Anksčiau pranešėme, kad žarnyne išskiriamo triptofano metabolito indol-3-propiono rūgšties (IPA) serumo kiekis yra mažesnis pacientams, sergantiems kepenų fibroze. Šiame tyrime tyrėme transkriptomą ir DNR metilomą nutukusiose kepenyse, atsižvelgdami į IPA kiekį serume, taip pat IPA vaidmenį sukeliant kepenų žvaigždinių ląstelių (HSC) fenotipinę inaktyvaciją in vitro.
Tyrime dalyvavo 116 nutukusių pacientų, nesergančių 2 tipo cukriniu diabetu (T2DM) (amžius 46,8 ± 9,3 metų; KMI: 42,7 ± 5,0 kg/m²), kuriems Kuopio bariatrinės chirurgijos centre (KOBS) buvo atlikta bariatrinė chirurgija. Kraujyje cirkuliuojančio IPA kiekis buvo matuojamas skysčių chromatografijos-masių spektrometrijos (LC-MS) metodais, kepenų transkriptomo analizė atlikta bendrosios RNR sekoskaitos būdu, o DNR metilinimo analizė atlikta naudojant „Infinium HumanMethylation450 BeadChip“. In vitro eksperimentams buvo naudojamos žmogaus kepenų žvaigždžių ląstelės (LX-2).
Serumo IPA lygis koreliavo su genų, dalyvaujančių kepenų apoptozės, mitofagijos ir ilgaamžiškumo keliuose, raiška. AKT serino/treonino kinazės 1 (AKT1) genas buvo gausiausias ir dominuojantis sąveikaujantis genas kepenų transkripto ir DNR metilinimo profiliuose. IPA gydymas sukėlė apoptozę, sumažino mitochondrijų kvėpavimą ir pakeitė ląstelių morfologiją bei mitochondrijų dinamiką, moduliuodamas genų, žinomų kaip reguliuojantys fibrozę, apoptozę ir LX-2 ląstelių išgyvenimą, raišką.
Apibendrinus šiuos duomenis, galima teigti, kad IPA turi potencialų terapinį poveikį ir gali sukelti apoptozę bei pakeisti HSC fenotipą į neaktyvią būseną, taip padidindamas kepenų fibrozės slopinimo galimybę, trukdydamas HSC aktyvacijai ir mitochondrijų metabolizmui.
Nutukimo ir metabolinio sindromo paplitimas siejamas su didėjančiu metaboliškai susijusios riebalinės kepenų ligos (MASLD) atvejų skaičiumi; ši liga paveikia 25–30 % visos populiacijos [1]. Pagrindinė MASLD etiologijos pasekmė yra kepenų fibrozė – dinamiškas procesas, kuriam būdingas nuolatinis skaidulinės tarpląstelinės matricos (ECM) kaupimasis [2]. Pagrindinės ląstelės, dalyvaujančios kepenų fibrozėje, yra kepenų žvaigždinės ląstelės (HSC), kurios pasižymi keturiais žinomais fenotipais: ramybės būsenos, aktyvuotos, inaktyvuotos ir senstančios [3, 4]. HSC gali būti aktyvuojamos ir transdiferencijuojamos iš ramybės būsenos į proliferuojančias fibroblastų tipo ląsteles, kurioms reikia daug energijos, o α-lygiųjų raumenų aktino (α-SMA) ir I tipo kolageno (Col-I) ekspresija padidėja [5, 6]. Kepenų fibrozės panaikinimo metu aktyvuotos HSC pašalinamos apoptozės arba inaktyvacijos būdu. Šie procesai apima fibrogeninių genų reguliacijos slopinimą ir išgyvenimą skatinančių genų (tokių kaip NF-κB ir PI3K/Akt signalizacijos keliai) moduliaciją [7, 8], taip pat mitochondrijų dinamikos ir funkcijos pokyčius [9].
Nustatyta, kad žarnyne gaminamos triptofano metabolito indolo-3-propiono rūgšties (IPA) serumo lygis sumažėja sergant medžiagų apykaitos ligomis, įskaitant MASLD [10–13]. IPA yra susijusi su maistinių skaidulų vartojimu, yra žinoma dėl savo antioksidacinio ir priešuždegiminio poveikio ir in vivo bei in vitro silpnina mitybos sukeltą nealkoholinio steatohepatito (NASH) fenotipą [11–14]. Kai kurie įrodymai gauti iš ankstesnio mūsų tyrimo, kuris parodė, kad Kuopio bariatrinės chirurgijos tyrimo (KOBS) metu pacientams, sergantiems kepenų fibroze, IPA lygis serume buvo mažesnis nei nutukusiems pacientams, nesergantiems kepenų fibroze. Be to, parodėme, kad gydymas IPA gali sumažinti genų, kurie yra klasikiniai ląstelių adhezijos, ląstelių migracijos ir kraujodaros kamieninių ląstelių aktyvacijos žymenys žmogaus kepenų žvaigždžių ląstelių (LX-2) modelyje, raišką ir yra potencialus hepatoprotekcinis metabolitas [15]. Tačiau lieka neaišku, kaip IPA sukelia kepenų fibrozės regresiją aktyvuodamas HSC apoptozę ir mitochondrijų bioenergetiką.
Čia parodome, kad serumo IPA yra susijęs su genų, praturtintų apoptozės, mitofagijos ir ilgaamžiškumo keliais, raiška nutukusių, bet nesergančių 2 tipo diabetu (KOBS) asmenų kepenyse. Be to, nustatėme, kad IPA gali sukelti aktyvuotų kraujodaros kamieninių ląstelių (HSC) klirensą ir skaidymą per inaktyvacijos kelią. Šie rezultatai atskleidžia naują IPA vaidmenį, todėl jis tampa potencialiu terapiniu taikiniu kepenų fibrozės regresijai skatinti.
Ankstesnis KOBS kohortos tyrimas parodė, kad pacientams, sergantiems kepenų fibroze, cirkuliuojantis IPA kiekis buvo mažesnis, palyginti su pacientais, nesergančiais kepenų fibroze [15]. Siekdami atmesti galimą 2 tipo diabeto įtaką, į tyrimo populiaciją įtraukėme 116 nutukusių pacientų, nesergančių 2 tipo diabetu (vidutinis amžius ± SD: 46,8 ± 9,3 metų; KMI: 42,7 ± 5,0 kg/m2) (1 lentelė) iš vykdomo KOBS tyrimo [16]. Visi dalyviai davė raštišką informuotą sutikimą, o tyrimo protokolą patvirtino Šiaurės Savo apskrities ligoninės etikos komitetas pagal Helsinkio deklaraciją (54/2005, 104/2008 ir 27/2010).
Kepenų biopsijos mėginiai buvo gauti bariaatrinės chirurgijos metu ir histologiškai įvertinti patyrusių patologų pagal anksčiau aprašytus kriterijus [17, 18]. Vertinimo kriterijai apibendrinti 1 papildomoje lentelėje ir aprašyti anksčiau [19].
Nevalgius paimti serumo mėginiai buvo analizuojami netikslinės skysčių chromatografijos-masių spektrometrijos (LC-MS) metodu metabolomikos analizei (n = 116). Mėginiai buvo analizuojami naudojant UHPLC-qTOF-MS sistemą (1290 LC, 6540 qTOF-MS, „Agilent Technologies“, Waldbronnas, Karlsruhė, Vokietija), kaip aprašyta anksčiau19. Izopropilo alkoholio (IPA) identifikavimas buvo pagrįstas sulaikymo laiku ir MS/MS spektro palyginimu su grynais standartais. Visose tolesnėse analizėse buvo atsižvelgta į IPA signalo intensyvumą (smailės plotą) [20].
Visų kepenų RNR sekoskaita buvo atlikta naudojant „Illumina HiSeq 2500“, o duomenys buvo apdoroti, kaip aprašyta anksčiau [19, 21, 22]. Atlikome tikslinę diferencinės mitochondrijų funkciją / biogenezę veikiančių transkriptų raiškos analizę, naudodami 1957 genus, atrinktus iš „MitoMiner 4.0“ duomenų bazės [23]. Kepenų DNR metilinimo analizė buvo atlikta naudojant „Infinium HumanMethylation450 BeadChip“ (Illumina, San Diegas, Kalifornija, JAV), taikant tą pačią metodiką, kaip aprašyta anksčiau [24, 25].
Žmogaus kepenų žvaigždžių ląsteles (LX-2) maloniai suteikė prof. Stefano Romeo, jos buvo kultivuojamos ir laikomos DMEM/F12 terpėje („Biowest“, L0093-500, 1 % Pen/Strep; Lonza, DE17-602E, 2 % FBS; „Gibco“, 10270-106). Norint parinkti darbinę IPA dozę, LX-2 ląstelės 24 val. buvo veikiamos skirtingomis IPA koncentracijomis (10 μM, 100 μM ir 1 mM; „Sigma“, 220027) DMEM/F12 terpėje. Be to, siekiant ištirti IPA gebėjimą inaktyvuoti HSC, LX-2 ląstelės 24 val. buvo kartu veikiamos 5 ng/ml TGF-β1 („R&D systems“, 240-B-002/CF) ir 1 mM IPA serumo neturinčioje terpėje. Atitinkamoms kontrolinės grupės preparatams TGF-β1 gydymui buvo naudojamas 4 nM HCL, kuriame yra 0,1 % BSA, o IPA gydymui – 0,05 % DMSO, ir abu tirpalai buvo naudojami kartu kombinuotam gydymui.
Apoptozė buvo įvertinta naudojant FITC aneksino V apoptozės aptikimo rinkinį su 7-AAD (Biolegend, San Diegas, Kalifornija, JAV, kat. Nr. 640922) pagal gamintojo instrukcijas. Trumpai tariant, LX-2 (1 × 105 ląstelių/duobutėje) buvo kultivuojamos per naktį 12 šulinėlių plokštelėse, o po to apdorojamos keliomis IPA arba IPA ir TGF-β1 dozėmis. Kitą dieną plūduriuojančios ir prilipusios ląstelės buvo surinktos, tripsinuotos, nuplautos PBS, resuspenduotos aneksino V surišimo buferyje ir inkubuojamos su FITC-aneksinu V ir 7-AAD 15 min.
Gyvų ląstelių mitochondrijos buvo nudažytos oksidaciniam aktyvumui nustatyti naudojant „Mitotracker™ Red CMXRos“ (MTR) („Thermo Fisher Scientific“, Karlsbadas, Kalifornija). MTR tyrimams LX-2 ląstelės buvo inkubuojamos vienodu tankiu su IPA ir TGF-β1. Po 24 val. gyvos ląstelės buvo tripsinuotos, praplautos PBS ir inkubuojamos su 100 μM MTR serumo neturinčioje terpėje 37 °C temperatūroje 20 min., kaip aprašyta anksčiau [26]. Gyvų ląstelių morfologijos analizei ląstelių dydis ir citoplazmos sudėtingumas buvo analizuojami atitinkamai naudojant tiesioginės sklaidos (FSC) ir šoninės sklaidos (SSC) parametrus.
Visi duomenys (30 000 įvykių) buvo gauti naudojant „NovoCyte Quanteon“ („Agilent“) ir analizuoti naudojant „NovoExpress® 1.4.1“ arba „FlowJo V.10“ programinę įrangą.
Deguonies suvartojimo greitis (OCR) ir tarpląstelinio rūgštėjimo greitis (ECAR) buvo matuojami realiuoju laiku naudojant „Seahorse“ tarpląstelinio srauto analizatorių („Agilent Technologies“, Santa Klara, Kalifornija) su „Seahorse XF“ ląstelių mito streso prietaisu pagal gamintojo instrukcijas. Trumpai tariant, 2 × 104 LX-2 ląstelių/duobutėje buvo pasėtos į XF96 ląstelių kultūros plokšteles. Po nakties inkubacijos ląstelės buvo apdorotos izopropanoliu (IPA) ir TGF-β1 (1 papildomas metodas). Duomenų analizė atlikta naudojant „Seahorse XF Wave“ programinę įrangą, kuri apima „Seahorse XF“ ląstelių energijos fenotipo testo ataskaitų generatorių. Remiantis tuo, buvo apskaičiuotas bioenergetinis sveikatos indeksas (BHI) [27].
Bendra RNR buvo transkribuota į kDNR. Konkrečius metodus žr. nuorodoje [15]. Žmogaus 60S ribosominio rūgštinio baltymo P0 (RPLP0) ir ciklofilino A1 (PPIA) mRNR lygiai buvo naudojami kaip konstituciniai genų kontroliniai mėginiai. Buvo naudojama „QuantStudio 6 pro“ realaus laiko PGR sistema („Thermo Fisher“, Landsmeer, Nyderlandai) su „TaqMan™ Fast Advanced Master Mix“ rinkiniu („Applied Biosystems“) arba „Sensifast SYBR Lo-ROX“ rinkiniu („Bioline“, BIO 94050), o santykinė genų raiškos raiška buvo apskaičiuota naudojant lyginamuosius Ct vertės ciklo parametrus (ΔΔCt) ir ∆∆Ct metodą. Išsami informacija apie pradmenis pateikta papildomose S2 ir S3 lentelėse.
Branduolinė DNR (ncDNR) ir mitochondrinė DNR (mtDNR) buvo išskirtos naudojant „DNeasy“ kraujo ir audinių rinkinį („Qiagen“), kaip aprašyta anksčiau [28]. Santykinis mtDNR kiekis buvo apskaičiuotas apskaičiuojant kiekvieno tikslinio mtDNR regiono santykį su trijų branduolinės DNR regionų (mtDNR/ncDNR) geometriniu vidurkiu, kaip išsamiai aprašyta 2 papildomame metode. Išsami informacija apie mtDNR ir ncDNR pradmenis pateikta 4 papildomoje lentelėje.
Gyvos ląstelės buvo nudažytos Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) („Thermo Fisher Scientific“, Karlsbadas, Kalifornija), siekiant vizualizuoti tarpląstelinius ir viduląstelinius mitochondrijų tinklus. LX-2 ląstelės (1 × 104 ląstelių/duobutėje) buvo kultivuojamos ant stiklinių plokštelių atitinkamose stiklinio dugno kultūros plokštelėse („Ibidi GmbH“, Martinsriedas, Vokietija). Po 24 val. gyvos LX-2 ląstelės 20 min. buvo inkubuojamos su 100 μM MTR 37 °C temperatūroje, o ląstelių branduoliai dažomi DAPI (1 μg/ml, „Sigma-Aldrich“), kaip aprašyta anksčiau [29]. Mitochondrijų tinklai buvo vizualizuojami naudojant „Zeiss Axio Observer“ apverstą mikroskopą („Carl Zeiss Microimaging GmbH“, Jena, Vokietija) su „Zeiss LSM 800“ konfokaliniu moduliu 37 °C temperatūroje drėgnoje atmosferoje su 5 % CO2, naudojant 63×NA 1,3 objektyvą. Kiekvienam mėginio tipui gavome dešimt Z serijos vaizdų. Kiekvieną Z seriją sudaro 30 pjūvių, kurių kiekvieno storis yra 9,86 μm. Kiekvieno mėginio vaizdai buvo gauti naudojant ZEN 2009 programinę įrangą („Carl Zeiss Microimaging GmbH“, Jena, Vokietija), o mitochondrijų morfologijos analizė atlikta naudojant „ImageJ“ programinę įrangą (v1.54d) [30, 31] pagal 3 papildomame metode išsamiai aprašytus parametrus.
Ląstelės buvo fiksuotos 2 % glutaraldehido tirpalu 0,1 M fosfato buferyje, po to fiksuotos 1 % osmio tetroksido tirpalu („Sigma Aldrich“, Misūris, JAV), palaipsniui dehidratuotos acetonu („Merck“, Darmštatas, Vokietija) ir galiausiai įterptos į epoksidinę dervą. Paruošti itin ploni pjūviai ir nudažyti 1 % uranilo acetatu („Merck“, Darmštatas, Vokietija) ir 1 % švino citratu („Merck“, Darmštatas, Vokietija). Ultrastruktūriniai vaizdai gauti naudojant JEM 2100F EXII transmisinį elektroninį mikroskopą („JEOL Ltd“, Tokijas, Japonija), esant 80 kV greitėjimo įtampai.
24 valandas IPA apdorotų LX-2 ląstelių morfologija buvo analizuojama fazinio kontrasto mikroskopu, padidinant 50 kartų, naudojant „Zeiss“ apverstos šviesos mikroskopą („Zeiss Axio Vert.A1“ ir „AxioCam MRm“, Jena, Vokietija).
Klinikiniai duomenys buvo išreikšti kaip vidurkis ± standartinis nuokrypis arba mediana (interkvartilinis diapazonas: IQR). Trijų tyrimo grupių skirtumams palyginti buvo naudojama vienfaktorinė dispersijos analizė (tęstiniai kintamieji) arba χ² testas (kategoriniai kintamieji). Klaidingai teigiamų rezultatų dažnis (FDR) buvo naudojamas kartotinių testų korekcijai, o genai, kurių FDR < 0,05, buvo laikomi statistiškai reikšmingais. CpG DNR metilinimo ir IPA signalo intensyvumo koreliacijai naudojama Spearmano koreliacijos analizė, pateikiant nominalias p reikšmes (p < 0,05).
Kelio analizė atlikta naudojant internetinę genų rinkinių analizės priemonę („WebGestalt“), ištyrus 268 transkriptus (nominalus p < 0,01), 119 su mitochondrijomis susijusių transkriptų (nominalus p < 0,05) ir 4350 CpG iš 3093 kepenų transkriptų, kurie buvo susiję su cirkuliuojančio serumo IPA lygiu. Persidengiantiems genams rasti naudota laisvai prieinama „Venny DB“ (2.1.0 versija), o baltymų sąveikai vizualizuoti – „StringDB“ (11.5 versija).
LX-2 eksperimentui mėginių normalumas buvo tiriamas naudojant D'Agostino-Pearson testą. Duomenys buvo gauti iš mažiausiai trijų biologinių pakartojimų ir atlikti vienfaktorine ANOVA su Bonferroni post hoc testu. Statistiškai reikšminga buvo laikoma p reikšmė, mažesnė nei 0,05. Duomenys pateikiami kaip vidurkis ± SD, o kiekviename paveiksle nurodytas eksperimentų skaičius. Visos analizės ir grafikai buvo atlikti naudojant „GraphPad Prism 8“ statistinę programinę įrangą, skirtą „Windows“ („GraphPad Software Inc.“, 8.4.3 versija, San Diegas, JAV).
Pirmiausia ištyrėme serumo IPA lygio ryšį su kepenų, viso kūno ir mitochondrijų transkriptais. Bendrame transkriptų profilyje stipriausiai su serumo IPA lygiu susijęs genas buvo MAPKAPK3 (FDR = 0,0077; mitogenų aktyvuotos baltymų kinazės aktyvuota baltymų kinazė 3); su mitochondrijomis susijusiame transkriptų profilyje stipriausiai su AKT1 susijęs genas buvo AKT1 (FDR = 0,7621; AKT serino/treonino kinazė 1) (1 papildomas failas ir 2 papildomas failas).
Tada išanalizavome globalius transkriptus (n = 268; p < 0,01) ir su mitochondrijomis susijusius transkriptus (n = 119; p < 0,05), galiausiai nustatydami apoptozę kaip reikšmingiausią kanoninį kelią (p = 0,0089). Mitochondrijų transkriptų, susijusių su serumo IPA lygiais, atveju daugiausia dėmesio skyrėme apoptozei (FDR = 0,00001), mitofagijai (FDR = 0,00029) ir TNF signalizacijos keliams (FDR = 0,000006) (1A pav., 2 lentelė ir papildomi 1A–B paveikslai).
Globalių, su mitochondrijomis susijusių transkriptų ir DNR metilinimo žmogaus kepenyse persidengianti analizė, atsižvelgiant į IPA lygį serume. A paveiksle pavaizduoti 268 globaliniai transkriptai, 119 su mitochondrijomis susijusių transkriptų ir metilintų DNR transkriptų, susietų su 3092 CpG vietomis, susijusiomis su IPA lygiu serume (p reikšmės < 0,01 globaliems transkriptams ir metilintai DNR, o p reikšmės < 0,05 mitochondrijų transkriptams). Pagrindiniai persidengiantys transkriptai parodyti viduryje (AKT1 ir YKT6). B 13 genų, turinčių didžiausią sąveikos balą (0,900) su kitais genais, sąveikos žemėlapis buvo sudarytas iš 56 persidengiančių genų (juodos linijos regionas), kurie buvo reikšmingai susiję su IPA lygiu serume, naudojant internetinę priemonę StringDB. Žalia: genai, susieti su genų ontologijos (GO) ląsteliniu komponentu: mitochondrijomis (GO:0005739). AKT1 yra baltymas, turintis didžiausią sąveikos su kitais baltymais balą (0,900), remiantis duomenimis (remiantis teksto analize, eksperimentais, duomenų bazėmis ir koekspresija). Tinklo mazgai vaizduoja baltymus, o kraštai – ryšius tarp baltymų.
Kadangi žarnyno mikrobiotos metabolitai gali reguliuoti epigenetinę sudėtį per DNR metilinimą [32], tyrėme, ar serumo IPA kiekis buvo susijęs su kepenų DNR metilinimu. Nustatėme, kad dvi pagrindinės metilinimo vietos, susijusios su serumo IPA kiekiu, buvo netoli prolino ir serino turtingo 3 regiono (C19orf55) ir šilumos šoko baltymų B šeimos (mažo) 6 nario (HSPB6) (papildomas failas 3). 4350 CpG DNR metilinimas (p < 0,01) koreliavo su serumo IPA kiekiu ir buvo praturtintas ilgaamžiškumo reguliavimo keliais (p = 0,006) (1A pav., 2 lentelė ir papildomas 1C pav.).
Norėdami suprasti biologinius mechanizmus, lemiančius ryšį tarp serumo IPA lygių, globalių transkriptų, su mitochondrijomis susijusių transkriptų ir DNR metilinimo žmogaus kepenyse, atlikome ankstesnėje kelio analizėje nustatytų genų persidengimo analizę (1A pav.). 56 persidengiančių genų (juodos linijos viduje 1A pav.) kelio praturtinimo analizės rezultatai parodė, kad apoptozės kelias (p = 0,00029) išryškino du genus, bendrus trims analizėms: AKT1 ir YKT6 (YKT6 v-SNARE homologas), kaip parodyta Venno diagramoje (papildomas 2 paveikslas ir 1A paveikslas). Įdomu tai, kad nustatėme, jog AKT1 (cg19831386) ir YKT6 (cg24161647) teigiamai koreliavo su serumo IPA lygiais (papildomas 3 failas). Norėdami nustatyti galimas baltymų sąveikas tarp genų produktų, kaip įvesties duomenis pasirinkome 13 genų, turinčių didžiausią bendro regiono balą (0,900) iš 56 persidengiančių genų, ir sudarėme sąveikos žemėlapį. Pagal patikimumo lygį (ribinį patikimumą), AKT1 genas, surinkęs aukščiausią balą (0,900), buvo viršuje (1B pav.).
Remiantis kelio analize, nustatėme, kad apoptozė yra pagrindinis kelias, todėl tyrėme, ar IPA gydymas in vitro paveiktų HSC apoptozę. Anksčiau parodėme, kad skirtingos IPA dozės (10 μM, 100 μM ir 1 mM) nebuvo toksiškos LX-2 ląstelėms [15]. Šis tyrimas parodė, kad IPA gydymas esant 10 μM ir 100 μM koncentracijai padidino gyvybingų ir nekrotinių ląstelių skaičių. Tačiau, palyginti su kontroline grupe, ląstelių gyvybingumas sumažėjo esant 1 mM IPA koncentracijai, o ląstelių nekrozės greitis nepakito (2A, B pav.). Toliau, norėdami rasti optimalią koncentraciją apoptozei sukelti LX-2 ląstelėse, 24 val. testavome 10 μM, 100 μM ir 1 mM IPA (2A–E pav. ir papildomas 3A–B pav.). Įdomu tai, kad IPA 10 μM ir 100 μM sumažino apoptozės dažnį (%), tačiau IPA 1 mM padidino vėlyvąją apoptozę ir apoptozės dažnį (%), palyginti su kontroline grupe, todėl buvo pasirinktas tolesniems eksperimentams (2A–D paveikslai).
IPA sukelia LX-2 ląstelių apoptozę. Apoptozės greičiui ir ląstelių morfologijai kiekybiškai įvertinti srauto citometrijos metodu buvo naudojamas aneksino V ir 7-AAD dvigubo dažymo metodas. BA ląstelės buvo inkubuojamos su 10 μM, 100 μM ir 1 mM IPA 24 val. arba su F–H TGF-β1 (5 ng/ml) ir 1 mM IPA serumo neturinčioje terpėje 24 val. A: gyvos ląstelės (aneksinas V - / 7AAD-); B: nekrotinės ląstelės (aneksinas V - / 7AAD+); C, F: ankstyvosios (aneksinas V + / 7AAD-); D, G: vėlyvosios (aneksinas V+ / 7AAD.+); E, H: bendro ankstyvųjų ir vėlyvųjų apoptozės ląstelių skaičiaus procentinė dalis pagal apoptozės greitį (%). Duomenys išreikšti kaip vidurkis ± SD, n = 3 nepriklausomi eksperimentai. Statistiniai palyginimai atlikti naudojant vienfaktorinę ANOVA su Bonferroni post hoc testu. *p < 0,05; ****p < 0,0001
Kaip jau anksčiau parodėme, 5 ng/ml TGF-β1 gali sukelti HSC aktyvaciją, padidindamas klasikinių žymenų genų ekspresiją [15]. LX-2 ląstelės buvo apdorotos 5 ng/ml TGF-β1 ir 1 mM IPA deriniu (2E–H pav.). TGF-β1 gydymas nepakeitė apoptozės greičio, tačiau IPA derinys padidino vėlyvąją apoptozę ir apoptozės greitį (%), palyginti su TGF-β1 gydymu (2E–H pav.). Šie rezultatai rodo, kad 1 mM IPA gali skatinti apoptozę LX-2 ląstelėse nepriklausomai nuo TGF-β1 indukcijos.
Toliau tyrėme IPA poveikį mitochondrijų kvėpavimui LX-2 ląstelėse. Rezultatai parodė, kad 1 mM IPA sumažino deguonies suvartojimo greičio (OCR) parametrus: nemitochondrinį kvėpavimą, bazinį ir maksimalų kvėpavimą, protonų nutekėjimą ir ATP gamybą, palyginti su kontroline grupe (3A, B pav.), o bioenergetinis sveikatos indeksas (BHI) nepakito.
IPA sumažina mitochondrijų kvėpavimą LX-2 ląstelėse. Mitochondrijų kvėpavimo kreivė (OCR) pateikiama kaip mitochondrijų kvėpavimo parametrai (ne mitochondrijų kvėpavimas, bazinis kvėpavimas, maksimalus kvėpavimas, protonų nutekėjimas, ATP generavimas, SRC ir BHI). Ląstelės A ir B buvo inkubuojamos atitinkamai su 10 μM, 100 μM ir 1 mM IPA 24 val. Ląstelės C ir D buvo inkubuojamos atitinkamai su TGF-β1 (5 ng/ml) ir 1 mM IPA serumo neturinčioje terpėje 24 val. Visi matavimai buvo normalizuoti pagal DNR kiekį naudojant „CyQuant“ rinkinį. BHI: bioenergetinis sveikatos indeksas; SRC: kvėpavimo rezervo talpa; OCR: deguonies suvartojimo greitis. Duomenys pateikiami kaip vidurkis ± standartinis nuokrypis (SN), n = 5 nepriklausomi eksperimentai. Statistiniai palyginimai atlikti naudojant vienfaktorinę ANOVA ir Bonferroni post hoc testą. *p < 0,05; **p < 0,01; ir ***p < 0,001
Siekdami geriau suprasti IPA poveikį TGF-β1 aktyvuotų LX-2 ląstelių bioenergetiniam profiliui, analizavome mitochondrijų oksidacinį fosforilinimą OCR metodu (3C, D pav.). Rezultatai parodė, kad gydymas TGF-β1 galėjo sumažinti maksimalų kvėpavimą, kvėpavimo rezervo talpą (SRC) ir BHI, palyginti su kontroline grupe (3C, D pav.). Be to, kombinuotas gydymas sumažino bazinį kvėpavimą, protonų nutekėjimą ir ATP gamybą, tačiau SRC ir BHI buvo žymiai didesni nei gydytų TGF-β1 (3C, D pav.).
Taip pat atlikome „Seahorse“ programinės įrangos pateiktą „ląstelės energijos fenotipo testą“ (papildomas 4A–D pav.). Kaip parodyta papildomame 3B paveiksle, tiek OCR, tiek ECAR metaboliniai potencialai sumažėjo po TGF-β1 gydymo, tačiau kombinuoto ir IPA gydymo grupėse skirtumo, palyginti su kontroline grupe, nepastebėta. Be to, tiek bazinis, tiek streso lygis sumažėjo po kombinuoto ir IPA gydymo, palyginti su kontroline grupe (papildomas 4C pav.). Įdomu tai, kad panašus modelis pastebėtas ir taikant kombinuotąją terapiją, kai bazinis ir streso lygis nepakito, palyginti su TGF-β1 gydymu (papildomas 4C pav.). HSC atveju mitochondrijų oksidacinio fosforilinimo sumažėjimas ir kombinuoto gydymo gebėjimas atkurti SCR ir BHI po TGF-β1 gydymo nepakeitė metabolinio potencialo (OCR ir ECAR). Apibendrinus, šie rezultatai rodo, kad IPA gali sumažinti bioenergetiką HSC, o tai rodo, kad IPA gali sukelti mažesnį energetinį profilį, kuris nukreipia HSC fenotipą link inaktyvacijos (papildomas 4D pav.).
IPA poveikis mitochondrijų dinamikai buvo tirtas naudojant trimatį mitochondrijų morfologijos ir tinklo jungčių kiekybinį įvertinimą, taip pat MTR dažymą (4 pav. ir papildomas 5 pav.). 4 paveiksle parodyta, kad, palyginti su kontroline grupe, TGF-β1 gydymas sumažino vidutinį paviršiaus plotą, šakų skaičių, bendrą šakų ilgį ir šakų jungčių skaičių (4A ir B pav.) ir pakeitė mitochondrijų dalį iš sferinės į tarpinę morfologiją (4C pav.). Tik IPA gydymas sumažino vidutinį mitochondrijų tūrį ir pakeitė mitochondrijų dalį iš sferinės į tarpinę morfologiją, palyginti su kontroline grupe (4A pav.). Priešingai, sferiškumas, vidutinis šakų ilgis ir mitochondrijų aktyvumas, įvertinti mitochondrijų membranos potencialo priklausomu MTR (4A ir E pav.), nepakito ir šie parametrai tarp grupių nesiskyrė. Apibendrinus šiuos rezultatus, galima teigti, kad TGF-β1 ir IPA gydymas, atrodo, moduliuoja mitochondrijų formą ir dydį, taip pat tinklo sudėtingumą gyvose LX-2 ląstelėse.
IPA keičia mitochondrijų dinamiką ir mitochondrijų DNR gausą LX-2 ląstelėse. A. Gyvų LX-2 ląstelių, inkubuotų su TGF-β1 (5 ng/ml) ir 1 mM IPA 24 val. beserumo terpėje, reprezentatyvūs konfokaliniai vaizdai, rodantys mitochondrijų tinklus, nudažytus Mitotracker™ Red CMXRos, ir branduolius, nudažytus mėlynai DAPI. Visuose duomenyse buvo bent 15 vaizdų iš kiekvienos grupės. Kiekvienam mėginių tipui gavome 10 Z steko vaizdų. Kiekvienoje Z ašies sekoje buvo 30 pjūvių, kurių kiekvieno storis buvo 9,86 μm. Mastelio juosta: 10 μm. B. Reprezentatyvūs objektai (tik mitochondrijos), identifikuoti pritaikius vaizdui adaptyvų slenksčių nustatymą. Kiekybinė mitochondrijų morfologinių tinklo ryšių analizė ir palyginimas atliktas visoms kiekvienos grupės ląstelėms. C. Mitochondrijų formos santykių dažnis. Vertės, artimos 0, rodo sferines formas, o vertės, artimos 1, rodo filamentines formas. D Mitochondrijų DNR (mtDNR) kiekis nustatytas, kaip aprašyta skyriuje „Medžiagos ir metodai“. E Mitotracker™ Red CMXRos analizė atlikta srauto citometrijos metodu (30 000 įvykių), kaip aprašyta skyriuje „Medžiagos ir metodai“. Duomenys pateikiami kaip vidurkis ± SD, n = 3 nepriklausomi eksperimentai. Statistiniai palyginimai atlikti naudojant vienfaktorinę ANOVA ir Bonferroni post hoc testą. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001
Tuomet analizavome mtDNR kiekį LX-2 ląstelėse kaip mitochondrijų skaičiaus rodiklį. Palyginti su kontroline grupe, TGF-β1 gydytoje grupėje mtDNR kiekis buvo padidėjęs (4D pav.). Palyginti su TGF-β1 gydyta grupe, kombinuoto gydymo grupėje mtDNR kiekis buvo sumažėjęs (4D pav.), o tai rodo, kad IPA gali sumažinti mtDNR kiekį ir galbūt mitochondrijų skaičių, taip pat mitochondrijų kvėpavimą (3C pav.). Be to, atrodo, kad IPA sumažino mtDNR kiekį kombinuotame gydyme, tačiau neturėjo įtakos MTR sukeltam mitochondrijų aktyvumui (4A–C pav.).
Ištyrėme IPA ryšį su genų, susijusių su fibroze, apoptoze, išgyvenimu ir mitochondrijų dinamika, mRNR lygiais LX-2 ląstelėse (5A–D pav.). Palyginti su kontroline grupe, TGF-β1 gydytoje grupėje buvo padidėjusi tokių genų kaip I tipo kolageno α2 grandinė (COL1A2), α-lygiųjų raumenų aktinas (αSMA), matrikso metaloproteinazė 2 (MMP2), audinių metaloproteinazės 1 inhibitorius (TIMP1) ir dinamino 1 tipo genas (DRP1) raiška, rodanti padidėjusią fibrozę ir aktyvaciją. Be to, palyginti su kontroline grupe, TGF-β1 gydymas sumažino branduolinio pregnano X receptoriaus (PXR), kaspazės 8 (CASP8), MAPKAPK3, B ląstelių α inhibitoriaus, branduolinio faktoriaus κ geno šviesos peptido stiprintojo (NFκB1A) ir branduolinio faktoriaus κB kinazės subvieneto β inhibitoriaus (IKBKB) mRNR lygius (5A–D pav.). Palyginti su TGF-β1 gydymu, kombinuotas gydymas TGF-β1 ir IPA sumažino COL1A2 ir MMP2 raišką, tačiau padidino PXR, TIMP1, B ląstelių limfomos-2 (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β ir IKBKB mRNR lygius. IPA gydymas reikšmingai sumažino MMP2, su Bcl-2 susijusio baltymo X (BAX), AKT1, regos nervo atrofijos baltymo 1 (OPA1) ir mitochondrijų susiliejimo baltymo 2 (MFN2) raišką, o CASP8, NFκB1A, NFκB1B ir IKBKB raiška padidėjo, palyginti su kontroline grupe. Tačiau kaspazės-3 (CASP3), apoptozės peptidazę aktyvuojančio faktoriaus 1 (APAF1), mitochondrijų susiliejimo baltymo 1 (MFN1) ir dalijimosi baltymo 1 (FIS1) raiškoje skirtumų nerasta. Apibendrinus šiuos rezultatus, galima teigti, kad IPA gydymas moduliuoja su fibroze, apoptoze, išgyvenimu ir mitochondrijų dinamika susijusių genų raišką. Mūsų duomenys rodo, kad IPA gydymas sumažina fibrozę LX-2 ląstelėse; tuo pačiu metu jis stimuliuoja išgyvenimą, pakeisdamas fenotipą inaktyvacijos link.
IPA moduliuoja fibroblastų, apoptozės, gyvybingumo ir mitochondrijų dinamikos genų ekspresiją LX-2 ląstelėse. Histogramose pavaizduota mRNR ekspresija, palyginti su endogenine kontrole (RPLP0 arba PPIA), po to, kai LX-2 ląstelės buvo indukuotos TGF-β1 ir IPA serumo neturinčioje terpėje 24 val. A žymi fibroblastus, B žymi apoptozės ląsteles, C žymi išgyvenusias ląsteles, o D žymi mitochondrijų dinamikos genų ekspresiją. Duomenys pateikiami kaip vidurkis ± standartinis nuokrypis (SN), n = 3 nepriklausomi eksperimentai. Statistiniai palyginimai atlikti naudojant vienfaktorinę ANOVA ir Bonferroni post hoc testą. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001
Tuomet ląstelių dydžio (FSC-H) ir citoplazminio sudėtingumo (SSC-H) pokyčiai buvo įvertinti srauto citometrija (6A, B pav.), o ląstelių morfologijos pokyčiai po IPA gydymo buvo įvertinti transmisijinės elektroninės mikroskopijos (TEM) ir fazinio kontrasto mikroskopijos (papildomas 6A-B pav.). Kaip ir tikėtasi, TGF-β1 gydytos grupės ląstelės padidėjo, palyginti su kontroline grupe (6A, B pav.), rodydamos klasikinį šiurkštaus endoplazminio tinklo (ER*) ir fagolizosomų (P) išsiplėtimą, rodantį kraujodaros kamieninių ląstelių (HSC) aktyvaciją (papildomas 6A pav.). Tačiau, palyginti su TGF-β1 gydyta grupe, TGF-β1 ir IPA derinio gydymo grupėje ląstelių dydis, citoplazminis sudėtingumas (6A, B pav.) ir ER* kiekis sumažėjo (papildomas 6A pav.). Be to, IPA gydymas sumažino ląstelių dydį, citoplazminį sudėtingumą (6A, B pav.), P ir ER* kiekį (papildomas 6A pav.), palyginti su kontroline grupe. Be to, po 24 val. IPA gydymo apoptozinių ląstelių kiekis padidėjo, palyginti su kontroline grupe (baltos rodyklės, papildomas 6B pav.). Apibendrinus šiuos rezultatus, galima teigti, kad 1 mM IPA gali stimuliuoti HSC apoptozę ir panaikinti TGF-β1 sukeltus ląstelių morfologinių parametrų pokyčius, taip reguliuodamas ląstelių dydį ir sudėtingumą, kurie gali būti susiję su HSC inaktyvacija.
IPA keičia LX-2 ląstelių dydį ir citoplazmos sudėtingumą. Srauto citometrijos analizės reprezentatyvūs vaizdai. Analizėje buvo naudojama LX-2 ląstelėms būdinga sinchronizavimo strategija: SSC-A/FSC-A ląstelių populiacijai apibrėžti, FSC-H/FSC-A dubletams identifikuoti ir SSC-H/FSC-H ląstelių dydžio ir sudėtingumo analizei. Ląstelės buvo inkubuojamos su TGF-β1 (5 ng/ml) ir 1 mM IPA serumo neturinčioje terpėje 24 val. LX-2 ląstelės buvo paskirstytos į apatinį kairįjį kvadrantą (SSC-H-/FSC-H-), viršutinį kairįjį kvadrantą (SSC-H+/FSC-H-), apatinį dešinįjį kvadrantą (SSC-H-/FSC-H+) ir viršutinį dešinįjį kvadrantą (SSC-H+/FSC-H+) ląstelių dydžio ir citoplazmos sudėtingumo analizei. B. Ląstelių morfologija buvo analizuojama srauto citometrijos metodu, naudojant FSC-H (tiesioginė sklaida, ląstelės dydis) ir SSC-H (šoninė sklaida, citoplazmos sudėtingumas) (30 000 įvykių). Duomenys pateikiami kaip vidurkis ± SD, n = 3 nepriklausomi eksperimentai. Statistiniai palyginimai atlikti naudojant vienfaktorinę ANOVA ir Bonferroni post hoc testą. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001 ir ****p < 0,0001
Žarnyno metabolitai, tokie kaip IPA, tapo karšta tyrimų tema, rodančia, kad žarnyno mikrobiotoje gali būti atrasti nauji taikiniai. Todėl įdomu, kad IPA, metabolitas, kurį susiejome su kepenų fibroze žmonėms [15], gyvūnų modeliuose pasirodė esąs potencialus antifibrozinis junginys [13, 14]. Šiame darbe pirmą kartą parodome ryšį tarp serumo IPA ir pasaulinės kepenų transkriptomikos bei DNR metilinimo nutukusiems asmenims, nesergantiems 2 tipo diabetu (T2D), pabrėžiant apoptozę, mitofagiją ir ilgaamžiškumą, taip pat galimą AKT1 geną kandidatą, reguliuojantį kepenų homeostazę. Kita mūsų tyrimo naujovė yra ta, kad parodėme IPA gydymo sąveiką su apoptoze, ląstelių morfologija, mitochondrijų bioenergetika ir dinamika LX-2 ląstelėse, o tai rodo žemesnės energijos spektrą, kuris keičia HSC fenotipą inaktyvacijos link, todėl IPA yra potencialus kandidatas kepenų fibrozės gerinimui.
Nustatėme, kad apoptozė, mitofagija ir ilgaamžiškumas buvo svarbiausi kanoniniai keliai, praturtinti kepenų genais, susijusiais su cirkuliuojančiu serumo IPA. Mitochondrijų kokybės kontrolės (MQC) sistemos sutrikimas gali sukelti mitochondrijų disfunkciją, mitofagiją ir apoptozę, taip skatindamas MASLD atsiradimą [33, 34]. Todėl galime spėlioti, kad IPA gali būti susijęs su ląstelių dinamikos ir mitochondrijų vientisumo palaikymu per apoptozę, mitofagiją ir ilgaamžiškumą kepenyse. Mūsų duomenys parodė, kad visuose trijuose tyrimuose buvo bendri du genai: YKT6 ir AKT1. Verta paminėti, kad YKT6 yra SNARE baltymas, dalyvaujantis ląstelių membranų susiliejimo procese. Jis atlieka vaidmenį autofagijoje ir mitofagijoje, sudarydamas iniciacijos kompleksą su STX17 ir SNAP29 autofagosomoje, taip skatindamas autofagosomų ir lizosomų susiliejimą [35]. Be to, YKT6 funkcijos praradimas sutrikdo mitofagiją [36], o YKT6 reguliacijos padidėjimas yra susijęs su hepatocelulinės karcinomos (HCC) progresavimu, rodančiu padidėjusį ląstelių išgyvenamumą [37]. Kita vertus, AKT1 yra svarbiausias sąveikaujantis genas ir vaidina svarbų vaidmenį kepenų ligose, įskaitant PI3K/AKT signalizacijos kelią, ląstelių ciklą, ląstelių migraciją, proliferaciją, židinio adheziją, mitochondrijų funkciją ir kolageno sekreciją [38–40]. Aktyvuotas PI3K/AKT signalizacijos kelias gali aktyvuoti kraujodaros kamienines ląsteles (HSC), kurios yra ląstelės, atsakingos už tarpląstelinės matricos (ECM) gamybą, o jo disreguliacija gali prisidėti prie kepenų fibrozės atsiradimo ir progresavimo [40]. Be to, AKT yra vienas iš pagrindinių ląstelių išgyvenimo faktorių, slopinantis nuo p53 priklausomą ląstelių apoptozę, o AKT aktyvacija gali būti susijusi su kepenų ląstelių apoptozės slopinimu [41, 42]. Gauti rezultatai rodo, kad IPA gali būti susijęs su kepenų mitochondrijų sukelta apoptoze, paveikdamas hepatocitų sprendimą tarp apoptozės pradžios ir išgyvenimo. Šį poveikį gali reguliuoti AKT ir (arba) YKT6 kandidatų genai, kurie yra labai svarbūs kepenų homeostazei.
Mūsų rezultatai parodė, kad 1 mM IPA sukėlė apoptozę ir sumažino mitochondrijų kvėpavimą LX-2 ląstelėse, nepriklausomai nuo TGF-β1 gydymo. Pažymėtina, kad apoptozė yra pagrindinis fibrozės sprendimo ir hematopoetinių kamieninių ląstelių (HSC) aktyvacijos kelias, taip pat yra pagrindinis įvykis grįžtamajame fiziologiniame kepenų fibrozės atsake [4, 43]. Be to, BHI atkūrimas LX-2 ląstelėse po kombinuoto gydymo suteikė naujų įžvalgų apie galimą IPA vaidmenį reguliuojant mitochondrijų bioenergetiką. Ramybės ir neaktyviomis sąlygomis hematopoetinės ląstelės paprastai naudoja mitochondrijų oksidacinį fosforilinimą ATP gamybai ir pasižymi mažu metaboliniu aktyvumu. Kita vertus, HSC aktyvacija sustiprina mitochondrijų kvėpavimą ir biosintezę, kad kompensuotų energijos poreikius, reikalingus glikolizės būsenai pereiti [44]. Tai, kad IPA neturėjo įtakos metaboliniam potencialui ir ECAR, rodo, kad glikolizės kelias yra mažiau prioritetinis. Panašiai, kitas tyrimas parodė, kad 1 mM IPA galėjo moduliuoti mitochondrijų kvėpavimo grandinės aktyvumą kardiomiocituose, žmogaus hepatocitų ląstelių linijoje (Huh7) ir žmogaus bambos venos endotelio ląstelėse (HUVEC); Vis dėlto IPA poveikio glikolizei kardiomiocituose nenustatyta, o tai rodo, kad IPA gali paveikti kitų ląstelių tipų bioenergetiką [45]. Todėl spėjame, kad 1 mM IPA gali veikti kaip švelnus cheminis atjungiklis, nes jis gali reikšmingai sumažinti fibrogeninių genų ekspresiją, ląstelių morfologiją ir mitochondrijų bioenergetiką nekeisdamas mtDNR kiekio [46]. Mitochondrijų atjungikliai gali slopinti kultūros sukeltą fibrozę ir HSC aktyvaciją [47] ir sumažinti mitochondrijų ATP gamybą, kurią reguliuoja arba indukuoja tam tikri baltymai, tokie kaip atjungikliai (UCP) arba adenino nukleotidų translokazė (ANT). Priklausomai nuo ląstelių tipo, šis reiškinys gali apsaugoti ląsteles nuo apoptozės ir (arba) skatinti apoptozę [46]. Tačiau reikia atlikti tolesnius tyrimus, siekiant išsiaiškinti IPA, kaip mitochondrijų atjungiklio, vaidmenį kraujodaros kamieninių ląstelių inaktyvavime.
Tada tyrėme, ar mitochondrijų kvėpavimo pokyčiai atsispindi gyvų LX-2 ląstelių mitochondrijų morfologijoje. Įdomu tai, kad gydymas TGF-β1 pakeičia mitochondrijų proporciją iš sferinės į tarpinę, sumažindamas mitochondrijų išsišakojimą ir padidindamas DRP1, pagrindinio mitochondrijų dalijimosi veiksnio, raišką [48]. Be to, mitochondrijų fragmentacija yra susijusi su bendru tinklo sudėtingumu, o perėjimas nuo susiliejimo prie dalijimosi yra labai svarbus kraujodaros kamieninių ląstelių (HSC) aktyvacijai, o mitochondrijų dalijimosi slopinimas sukelia HSC apoptozę [49]. Taigi, mūsų rezultatai rodo, kad gydymas TGF-β1 gali sukelti mitochondrijų tinklo sudėtingumo sumažėjimą, sumažinant išsišakojimą, kuris dažniau pasitaiko mitochondrijų dalijimosi metu, susijusiame su aktyvuotomis kraujodaros kamieninėmis ląstelėmis (HSC). Be to, mūsų duomenys parodė, kad IPA gali pakeisti mitochondrijų proporciją iš sferinės į tarpinę formą, taip sumažindamas OPA1 ir MFN2 raišką. Tyrimai parodė, kad OPA1 reguliacijos sumažinimas gali sumažinti mitochondrijų membranos potencialą ir sukelti ląstelių apoptozę [50]. Yra žinoma, kad MFN2 tarpininkauja mitochondrijų susiliejimui ir apoptozei [51]. Gauti rezultatai rodo, kad LX-2 ląstelių indukcija TGF-β1 ir (arba) IPA, atrodo, moduliuoja mitochondrijų formą ir dydį, taip pat aktyvacijos būseną ir tinklo sudėtingumą.
Mūsų rezultatai rodo, kad kombinuotas TGFβ-1 ir IPA gydymas gali sumažinti mtDNR ir ląstelių morfologinius parametrus, reguliuodamas fibrozės, apoptozės ir su išgyvenimu susijusių genų mRNR raišką apoptozės vengiančiose ląstelėse. Iš tiesų, IPA sumažino AKT1 ir svarbių fibrozės genų, tokių kaip COL1A2 ir MMP2, mRNR raiškos lygį, tačiau padidino CASP8, kuris yra susijęs su apoptoze, raiškos lygį. Mūsų rezultatai parodė, kad po IPA gydymo sumažėjo BAX raiška ir padidėjo TIMP1 šeimos subvienetų, BCL-2 ir NF-κB, mRNR raiška, o tai rodo, kad IPA gali stimuliuoti išgyvenimo signalus kraujodaros kamieninėse ląstelėse (HSC), kurios vengia apoptozės. Šios molekulės gali veikti kaip išgyvenimą skatinantys signalai aktyvuotose kraujodaros kamieninėse ląstelėse, o tai gali būti susiję su padidėjusia antiapoptozinių baltymų (tokių kaip Bcl-2) raiška, sumažėjusia proapoptozinio BAX raiška ir sudėtinga TIMP ir NF-κB sąveika [5, 7]. IPA veikia per PXR, ir mes nustatėme, kad kombinuotas gydymas TGF-β1 ir IPA padidino PXR mRNR ekspresijos lygius, o tai rodo HSC aktyvacijos slopinimą. Yra žinoma, kad aktyvuotas PXR signalizacija slopina HSC aktyvaciją tiek in vivo, tiek in vitro [52, 53]. Mūsų rezultatai rodo, kad IPA gali dalyvauti aktyvuotų HSC klirense skatindamas apoptozę, mažindamas fibrozę ir mitochondrijų metabolizmą bei stiprindamas išgyvenimo signalus, kurie yra tipiniai procesai, konvertuojantys aktyvuotą HSC fenotipą į inaktyvuotą. Kitas galimas IPA galimo mechanizmo ir vaidmens apoptozėje paaiškinimas yra tas, kad jis naikina disfunkcines mitochondrijas daugiausia per mitofagiją (vidinis kelias) ir išorinį TNF signalizacijos kelią (1 lentelė), kuris yra tiesiogiai susijęs su NF-κB išgyvenimo signalizacijos keliu (papildomas 7 paveikslas). Įdomu tai, kad su IPA susiję praturtinti genai gali sukelti proapoptozinius ir proapoptozinius signalus apoptozės kelyje [54], o tai rodo, kad IPA gali sukelti apoptozės kelią arba išgyvenimą sąveikaudamas su šiais genais. Tačiau lieka neaišku, kaip IPA sukelia apoptozę arba išgyvenimą HSC aktyvacijos metu ir kaip vyksta jo mechanistiniai keliai.
IPA yra mikrobų metabolitas, susidarantis iš su maistu gaunamo triptofano per žarnyno mikrobiotą. Tyrimai parodė, kad jis pasižymi priešuždegiminėmis, antioksidacinėmis ir epigenetinėmis reguliavimo savybėmis žarnyno aplinkoje.[55] Tyrimai parodė, kad IPA gali moduliuoti žarnyno barjerinę funkciją ir sumažinti oksidacinį stresą, o tai gali prisidėti prie jo vietinio fiziologinio poveikio.[56] Iš tiesų, IPA pernešamas į organus taikinius per kraujotaką, ir kadangi IPA pagrindinio metabolito struktūra panaši į triptofano, serotonino ir indolo darinių, IPA sukelia metabolinius veiksmus, dėl kurių metaboliniai likimai konkuruoja.[52] IPA gali konkuruoti su triptofano kilmės metabolitais dėl prisijungimo vietų prie fermentų ar receptorių, galbūt sutrikdydamas normalius metabolizmo kelius. Tai pabrėžia, kad reikia atlikti tolesnius jo farmakokinetikos ir farmakodinamikos tyrimus, siekiant geriau suprasti jo terapinį langą.[57] Dar reikia išsiaiškinti, ar tai gali pasireikšti ir kraujodaros kamieninėse ląstelėse (HSC).
Pripažįstame, kad mūsų tyrimas turi tam tikrų apribojimų. Norėdami konkrečiai ištirti su IPA susijusius ryšius, neįtraukėme pacientų, sergančių 2 tipo cukriniu diabetu (T2DM). Pripažįstame, kad tai riboja mūsų išvadų platų pritaikomumą pacientams, sergantiems 2 tipo cukriniu diabetu ir progresavusia kepenų liga. Nors fiziologinė IPA koncentracija žmogaus serume yra 1–10 μM [11, 20], 1 mM IPA koncentracija buvo pasirinkta remiantis didžiausia netoksiška koncentracija [15] ir didžiausiu apoptozės greičiu, nekrozinių ląstelių populiacijos procentinei daliai nesiskiriant. Nors šiame tyrime buvo naudojami suprafiziologiniai IPA lygiai, šiuo metu nėra sutarimo dėl veiksmingos IPA dozės [52]. Nors mūsų rezultatai yra reikšmingi, platesnis IPA metabolinis likimas išlieka aktyvia tyrimų sritimi. Be to, mūsų išvados apie ryšį tarp serumo IPA lygių ir kepenų transkriptų DNR metilinimo buvo gautos ne tik iš kraujodaros kamieninių ląstelių (HSC), bet ir iš kepenų audinių. Remdamiesi ankstesniais transkriptomo analizės rezultatais, kad IPA yra susijusi su kraujodaros kamieninių ląstelių (HSC) aktyvacija [15], o HSC yra pagrindinės ląstelės, dalyvaujančios kepenų fibrozės progresavime, pasirinkome naudoti žmogaus LX-2 ląsteles. Kepenis sudaro daug ląstelių tipų, todėl, norint ištirti IPA vaidmenį ir jo sąveiką su kitais kepenų ląstelių tipais, reikėtų atsižvelgti į kitus ląstelių modelius, tokius kaip hepatocitų, HSC ir imuninių ląstelių kokultūros sistema, derinama su kaspazės aktyvacija ir DNR fragmentacija, taip pat į veikimo mechanizmą, įskaitant baltymų lygį.