jūsų naudojama naršyklės versija turi ribotą CSS palaikymą. Kad patirtis būtų geriausia, rekomenduojame naudoti naujausią naršyklės versiją (arba išjungti suderinamumo režimą „Internet Explorer“). Be to, siekiant užtikrinti nuolatinį palaikymą, šioje svetainėje nebus stilių ar „JavaScript“.
Vandenilio sulfidas (H2S) turi daugybinį fiziologinį ir patologinį poveikį žmogaus organizmui. Natrio hidrosulfidas (NaHS) yra plačiai naudojamas kaip farmakologinė priemonė H2S poveikiui biologiniuose eksperimentuose įvertinti. Nors H2S išnykimas iš NaHS tirpalų trunka tik kelias minutes, kai kuriuose tyrimuose su gyvūnais NaHS tirpalai buvo naudojami kaip donoriniai junginiai H2S geriamajame vandenyje. Šiame tyrime buvo tiriama, ar geriamasis vanduo, kurio NaHS koncentracija yra 30 μM, paruoštas žiurkių/pelių buteliuose, gali išlikti stabilus mažiausiai 12–24 valandas, kaip siūlo kai kurie autoriai. Paruoškite NaHS tirpalą (30 μM) geriamajame vandenyje ir nedelsdami supilkite jį į žiurkių/pelių vandens butelius. Mėginiai buvo imami iš vandens butelio galo ir vidaus po 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 ir 24 valandų, kad būtų galima išmatuoti sulfido kiekį metileno mėlynojo metodu. Be to, žiurkių patinams ir patelėms dvi savaites buvo švirkščiama NaHS (30 μM), o serumo sulfido koncentracija buvo matuojama kas antrą dieną pirmąją savaitę ir antrosios savaitės pabaigoje. NaHS tirpalas mėginyje, gautame iš vandens butelio galo, buvo nestabilus; jo kiekis sumažėjo atitinkamai 72 % ir 75 % po 12 ir 24 valandų. Mėginiuose, paimtuose iš vandens butelių vidaus, NaHS sumažėjimas per 2 valandas nebuvo reikšmingas; tačiau po 12 ir 24 valandų jis sumažėjo atitinkamai 47 % ir 72 %. NaHS injekcija neturėjo įtakos žiurkių patinų ir patelių serumo sulfido kiekiui. Apibendrinant galima teigti, kad iš geriamojo vandens paruošti NaHS tirpalai neturėtų būti naudojami H2S donorystei, nes tirpalas yra nestabilus. Toks vartojimo būdas sukels gyvūnams nereguliarų ir mažesnių nei tikėtasi NaHS kiekių patekimą.
Vandenilio sulfidas (H2S) kaip toksinas naudojamas nuo 1700 m.; tačiau jo galimą vaidmenį kaip endogeninės biosignalizuojančios molekulės 1996 m. aprašė Abe ir Kimura. Per pastaruosius tris dešimtmečius buvo išaiškinta daugybė H2S funkcijų įvairiose žmogaus sistemose, todėl suprasta, kad H2S donorinės molekulės gali turėti klinikinių pritaikymų gydant ar valdant tam tikras ligas; žr. naujausią apžvalgą Chirino ir kt. darbe.
Natrio hidrosulfidas (NaHS) buvo plačiai naudojamas kaip farmakologinė priemonė H2S poveikiui įvertinti daugelyje ląstelių kultūrų ir gyvūnų tyrimų5,6,7,8. Tačiau NaHS nėra idealus H2S donoras, nes tirpale jis greitai virsta H2S/HS-, lengvai užteršiamas polisulfidais ir lengvai oksiduojamas bei garinamas4,9. Daugelyje biologinių eksperimentų NaHS tirpsta vandenyje, todėl vyksta pasyvus garavimas ir H2S10,11,12 netekimas, savaiminė H2S11 oksidacija12,13 ir fotolizė14. Pradiniame tirpale sulfidas labai greitai prarandamas dėl H2S11 garavimo. Atvirame inde H2S pusinės eliminacijos laikas (t1/2) yra apie 5 minutes, o jo koncentracija sumažėja apie 13 % per minutę10. Nors vandenilio sulfido netekimas iš NaHS tirpalų trunka tik kelias minutes, kai kuriuose tyrimuose su gyvūnais NaHS tirpalai buvo naudojami kaip vandenilio sulfido šaltinis geriamajame vandenyje 1–21 savaitę, keičiant NaHS turintį tirpalą kas 12–24 valandas.15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 Ši praktika neatitinka mokslinių tyrimų principų, nes vaistų dozės turėtų būti pagrįstos jų naudojimu kitoms rūšims, ypač žmonėms.27
Ikiklinikinių biomedicinos tyrimų tikslas – pagerinti pacientų priežiūros kokybę ar gydymo rezultatus. Tačiau daugumos su gyvūnais atliktų tyrimų rezultatai dar nebuvo pritaikyti žmonėms28,29,30. Viena iš šios nesėkmės priežasčių yra nepakankamas dėmesys gyvūnų tyrimų metodologinei kokybei30. Todėl šio tyrimo tikslas buvo ištirti, ar 30 μM NaHS tirpalai, paruošti žiurkių/pelių vandens buteliuose, gali išlikti stabilūs geriamajame vandenyje 12–24 val., kaip teigiama ar siūloma kai kuriuose tyrimuose.
Visi šio tyrimo eksperimentai buvo atlikti laikantis Irane paskelbtų laboratorinių gyvūnų priežiūros ir naudojimo gairių31. Visos šio tyrimo eksperimentinės ataskaitos taip pat atitiko ARRIVE gaires32. Visas šio tyrimo eksperimentines procedūras patvirtino Šahido Behešti medicinos mokslų universiteto Endokrininių mokslų instituto etikos komitetas.
Cinko acetato dihidratas (CAS: 5970-45-6) ir bevandenis geležies chloridas (CAS: 7705-08-0) buvo įsigyti iš „Biochem, Chemopahrama“ (Kosne prie Luaros, Prancūzija). Natrio hidrosulfido hidratas (CAS: 207683-19-0) ir N,N-dimetil-p-fenilendiaminas (DMPD) (CAS: 535-47-0) buvo įsigyti iš „Sigma-Aldrich“ (Sent Luisas, Misūris, JAV). Izofluranas buvo įsigytas iš „Piramal“ (Betliejus, Pensilvanija, JAV). Druskos rūgštis (HCl) buvo įsigyta iš „Merck“ (Darmštatas, Vokietija).
Paruoškite NaHS tirpalą (30 μM) geriamajame vandenyje ir nedelsdami supilkite jį į žiurkių/pelių vandens buteliukus. Ši koncentracija buvo parinkta remiantis daugybe publikacijų, kuriose NaHS naudojamas kaip H2S šaltinis; žr. aptarimų skyrių. NaHS yra hidratuota molekulė, kurioje gali būti įvairus hidratuoto vandens kiekis (t. y. NaHS•xH2O); gamintojo teigimu, mūsų tyrime naudoto NaHS procentinė dalis buvo 70,7 % (t. y. NaHS•1,3 H2O), ir mes atsižvelgėme į šią vertę savo skaičiavimuose, kur naudojome 56,06 g/mol molekulinę masę, kuri yra bevandenio NaHS molekulinė masė. Hidratuotas vanduo (dar vadinamas kristalizacijos vandeniu) yra vandens molekulės, sudarančios kristalinę struktūrą33. Hidratai turi skirtingas fizines ir termodinamines savybes, palyginti su anhidratais34.
Prieš įpilant NaHS į geriamąjį vandenį, išmatuokite tirpiklio pH ir temperatūrą. Nedelsdami supilkite NaHS tirpalą į žiurkių/pelių vandens butelį gyvūnų narve. Mėginiai buvo imami iš vandens butelio galo ir vidaus po 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 ir 24 val. sulfidų kiekiui matuoti. Sulfidų matavimai buvo atlikti iškart po kiekvieno mėginio paėmimo. Mėginius ėmėme iš vamzdelio galo, nes kai kurie tyrimai parodė, kad mažas vandens vamzdelio porų dydis gali sumažinti H2S garavimą15,19. Atrodo, kad ši problema taikoma ir tirpalui butelyje. Tačiau tai nebuvo taikoma tirpalui vandens butelio kaklelyje, kuris pasižymėjo didesniu garavimo greičiu ir autooksidavo; iš tikrųjų gyvūnai pirmiausia išgėrė šį vandenį.
Tyrime buvo naudojami Wistar žiurkių patinai ir patelės. Žiurkės buvo laikomos polipropileno narveliuose (2–3 žiurkės narve) standartinėmis sąlygomis (temperatūra 21–26 °C, drėgmė 32–40 %), 12 val. šviesos (nuo 7 iki 19 val.) ir 12 val. tamsos (nuo 19 iki 7 val.). Žiurkės turėjo laisvą prieigą prie vandentiekio vandens ir buvo šeriamos standartiniu ėdalu („Khorak Dam Pars Company“, Teheranas, Iranas). Panašaus amžiaus (6 mėnesių) patelės (n = 10, kūno svoris: 190–230 g) ir patinai (n = 10, kūno svoris: 320–370 g) Wistar žiurkės buvo atsitiktinai suskirstytos į kontrolinę ir NaHS (30 μM) gydytas grupes (n = 5 kiekvienoje grupėje). Imties dydžiui nustatyti taikėme KISS (Keep It Simple, Stupid) metodą, kuris apjungia ankstesnę patirtį ir galios analizę35. Pirmiausia atlikome bandomąjį tyrimą su 3 žiurkėmis ir nustatėme vidutinį bendrą serumo sulfidų kiekį ir standartinį nuokrypį (8,1 ± 0,81 μM). Tada, atsižvelgdami į 80 % galią ir darydami prielaidą apie dvipusį 5 % reikšmingumo lygį, nustatėme preliminarų imties dydį (n = 5, remiantis ankstesne literatūra), kuris atitiko standartizuotą 2,02 efekto dydį su iš anksto nustatyta Festingo siūloma verte eksperimentinių gyvūnų imties dydžiui apskaičiuoti35. Padauginus šią vertę iš SD (2,02 × 0,81), numatomas aptinkamas efekto dydis (1,6 μM) buvo 20 %, o tai yra priimtina. Tai reiškia, kad n = 5/grupėje pakanka, kad būtų galima nustatyti 20 % vidutinį pokytį tarp grupių. Žiurkės buvo atsitiktinai suskirstytos į kontrolinę ir NaSH gydytas grupes, naudojant „Excel“ programinės įrangos atsitiktinę funkciją36 (papildomas 1 pav.). Aklavimas buvo atliktas rezultato lygmeniu, o tyrėjai, atliekantys biocheminius matavimus, nežinojo apie grupių priskyrimą.
Abiejų lyčių NaHS grupės 2 savaites buvo gydomos 30 μM NaHS tirpalu, paruoštu geriamajame vandenyje; šviežias tirpalas buvo tiekiamas kas 24 valandas, per tą laiką matuojamas kūno svoris. Kraujo mėginiai buvo imami nuo visų žiurkių uodegų galiukų, taikant izoflurano anesteziją, kas antrą dieną pirmos ir antros savaičių pabaigoje. Kraujo mėginiai buvo centrifuguojami 3000 g greičiu 10 min., serumas buvo atskirtas ir laikomas –80 °C temperatūroje, kad būtų galima atlikti vėlesnius serumo karbamido, kreatinino (Cr) ir bendro sulfido matavimus. Serumo karbamidas buvo nustatytas fermentiniu ureazės metodu, o serumo kreatininas – fotometriniu Jaffe metodu, naudojant komerciškai prieinamus rinkinius („Man Company“, Teheranas, Iranas) ir automatinį analizatorių („Selectra E“, serijos numeris 0-2124, Nyderlandai). Šlapalo ir Cr variacijos koeficientai tarp tyrimų ir tyrimuose buvo mažesni nei 2,5 %.
Metileno mėlynojo (MB) metodas naudojamas bendram sulfidų kiekiui geriamajame vandenyje ir serume, kuriame yra NaHS, matuoti; MB yra dažniausiai naudojamas metodas sulfidų kiekiui matuoti biriuose tirpaluose ir biologiniuose mėginiuose11,37. MB metodas gali būti naudojamas bendram sulfidų telkiniui įvertinti38 ir neorganinių sulfidų H2S, HS⁻ ir S⁻ pavidalu matavimui vandeninėje fazėje39. Šiuo metodu siera nusodinama kaip cinko sulfidas (ZnS), esant cinko acetatui11,38. Cinko acetato nusodinimas yra plačiausiai naudojamas metodas sulfidams atskirti nuo kitų chromoforų11. ZnS buvo ištirpintas naudojant HCl11 stipriai rūgštinėje aplinkoje. Sulfidas reaguoja su DMPD stechiometriniu santykiu 1:2 reakcijoje, kurią katalizuoja geležies chloridas (Fe3+ veikia kaip oksidatorius), ir susidaro dažiklis MB, kuris spektrofotometriškai aptinkamas esant 670 nm40,41. MB metodo aptikimo riba yra maždaug 1 μM11.
Šiame tyrime į mėgintuvėlį buvo įpilta 100 μL kiekvieno mėginio (tirpalo arba serumo); tada įpilta 200 μL cinko acetato (1 % m/t distiliuotame vandenyje), 100 μL DMPD (20 mM 7,2 M HCl tirpale) ir 133 μL FeCl3 (30 mM 1,2 M HCl tirpale). Mišinys buvo inkubuojamas 37 °C temperatūroje tamsoje 30 min. Tirpalas buvo centrifuguojamas 10 000 g greičiu 10 min., o supernatanto absorbcija buvo nuskaityta esant 670 nm bangos ilgiui, naudojant mikroplokštelių skaitytuvą („BioTek“, MQX2000R2, Winooski, VT, JAV). Sulfidų koncentracijos buvo nustatytos naudojant NaHS (0–100 μM) kalibravimo kreivę ddH2O tirpale (papildomas 2 pav.). Visi matavimams naudoti tirpalai buvo šviežiai paruošti. Sulfidų matavimų vidiniai ir tarpiniai variacijos koeficientai buvo atitinkamai 2,8 % ir 3,4 %. Taip pat nustatėme bendrą iš natrio tiosulfato turinčio geriamojo vandens ir serumo mėginių išgautą sulfidą, naudodami praturtintų mėginių metodą42. Natrio tiosulfato turinčio geriamojo vandens ir serumo mėginių išgautos dalys buvo atitinkamai 91 ± 1,1 % (n = 6) ir 93 ± 2,4 % (n = 6).
Statistinė analizė atlikta naudojant „GraphPad Prism“ programinės įrangos 8.0.2 versiją, skirtą „Windows“ (GraphPad Software, San Diegas, Kalifornija, JAV, www.graphpad.com). Geriamojo vandens temperatūrai ir pH palyginti prieš ir po NaHS įpylimo buvo naudojamas porinis t testas. H2S nuostoliai NaHS turinčiame tirpale buvo apskaičiuoti kaip procentinis sumažėjimas nuo pradinio suvartojimo, o norint įvertinti, ar nuostoliai yra statistiškai reikšmingi, atlikome vienfaktorinę pakartotinių matavimų dispersinę analizę, po kurios sekė Dunnett'o daugybinis palyginimo testas. Kūno svoris, serumo šlapalo kiekis, serumo kreatinino kiekis ir bendras serumo sulfidų kiekis laikui bėgant buvo lyginami tarp kontrolinės ir NaHS gydytų skirtingų lyčių žiurkių, naudojant dvifaktorinę mišrią (tarp grupės ir grupės viduje) dispersinę analizę, po kurios sekė Bonferroni post hoc testas. Dvipusės P vertės < 0,05 buvo laikomos statistiškai reikšmingomis.
Geriamojo vandens pH buvo 7,60 ± 0,01 prieš NaHS įpylimą ir 7,71 ± 0,03 po NaHS įpylimo (n = 13, p = 0,0029). Geriamojo vandens temperatūra buvo 26,5 ± 0,2 ir sumažėjo iki 26,2 ± 0,2 po NaHS įpylimo (n = 13, p = 0,0128). Paruoškite 30 μM NaHS tirpalą geriamajame vandenyje ir laikykite jį vandens butelyje. NaHS tirpalas yra nestabilus ir jo koncentracija laikui bėgant mažėja. Imant mėginį iš vandens butelio kaklelio, per pirmąją valandą pastebėtas reikšmingas sumažėjimas (68,0 %), o po 12 ir 24 valandų NaHS kiekis tirpale sumažėjo atitinkamai 72 % ir 75 %. Mėginiuose, gautuose iš vandens butelių, NaHS sumažėjimas nebuvo reikšmingas iki 2 valandų, tačiau po 12 ir 24 valandų jis sumažėjo atitinkamai 47 % ir 72 %. Šie duomenys rodo, kad NaHS procentinė dalis 30 μM tirpale, paruoštame geriamajame vandenyje, po 24 valandų sumažėjo iki maždaug ketvirtadalio pradinės vertės, nepriklausomai nuo mėginių ėmimo vietos (1 pav.).
NaHS tirpalo (30 μM) stabilumas geriamajame vandenyje žiurkių/pelių buteliukuose. Paruošus tirpalą, mėginiai buvo paimti iš vandens buteliuko galiuko ir vidaus. Duomenys pateikiami kaip vidurkis ± SD (n = 6/grupė). * ir #, P < 0,05, palyginti su laiku 0. Vandens buteliuko nuotraukoje matyti galiukas (su anga) ir buteliuko korpusas. Antgalio tūris yra maždaug 740 μL.
Šviežiai paruoštame 30 μM tirpale NaHS koncentracija buvo 30,3 ± 0,4 μM (diapazonas: 28,7–31,9 μM, n = 12). Tačiau po 24 val. NaHS koncentracija sumažėjo iki mažesnės vertės (vidurkis: 3,0 ± 0,6 μM). Kaip parodyta 2 paveiksle, žiurkių veikiamos NaHS koncentracijos tyrimo laikotarpiu nebuvo pastovios.
Žiurkių patelių kūno svoris laikui bėgant reikšmingai padidėjo (nuo 205,2 ± 5,2 g iki 213,8 ​​± 7,0 g kontrolinėje grupėje ir nuo 204,0 ± 8,6 g iki 211,8 ± 7,5 g NaHS gydytoje grupėje); tačiau NaHS gydymas neturėjo įtakos kūno svoriui (3 pav.). Žiurkių patinų kūno svoris laikui bėgant reikšmingai padidėjo (nuo 338,6 ± 8,3 g iki 352,4 ± 6,0 g kontrolinėje grupėje ir nuo 352,4 ± 5,9 g iki 363,2 ± 4,3 g NaHS gydytoje grupėje); tačiau NaHS gydymas neturėjo įtakos kūno svoriui (3 pav.).
Žiurkių patelių ir patinų kūno svorio pokyčiai po NaHS (30 μM) skyrimo. Duomenys pateikiami kaip vidurkis ± SEM ir palyginti naudojant dvifaktorinę mišrią (tarp jų) dispersinę analizę su Bonferroni post hoc testu. n = 5 kiekvienos lyties kiekvienoje grupėje.
Viso tyrimo metu kontrolinės ir NaSH gydytų žiurkių serumo šlapalo ir kreatino fosfato koncentracijos buvo panašios. Be to, NaSH gydymas neturėjo įtakos serumo šlapalo ir kreatino chromo koncentracijoms (1 lentelė).
Pradinė bendrojo sulfido koncentracija serume buvo panaši tarp kontrolinės ir NaHS gydytų žiurkių patinų (8,1 ± 0,5 μM, palyginti su 9,3 ± 0,2 μM) ir patelių (9,1 ± 1,0 μM, palyginti su 6,1 ± 1,1 μM). NaHS vartojimas 14 dienų neturėjo įtakos bendrojo sulfido kiekiui serume nei žiurkių patinams, nei patelėms (4 pav.).
Bendrosios sulfidų koncentracijos serume pokyčiai žiurkių patinams ir patelėms po NaHS (30 μM) skyrimo. Duomenys pateikiami kaip vidurkis ± SEM ir buvo palyginti naudojant dvifaktorinę mišrią (viduje-viduje) dispersinę analizę su Bonferroni post hoc testu. Kiekvienos lyties, n = 5/grupėje.
Pagrindinė šio tyrimo išvada yra ta, kad geriamasis vanduo, kuriame yra NaHS, yra nestabilus: tik apie ketvirtadalį pradinio bendro sulfidų kiekio galima aptikti praėjus 24 valandoms po mėginio paėmimo iš žiurkių/pelių vandens butelių galiuko ir vidaus. Be to, žiurkės buvo veikiamos nestabiliomis NaHS koncentracijomis dėl H2S praradimo NaHS tirpale, o NaHS įdėjimas į geriamąjį vandenį neturėjo įtakos kūno svoriui, serumo šlapalo ir kreatino chromo kiekiui ar bendram serumo sulfidų kiekiui.
Šiame tyrime H2S nuostolių greitis iš 30 μM NaHS tirpalų, paruoštų geriamajame vandenyje, buvo maždaug 3 % per valandą. Buferiniame tirpale (100 μM natrio sulfido 10 mM PBS, pH 7,4) sulfido koncentracija laikui bėgant per 8 valandas sumažėjo 7 %11. Anksčiau pateisinome intraperitoninį NaHS vartojimą, pranešdami, kad sulfido nuostolių greitis iš 54 μM NaHS tirpalo geriamajame vandenyje buvo maždaug 2,3 % per valandą (4 %/val. per pirmąsias 12 val. ir 1,4 %/val. per paskutines 12 val. po paruošimo)8. Ankstesni tyrimai43 nustatė nuolatinį H2S nuostolį iš NaHS tirpalų, daugiausia dėl garavimo ir oksidacijos. Net ir be burbuliukų, sulfidas pradiniame tirpale greitai prarandamas dėl H2S garavimo11. Tyrimai parodė, kad skiedimo proceso metu, kuris trunka apie 30–60 sekundžių, dėl garavimo prarandama apie 5–10 % H2S6. Siekdami išvengti H2S išgaravimo iš tirpalo, tyrėjai ėmėsi kelių priemonių, įskaitant švelnų tirpalo maišymą12, pradinio tirpalo uždengimą plastikine plėvele6 ir tirpalo sąlyčio su oru mažinimą, nes H2S garavimo greitis priklauso nuo oro ir skysčio sąsajos.13 Savaiminė H2S oksidacija vyksta daugiausia dėl pereinamųjų metalų jonų, ypač geležies (III), kurie yra vandens priemaišos.13 H2S oksidacijos metu susidaro polisulfidai (sieros atomai, sujungti kovalentiniais ryšiais)11. Siekiant išvengti oksidacijos, tirpalai, kuriuose yra H2S, ruošiami deguonies neturinčiuose tirpikliuose44,45 ir po to 20–30 min. prapučiami argonu arba azotu, kad būtų užtikrintas deguonies pašalinimas.11,12,37,44,45,46 Dietilentriaminpentaacto rūgštis (DTPA) yra metalų chelatorius (10–4 M), kuris neleidžia HS autooksidacijai aerobiniuose tirpaluose. Nesant DTPA, HS⁻ autooksidacijos greitis yra maždaug 50 % per maždaug 3 val. 25 °C temperatūroje37,47. Be to, kadangi 1ε-sulfido oksidaciją katalizuoja ultravioletiniai spinduliai, tirpalą reikia laikyti ant ledo ir saugoti nuo šviesos11.
Kaip parodyta 5 paveiksle, ištirpęs vandenyje NaHS disocijuojasi į Na+ ir HS-6; šią disociaciją lemia reakcijos pK1, kuris priklauso nuo temperatūros: pK1 = 3,122 + 1132/T, kur T svyruoja nuo 5 iki 30 °C ir matuojamas Kelvino laipsniais (K), K = °C + 273,1548. HS- turi aukštą pK2 (pK2 = 19), todėl esant pH < 96,49, S2- nesusidaro arba susidaro labai mažais kiekiais. Priešingai, HS- veikia kaip bazė ir priima H+ iš H2O molekulės, o H2O veikia kaip rūgštis ir virsta H2S ir OH-.
Ištirpusių H2S dujų susidarymas NaHS tirpale (30 µM). aq, vandeninis tirpalas; g, dujos; l, skystis. Visuose skaičiavimuose daroma prielaida, kad vandens pH = 7,0, o vandens temperatūra = 20 °C. Sukurta naudojant BioRender.com.
Nepaisant įrodymų, kad NaHS tirpalai yra nestabilūs, keliuose tyrimuose su gyvūnais NaHS tirpalai geriamajame vandenyje buvo naudojami kaip H2S donorinis junginys15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26, o intervencijos trukmė svyravo nuo 1 iki 21 savaitės (2 lentelė). Šių tyrimų metu NaHS tirpalas buvo atnaujinamas kas 12 val., 15, 17, 18, 24, 25 val. arba 24 val., 19, 20, 21, 22, 23 val. Mūsų rezultatai parodė, kad žiurkės buvo veikiamos nestabiliomis vaisto koncentracijomis dėl H2S praradimo iš NaHS tirpalo, o NaHS kiekis žiurkių geriamajame vandenyje reikšmingai svyravo per 12 arba 24 val. (žr. 2 pav.). Dviejuose iš šių tyrimų pranešta, kad H2S kiekis vandenyje išliko stabilus 24 val.22 arba kad per 12 val.15 buvo pastebėti tik 2–3 % H2S nuostoliai, tačiau juose nebuvo pateikta patvirtinamųjų duomenų ar matavimo detalių. Du tyrimai parodė, kad mažas vandens butelių skersmuo gali sumažinti H2S garavimą15,19. Tačiau mūsų rezultatai parodė, kad tai gali atidėti H2S nuostolius iš vandens butelio tik 2 valandomis, o ne 12–24 valandomis. Abiejuose tyrimuose pažymima, kad mes darome prielaidą, jog NaHS kiekis geriamajame vandenyje nepasikeitė, nes nepastebėjome vandens spalvos pokyčio; todėl H2S oksidacija oru nebuvo reikšminga19,20. Keista, bet šis subjektyvus metodas įvertina NaHS stabilumą vandenyje, o ne matuoja jo koncentracijos pokytį laikui bėgant.
H2S nuostoliai NaHS tirpale yra susiję su pH ir temperatūra. Kaip pažymėta mūsų tyrime, ištirpinus NaHS vandenyje, susidaro šarminis tirpalas50. Kai NaHS ištirpsta vandenyje, ištirpusių H2S dujų susidarymas priklauso nuo pH vertės6. Kuo mažesnis tirpalo pH, tuo didesnė NaHS dalis yra H2S dujų molekulės ir tuo daugiau sulfido netenkama iš vandeninio tirpalo11. Nė vienas iš šių tyrimų nenurodė geriamojo vandens, naudojamo kaip NaHS tirpiklis, pH. Remiantis PSO rekomendacijomis, kurias taiko dauguma šalių, geriamojo vandens pH turėtų būti 6,5–8,551 intervale. Šiame pH diapazone savaiminės H2S oksidacijos greitis padidėja maždaug dešimt kartų13. Ištirpinus NaHS vandenyje šiame pH diapazone, ištirpusių H2S dujų koncentracija bus nuo 1 iki 22,5 μM, o tai pabrėžia vandens pH stebėjimo svarbą prieš tirpinant NaHS. Be to, minėtame tyrime nurodytas temperatūros diapazonas (18–26 °C) lemtų maždaug 10 % ištirpusių H2S dujų koncentracijos tirpale pokytį, nes temperatūros pokyčiai keičia pK1, o nedideli pK1 pokyčiai gali turėti didelės įtakos ištirpusių H2S dujų koncentracijai48. Be to, šią problemą dar labiau paaštrina ilga kai kurių tyrimų trukmė (5 mėnesiai)22, kurios metu tikimasi didelio temperatūros kintamumo.
Visuose tyrimuose, išskyrus vieną21, buvo naudojamas 30 μM NaHS tirpalas geriamajame vandenyje. Norėdami paaiškinti naudotą dozę (t. y. 30 μM), kai kurie autoriai atkreipė dėmesį, kad NaHS vandeninėje fazėje sukuria lygiai tokią pačią H2S dujų koncentraciją ir kad fiziologinis H2S diapazonas yra nuo 10 iki 100 μM, taigi ši dozė yra fiziologiniame diapazone15,16. Kiti paaiškino, kad 30 μM NaHS gali palaikyti plazmos H2S lygį fiziologiniame diapazone, t. y. 5–300 μM19,20. Mes laikome 30 μM NaHS koncentraciją vandenyje (pH = 7,0, T = 20 °C), kuri buvo naudojama kai kuriuose tyrimuose H2S poveikiui tirti. Galime apskaičiuoti, kad ištirpusių H2S dujų koncentracija yra 14,7 μM, tai yra apie 50 % pradinės NaHS koncentracijos. Ši vertė yra panaši į kitų autorių apskaičiuotą vertę tomis pačiomis sąlygomis13,48.
Mūsų tyrime NaHS vartojimas nepakeitė kūno svorio; šis rezultatas atitinka kitų tyrimų su pelių patinais22,23 ir žiurkių patinais18 rezultatus; Tačiau dviejuose tyrimuose pranešta, kad NaSH atkūrė sumažėjusį kūno svorį žiurkėms po nefrektomijos24,26, o kituose tyrimuose NaSH vartojimo poveikis kūno svoriui nebuvo praneštas15,16,17,19,20,21,25. Be to, mūsų tyrime NaSH vartojimas neturėjo įtakos serumo šlapalo ir kreatino chromo kiekiui, o tai atitinka kitos ataskaitos25 rezultatus.
Tyrimo metu nustatyta, kad 2 savaites į geriamąjį vandenį įmaišius NaHS, bendra serumo sulfidų koncentracija žiurkių patinams ir patelėms nepakito. Šis atradimas atitinka Sen ir kt. (16) rezultatus: 8 savaičių gydymas 30 μM NaHS geriamajame vandenyje neturėjo įtakos kontrolinių žiurkių plazmos sulfidų kiekiui; tačiau jie pranešė, kad ši intervencija atkūrė sumažėjusį H2S kiekį nefrektomizuotų pelių plazmoje. Li ir kt. (22) taip pat pranešė, kad 5 mėnesius įmaišius 30 μM NaHS į geriamąjį vandenį, laisvojo sulfido kiekis senų pelių plazmoje padidėjo maždaug 26 %. Kituose tyrimuose nebuvo pranešta apie cirkuliuojančio sulfido pokyčius įmaišius NaHS į geriamąjį vandenį.
Septyni tyrimai, kuriuose buvo naudojamas „Sigma NaHS“15,16,19,20,21,22,23, nepateikė daugiau informacijos apie hidratacijos vandenį, o penkiuose tyrimuose nebuvo paminėtas NaHS šaltinis, naudojamas jų paruošimo metoduose17,18,24,25,26. NaHS yra hidratuota molekulė, ir jos hidratacijos vandens kiekis gali skirtis, o tai turi įtakos NaHS kiekiui, reikalingam tam tikro moliariškumo tirpalui paruošti. Pavyzdžiui, mūsų tyrime NaHS kiekis buvo NaHS•1,3 H2O. Taigi, faktinės NaHS koncentracijos šiuose tyrimuose gali būti mažesnės nei nurodytos.
„Kaip toks trumpai gyvuojantis junginys gali turėti tokį ilgalaikį poveikį?“ – šį klausimą uždavė Pozgay ir kt.21, vertindami NaHS poveikį pelių kolitui. Jie tikisi, kad būsimi tyrimai galės atsakyti į šį klausimą ir spėlioti, kad NaHS tirpaluose, be H2S ir disulfidų, kurie tarpininkauja NaHS poveikiui, gali būti ir stabilesnių polisulfidų21. Kita galimybė yra ta, kad labai maža NaHS koncentracija tirpale taip pat gali turėti teigiamą poveikį. Iš tiesų, Olson ir kt. pateikė įrodymų, kad mikromolinis H2S kiekis kraujyje nėra fiziologinis ir turėtų būti nanomoliniame diapazone arba jo visai nebūti13. H2S gali veikti per baltymų sulfaciją – grįžtamąją potransliacinę modifikaciją, kuri veikia daugelio baltymų funkciją, stabilumą ir lokalizaciją52,53,54. Iš tiesų, fiziologinėmis sąlygomis maždaug 10–25 % daugelio kepenų baltymų yra sulfilinti53. Abu tyrimai pripažįsta greitą NaHS skaidymąsi19,23, tačiau stebėtinai teigia, kad „mes kontroliavome NaHS koncentraciją geriamajame vandenyje jį kasdien keisdami“.23 Viename tyrime netyčia buvo teigiama, kad „NaHS yra standartinis H2S donoras ir klinikinėje praktikoje dažniausiai naudojamas pačiam H2S pakeisti“.18
Aukščiau pateikta diskusija rodo, kad NaHS iš tirpalo išsiskiria dėl garavimo, oksidacijos ir fotolizės, todėl pateikiami keli pasiūlymai, kaip sumažinti H2S nuostolius iš tirpalo. Pirma, H2S garavimas priklauso nuo dujų ir skysčio sąsajos13 ir tirpalo pH11; todėl, norint sumažinti garavimo nuostolius, vandens butelio kaklelis gali būti kuo mažesnis, kaip aprašyta anksčiau15,19, o vandens pH galima reguliuoti iki priimtinos viršutinės ribos (t. y. 6,5–8,551), kad būtų kuo mažiau garavimo nuostolių11. Antra, savaiminė H2S oksidacija vyksta dėl deguonies poveikio ir pereinamųjų metalų jonų buvimo geriamajame vandenyje13, todėl geriamojo vandens deguonies pašalinimas argonu arba azotu44,45 ir metalų chelatorių37,47 naudojimas gali sumažinti sulfidų oksidaciją. Trečia, siekiant išvengti H2S fotodekompozicijos, vandens butelius galima apvynioti aliuminio folija; Ši praktika taip pat taikoma šviesai jautrioms medžiagoms, tokioms kaip streptozotocinas55. Galiausiai, neorganinės sulfidų druskos (NaHS, Na2S ir CaS) gali būti duodamos per zondą, o ne ištirpintos geriamajame vandenyje, kaip buvo pranešta anksčiau56,57,58; tyrimai parodė, kad radioaktyvus natrio sulfidas, duodamas žiurkėms per zondą, yra gerai absorbuojamas ir pasiskirsto praktiškai visuose audiniuose59. Iki šiol daugumoje tyrimų neorganinės sulfidų druskos buvo skiriamos į pilvaplėvės ertmę; tačiau šis būdas klinikinėje aplinkoje naudojamas retai60. Kita vertus, peroralinis vartojimo būdas yra dažniausias ir pageidaujamas vartojimo būdas žmonėms61. Todėl rekomenduojame įvertinti H2S donorų poveikį graužikams per zondą.
Apribojimas yra tas, kad sulfidų kiekį vandeniniame tirpale ir serume matavome MB metodu. Sulfidų matavimo metodai apima jodo titravimą, spektrofotometriją, elektrocheminį metodą (potenciometrija, amperometrija, kulonometrinis metodas ir amperometrinis metodas) ir chromatografiją (dujų chromatografija ir efektyvioji skysčių chromatografija), iš kurių dažniausiai naudojamas metodas yra MB spektrofotometrinis metodas62. MB metodo, skirto matuoti H2S biologiniuose mėginiuose, apribojimas yra tas, kad juo matuojami visi sieros turintys junginiai, o ne laisvasis H2S63, nes jis atliekamas rūgštinėje aplinkoje, todėl siera išgaunama iš biologinio šaltinio64. Tačiau, pasak Amerikos visuomenės sveikatos asociacijos, MB yra standartinis sulfidų kiekio vandenyje matavimo metodas65. Todėl šis apribojimas neturi įtakos mūsų pagrindiniams rezultatams apie NaHS turinčių tirpalų nestabilumą. Be to, mūsų tyrime sulfidų matavimų išgaunamumas vandens ir serumo mėginiuose, kuriuose yra NaHS, buvo atitinkamai 91 % ir 93 %. Šios vertės atitinka anksčiau praneštus diapazonus (77–92)66, o tai rodo priimtiną analitinį tikslumą42. Verta paminėti, kad, siekdami išvengti pernelyg didelio pasikliovimo tik su gyvūnais atliktais ikiklinikiniais tyrimais67 ir, kai tik įmanoma, įtraukti ir žiurkių patinus, ir pateles68, naudojome ir žiurkių patinus, ir pateles pagal Nacionalinių sveikatos institutų (NIH) gaires. Šį teiginį pabrėžė ir kiti69,70,71.
Apibendrinant, šio tyrimo rezultatai rodo, kad iš geriamojo vandens paruošti NaHS tirpalai negali būti naudojami H2S gamybai dėl jų nestabilumo. Toks vartojimo būdas sukeltų nestabilų ir mažesnį nei tikėtasi NaHS kiekį gyvūnams; todėl šie rezultatai gali būti netaikomi žmonėms.
Duomenų rinkiniai, naudoti ir (arba) analizuoti šio tyrimo metu, gali būti gauti iš atitinkamo autoriaus pateikus pagrįstą prašymą.
Szabo, K. Vandenilio sulfido (H2S) tyrimų laiko juosta: nuo aplinkos toksino iki biologinio tarpininko. Biochemistry and Pharmacology 149, 5–19. https://doi.org/10.1016/j.bcp.2017.09.010 (2018).
Abe, K. ir Kimura, H. Galimas vandenilio sulfido, kaip endogeninio neuromoduliatoriaus, vaidmuo. Journal of Neuroscience, 16, 1066–1071. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.16-03-01066.1996 (1996).
Chirino, G., Szabo, C. ir Papapetropoulos, A. Vandenilio sulfido fiziologinis vaidmuo žinduolių ląstelėse, audiniuose ir organuose. „Reviews in Physiology and Molecular Biology“ 103, 31–276. https://doi.org/10.1152/physrev.00028.2021 (2023).
Dillon, KM, Carrazzone, RJ, Matson, JB ir Kashfi, K. Besivystančios ląstelinių azoto oksido ir vandenilio sulfido tiekimo sistemų perspektyvos: nauja personalizuotos medicinos era. Biochemistry and Pharmacology 176, 113931. https://doi.org/10.1016/j.bcp.2020.113931 (2020).
Sun, X. ir kt. Ilgalaikis lėtai išsiskiriančio vandenilio sulfido donoro vartojimas gali užkirsti kelią miokardo išemijai / reperfuzijos pažeidimui. Mokslinės ataskaitos 7, 3541. https://doi.org/10.1038/s41598-017-03941-0 (2017).
Sitdikova, GF, Fuchs, R., Kainz, W., Weiger, TM ir Hermann, A. BK kanalų fosforilinimas reguliuoja vandenilio sulfido (H2S) jautrumą. Frontiers in Physiology 5, 431. https://doi.org/10.3389/fphys.2014.00431 (2014).
Sitdikova, GF, Weiger, TM ir Hermann, A. Vandenilio sulfidas sustiprina kalcio aktyvuojamo kalio (BK) kanalų aktyvumą žiurkių hipofizės naviko ląstelėse. Archit. Pfluegers. 459, 389–397. https://doi.org/10.1007/s00424-009-0737-0 (2010).
Jeddy, S. ir kt. Vandenilio sulfidas sustiprina nitrito apsauginį poveikį nuo miokardo išemijos-reperfuzijos pažeidimo 2 tipo diabetu sergančioms žiurkėms. Azoto oksidas 124, 15–23. https://doi.org/10.1016/j.niox.2022.04.004 (2022).
Corvino, A. ir kt. H2S donorų chemijos tendencijos ir jos poveikis širdies ir kraujagyslių ligoms. Antioksidantai 10, 429. https://doi.org/10.3390/antiox10030429 (2021).
DeLeon, ER, Stoy, GF ir Olson, KR (2012). Pasyvūs vandenilio sulfido nuostoliai biologiniuose eksperimentuose. Analytical Biochemistry 421, 203–207. https://doi.org/10.1016/j.ab.2011.10.016 (2012).
Nagy, P. ir kt. Vandenilio sulfido matavimų fiziologiniuose mėginiuose cheminiai aspektai. Biochimica et Biophysical Acta 1840, 876–891. https://doi.org/10.1016/j.bbagen.2013.05.037 (2014).
Kline, LL.D. Spektrofotometrinis vandenilio sulfido nustatymas natūraliuose vandenyse. Limnol. Oceanogr. 14, 454–458. https://doi.org/10.4319/lo.1969.14.3.0454 (1969).
Olson, KR (2012). Praktiniai vandenilio sulfido chemijos ir biologijos mokymai. „Antioksidantai“. Redokso signalizacija. 17, 32–44. https://doi.org/10.1089/ars.2011.4401 (2012).