Įvairios augalų apsaugos teorijos suteikia svarbių teorinių gairių, paaiškinančių specializuoto augalų metabolizmo modelius, tačiau pagrindinės jų prognozės dar turi būti patikrintos. Čia mes panaudojome nešališką tandeminę masių spektrometrijos (MS/MS) analizę, kad sistemingai ištirtume tabako susilpnintų padermių metabolomą nuo atskirų augalų iki populiacijų ir glaudžiai susijusių rūšių, ir apdorojome daugybę masių spektrometrinių požymių teorijų, pagrįstų junginių spektrais informacijoje. Sistema, skirta patikrinti pagrindines optimalios gynybos (OD) ir judančio taikinio (MT) teorijų prognozes. Augalų metabolomikos informacijos komponentas atitinka OD teoriją, tačiau prieštarauja pagrindinei MT teorijos prognozei apie žolėdžių sukeltą metabolomikos dinamiką. Nuo mikro iki makro evoliucijos masto jazmonato signalas buvo identifikuotas kaip pagrindinis OD veiksnys, o etileno signalas suteikė tikslų žolėdžių specifinio atsako, anotuoto MS/MS molekulinio tinklo, derinimą.
Specialūs metabolitai su įvairiomis struktūromis yra pagrindiniai augalų prisitaikymo prie aplinkos dalyviai, ypač ginantis nuo priešų (1). Nuostabi specialios medžiagų apykaitos, randamos augaluose, įvairovė paskatino dešimtmečius trukusius išsamius tyrimus, susijusius su daugeliu ekologinių funkcijų aspektų, ir suformavo ilgą augalų apsaugos teorijų, kurios yra augalų ir vabzdžių sąveikos evoliucinė ir ekologinė raida, sąrašą. Empiriniai tyrimai teikia svarbių gairių (2). Tačiau šios augalų apsaugos teorijos nesekė normatyviniu hipotetinio dedukcinio samprotavimo keliu, kuriame pagrindinės prognozės buvo tame pačiame analizės lygyje (3) ir buvo išbandytos eksperimentiškai, siekiant pereiti prie kito teorinio vystymosi ciklo (4). Techniniai apribojimai riboja duomenų rinkimą iki konkrečių medžiagų apykaitos kategorijų ir neleidžia atlikti išsamios specializuotų metabolitų analizės, taip užkertant kelią tarpkategorijų palyginimams, kurie yra būtini teoriniam vystymuisi (5). Išsamių metabolomikos duomenų ir bendros valiutos, skirtos palyginti medžiagų apykaitos erdvės apdorojimo eigą tarp skirtingų augalų grupių, trūkumas trukdo šios srities mokslinei brandai.
Naujausi tandeminės masių spektrometrijos (MS/MS) metabolomikos srities pasiekimai gali išsamiai apibūdinti metabolinius pokyčius tam tikros sistemos klado rūšių viduje ir tarp jų, ir gali būti derinami su skaičiavimo metodais, siekiant apskaičiuoti šių sudėtingų mišinių struktūrinį panašumą. Ankstesnės chemijos žinios (5). Pažangių analizės ir skaičiavimo technologijų derinys suteikia būtiną pagrindą ilgalaikiam daugelio ekologinių ir evoliucinių metabolinės įvairovės teorijų prognozių patikrinimui. Shannon (6) pirmą kartą pristatė informacijos teoriją savo svarbiame straipsnyje 1948 m., padėdamas pagrindus matematinei informacijos analizei, kuri buvo naudojama daugelyje kitų sričių, ne tik savo pradiniame taikyme. Genomikoje informacijos teorija buvo sėkmingai taikoma sekos konservatyviai informacijai kiekybiškai įvertinti (7). Transkriptomikos tyrimuose informacijos teorija analizuoja bendrus transkriptomo pokyčius (8). Ankstesniuose tyrimuose taikėme statistinę informacijos teorijos sistemą metabolomikai, kad apibūdintume audinių lygmens metabolinę kompetenciją augaluose (9). Čia mes sujungiame MS/MS pagrįstą darbo eigą su informacijos teorijos statistine sistema, kuriai būdinga medžiagų apykaitos įvairovė bendroje valiutoje, kad palygintume pagrindines žolėdžių sukelto metabolito augalų apsaugos teorijos prognozes.
Augalų apsaugos teoriniai pagrindai paprastai yra tarpusavyje susiję ir gali būti suskirstyti į dvi kategorijas: tie, kurie bando paaiškinti augalams būdingų metabolitų pasiskirstymą remiantis gynybos funkcijomis, pavyzdžiui, optimalios gynybos (OD) (10), judančio taikinio (MT) (11) ir išvaizdos (12) teorija, o kiti ieško mechaninių paaiškinimų, kaip išteklių prieinamumo pokyčiai veikia augalų augimą ir specializuotų metabolitų, tokių kaip anglis, kaupimąsi: maistinių medžiagų pusiausvyros hipotezė (13), augimo greičio hipotezė (14) ir augimo bei diferenciacijos pusiausvyros hipotezė (15). Šios dvi teorijų grupės yra skirtinguose analizės lygiuose (4). Tačiau diskusijoje apie augalų konstitucinę ir indukuojamą gynybą dominuoja dvi teorijos, apimančios gynybines funkcijas funkciniu lygmeniu: OD teorija, kuri daro prielaidą, kad augalai investuoja į brangią cheminę gynybą tik tada, kai to reikia, pavyzdžiui, kai juos praryja. Kai puola žolinis gyvūnas, atsižvelgiant į būsimo puolimo galimybę, priskiriamas junginys, turintis gynybinę funkciją (10); MT hipotezė teigia, kad nėra kryptingo metabolito kitimo ašies, tačiau metabolitas kinta atsitiktinai, taip sudarydamas galimybę trukdyti puolančių žolėdžių metaboliniam „judėjimo taikiniui“. Kitaip tariant, šios dvi teorijos pateikia priešingas prognozes apie metabolinį pertvarkymą, kuris vyksta po žolėdžių atakos: ryšį tarp vienakrypčio metabolitų, turinčių gynybinę funkciją (OD), kaupimosi ir nekryptingų metabolinių pokyčių (MT) (11).
OD ir MT hipotezės apima ne tik sukeltus metabolomo pokyčius, bet ir šių metabolitų kaupimosi ekologines bei evoliucines pasekmes, tokias kaip šių metabolinių pokyčių adaptacinės išlaidos ir nauda konkrečioje ekologinėje aplinkoje (16). Nors abi hipotezės pripažįsta specializuotų metabolitų gynybinę funkciją, kuri gali būti brangi arba ne, pagrindinė prognozė, skirianti OD ir MT hipotezes, yra sukeltų metabolinių pokyčių kryptingumas. OD teorijos prognozė iki šiol sulaukė daugiausiai eksperimentinio dėmesio. Šie bandymai apima tiesioginių ar netiesioginių skirtingų audinių, turinčių specifinius junginius, gynybinių funkcijų tyrimą šiltnamiuose ir natūraliomis sąlygomis, taip pat augalų vystymosi stadijos pokyčius (17–19). Tačiau iki šiol, dėl darbo eigos ir statistinės sistemos, skirtos pasaulinei išsamiai bet kurio organizmo metabolinės įvairovės analizei, trūkumo, pagrindinis skirtumo tarp šių dviejų teorijų prognozavimas (t. y. metabolinių pokyčių kryptis) dar nėra patikrintas. Čia pateikiame tokią analizę.
Viena iš reikšmingiausių augalams būdingų metabolitų savybių yra jų didelė struktūrinė įvairovė visais lygmenimis – nuo ​​pavienių augalų, populiacijų iki panašių rūšių (20). Populiacijos mastu galima pastebėti daug kiekybinių specializuotų metabolitų pokyčių, o rūšių lygmeniu paprastai išlieka stiprūs kokybiniai skirtumai (20). Todėl augalų metabolinė įvairovė yra pagrindinis funkcinės įvairovės aspektas, atspindintis prisitaikymą prie skirtingų nišų, ypač tų nišų, kuriose yra skirtingos specialių vabzdžių ir įprastų žolėdžių invazijos galimybės (21). Nuo Fraenkelio (22) novatoriško straipsnio apie augalams būdingų metabolitų egzistavimo priežastis sąveika su įvairiais vabzdžiais buvo laikoma svarbiu atrankos spaudimu, ir manoma, kad ši sąveika evoliucijos metu suformavo augalus. Metabolizmo kelias (23). Tarprūšiniai specializuotų metabolitų įvairovės skirtumai taip pat gali atspindėti fiziologinę pusiausvyrą, susijusią su konstitucine ir indukuojama augalų apsauga nuo žolėdžių strategijų, nes šios dvi rūšys dažnai yra neigiamai koreliuojamos viena su kita (24). Nors visada gali būti naudinga palaikyti gerą gynybą, savalaikiai metaboliniai pokyčiai, susiję su gynyba, suteikia aiškios naudos, nes leidžia augalams skirti vertingus išteklius kitoms fiziologinėms investicijoms (19, 24) ir išvengti simbiozės poreikio. Šalutinė žala (25). Be to, šie specializuotų metabolitų reorganizavimai, kuriuos sukelia vabzdžių žolėdžiai, gali sukelti destruktyvų pasiskirstymą populiacijoje (26) ir gali atspindėti tiesioginius esminius natūralius jazmono rūgšties (JA) signalo pokyčius, kurie gali išlikti populiacijoje. Aukšti ir žemi JA signalai yra kompromisai tarp gynybos nuo žolėdžių ir konkurencijos su specifinėmis rūšimis (27). Be to, specializuoti metabolitų biosintezės keliai evoliucijos metu greitai nyksta ir transformuojasi, todėl artimai susijusių rūšių metabolinis pasiskirstymas yra netolygus (28). Šie polimorfizmai gali greitai atsirasti reaguojant į besikeičiančius žolėdžių modelius (29), o tai reiškia, kad žolėdžių bendrijų svyravimas yra pagrindinis veiksnys, lemiantis metabolinį heterogeniškumą.
Čia konkrečiai išsprendėme šias problemas. (I) Kaip žolėdis vabzdys perkonfigūruoja augalo metabolomą? (Ii) Kokie yra pagrindiniai metabolinio plastiškumo informacijos komponentai, kuriuos galima kiekybiškai įvertinti, siekiant patikrinti ilgalaikės gynybos teorijos prognozes? (Iii) Ar perprogramuoti augalo metabolomą taip, kad jis būtų unikalus puolėjui, ir jei taip, kokį vaidmenį augalo hormonas atlieka pritaikant specifinį metabolinį atsaką, ir kurie metabolitai prisideda prie rūšies specifiškumo gynyboje? (Iv) Kadangi daugelio gynybos teorijų prognozės gali būti išplėstos visais biologinių audinių lygmenimis, klausėme, kiek nuoseklus yra sukeltas metabolinis atsakas, lyginant jį su vidiniu ir tarprūšiniu palyginimu? Šiuo tikslu sistemingai tyrėme tabako nikotino lapų metabolomą. Šis ekologinis augalas pasižymi intensyvia specializuota medžiagų apykaita ir yra veiksmingas prieš dviejų vietinių žolėdžių – Lepidoptera Datura (Ms) (labai agresyvių, daugiausia valgomų) – lervas. Solanaceae ir Spodoptera littoralis (Sl) šeimos medvilnės lapkirminai yra savotiška „gentis“, kurios šeimininkai yra Solanaceae ir kiti genčių bei šeimų (Augalų maistas) augalai. Išanalizavome MS/MS metabolomikos spektrą ir išskyrėme informacijos teorijos statistinius deskriptorius, kad palygintume OD ir MT teorijas. Sukūrėme specifiškumo žemėlapius, kad atskleistume pagrindinių metabolitų tapatybę. Analizė buvo išplėsta į vietinę N. nasi populiaciją ir glaudžiai susijusias tabako rūšis, siekiant toliau analizuoti kovariaciją tarp augalų hormonų signalizacijos ir OD indukcijos.
Siekdami susidaryti bendrą žolėdžio tabako lapo metabolomo plastiškumo ir struktūros žemėlapį, panaudojome anksčiau sukurtą analizės ir skaičiavimo darbo eigą, kad išsamiai surinktume ir dekonvoliuotume didelės skiriamosios gebos duomenų nepriklausomus MS/MS spektrus iš augalų ekstraktų (9). Šis nediferencijuotas metodas (vadinamas MS/MS) gali sudaryti neperteklinius junginių spektrus, kurie vėliau gali būti naudojami visoms čia aprašytoms junginių lygio analizėms. Šie dekonvoliuoti augalų metabolitai yra įvairių tipų, sudaryti nuo šimtų iki tūkstančių metabolitų (čia apie 500–1000 s/MS/MS). Čia mes nagrinėjame metabolinį plastiškumą informacijos teorijos rėmuose ir kiekybiškai įvertiname metabolomo įvairovę ir profesionalumą, remdamiesi metabolinio dažnio pasiskirstymo Šenono entropija. Naudodami anksčiau pritaikytą formulę (8), apskaičiavome rodiklių rinkinį, kuris gali būti naudojamas metabolomo įvairovei (Hj rodiklis), metabolinio profilio specializacijai (δj rodiklis) ir vieno metabolito metaboliniam specifiškumui (Si rodiklis) kiekybiškai įvertinti. Be to, taikėme santykinio atstumo plastiškumo indeksą (RDPI), kad kiekybiškai įvertintume žolėdžių metabolomų indukuojamumą (1A pav.) (30). Šioje statistinėje sistemoje MS/MS spektrą laikome pagrindiniu informacijos vienetu ir santykinį MS/MS gausumą apdorojame į dažnių pasiskirstymo žemėlapį, o tada, remdamiesi juo, naudojame Šenono entropiją metabolomų įvairovei įvertinti. Metabolomo specializacija matuojama pagal vidutinį vieno MS/MS spektro specifiškumą. Todėl kai kurių MS/MS klasių gausumo padidėjimas po žolėdžių indukcijos transformuojamas į spektrinį indukuojamumą, RDPI ir specializaciją, t. y. δj indekso padidėjimą, nes susidaro labiau specializuoti metabolitai ir gaunamas didelis Si indeksas. Hj įvairovės indekso sumažėjimas rodo, kad arba sumažėja sugeneruotų MS/MS skaičius, arba profilio dažnių pasiskirstymas keičiasi mažiau vienoda kryptimi, tuo pačiu sumažinant bendrą jo neapibrėžtumą. Apskaičiuojant Si indeksą, galima pabrėžti, kurias MS/MS sukelia tam tikri žolėdžiai, o kurios MS/MS nereaguoja į indukciją, o tai yra pagrindinis rodiklis, leidžiantis atskirti MT ir OD prognozavimą.
(A) Statistiniai deskriptoriai, naudojami žolėdžių (H1–Hx) MS/MS duomenų indukuojamumui (RDPI), įvairovei (Hj indeksas), specializacijai (δj indeksas) ir metabolitų specifiškumui (Si indeksas) apibūdinti. Specializacijos laipsnio (δj) padidėjimas rodo, kad vidutiniškai bus pagaminta daugiau žolėdžių specifinių metabolitų, o įvairovės (Hj) sumažėjimas rodo metabolitų gamybos sumažėjimą arba netolygų metabolitų pasiskirstymą pasiskirstymo žemėlapyje. Si vertė įvertina, ar metabolitas yra specifinis tam tikrai sąlygai (šiuo atveju – žolėdžiams), ar atvirkščiai, išlaikomas tame pačiame lygyje. (B) Gynybos teorijos prognozės koncepcinė diagrama, naudojant informacijos teorijos ašį. OD teorija prognozuoja, kad žolėdžių ataka padidins gynybos metabolitų kiekį, taip padidindama δj. Tuo pačiu metu Hj sumažėja, nes profilis pertvarkomas siekiant sumažinti metabolinės informacijos neapibrėžtumą. MT teorija prognozuoja, kad žolėdžių ataka sukels nekryptinius metabolomo pokyčius, taip padidindama Hj kaip padidėjusio metabolinės informacijos neapibrėžtumo rodiklį ir sukeldama atsitiktinį Si pasiskirstymą. Taip pat pasiūlėme mišrų modelį, geriausią MT, kuriame kai kurių metabolitų, turinčių didesnes gynybines vertes, kiekis bus ypač padidėjęs (didelė Si vertė), o kitų reakcijos bus atsitiktinės (mažesnė Si vertė).
Naudodami informacijos teorijos deskriptorius, interpretuojame OD teoriją, numatydami, kad žolėdžių sukelti specialūs metabolitų pokyčiai neindukuotoje konstitucinėje būsenoje lems (i) metabolinio specifiškumo (Si indekso) padidėjimą, kuris skatins metabonominį specifiškumą (δj indeksą) (tam tikrų specialių metabolitų grupių, turinčių didesnę gynybinę vertę, padidėjimą), ir (ii) metabolomų įvairovės (Hj indekso) sumažėjimą dėl metabolinio dažnio pasiskirstymo pasikeitimo į labiau leptino kūno pasiskirstymą. Vieno metabolito lygmenyje tikimasi sutvarkyto Si pasiskirstymo, kur metabolitas padidins Si vertę pagal savo gynybinę vertę (1B pav.). Tuo pačiu paaiškiname MT teoriją, numatydami, kad sužadinimas lems (i) nekryptinius metabolitų pokyčius, dėl kurių sumažės δj indeksas, ir (ii) Hj indekso padidėjimą dėl metabolinio neapibrėžtumo padidėjimo. Arba atsitiktinumo, kurį galima kiekybiškai įvertinti Shannon entropija apibendrintos įvairovės pavidalu. Kalbant apie metabolinę sudėtį, MT teorija prognozuos atsitiktinį Si pasiskirstymą. Atsižvelgiant į tai, kad tam tikri metabolitai yra specifinėmis sąlygomis, o kiti – ne, ir jų gynybinė vertė priklauso nuo aplinkos, mes taip pat pasiūlėme mišrų gynybos modelį, kuriame δj ir Hj pasiskirsto per pusę išilgai Si padidėjimo visomis kryptimis, tik tam tikros metabolitų grupės, turinčios didesnes gynybines vertes, ypač padidins Si, o kitos turės atsitiktinį pasiskirstymą (1B pav.).
Norėdami patikrinti naujai apibrėžtos gynybos teorijos prognozę informacijos teorijos deskriptoriaus ašyje, ant Nepenthes pallens lapų išauginome ekspertines (Ms) arba generalistines (Sl) žolėdžių lervas (2A pav.). Naudodami MS/MS analizę, gavome 599 neperteklinius MS/MS spektrus (duomenų failas S1) iš metanolio ekstraktų, gautų iš lapų audinių, surinktų po vikšrų maitinimosi. Naudojant RDPI, Hj ir δj indeksus informacijos turinio pertvarkai MS/MS konfigūracijos failuose vizualizuoti, atskleidžiami įdomūs modeliai (2B pav.). Bendra tendencija yra tokia, kad, kaip aprašyta informacijos deskriptoriuje, vikšrams toliau ėdant lapus, visų medžiagų apykaitos reorganizacijos laipsnis laikui bėgant didėja: praėjus 72 valandoms po žolėdžio ėdimo, RDPI reikšmingai padidėja. Palyginti su nepažeista kontroline grupe, Hj reikšmingai sumažėjo, o tai lėmė padidėjęs medžiagų apykaitos profilio specializacijos laipsnis, kuris buvo kiekybiškai įvertintas δj indeksu. Ši akivaizdi tendencija atitinka OD teorijos prognozes, tačiau neatitinka pagrindinių MT teorijos prognozių, pagal kurias atsitiktiniai (nekryptiniai) metabolitų lygių pokyčiai naudojami kaip gynybinė maskuotė (1B pav.). Nors šių dviejų žolėdžių burnos sekrecijos (OS) elicitoriaus kiekis ir maitinimosi elgsena skiriasi, jų tiesioginis maitinimasis lėmė panašius Hj ir δj krypčių pokyčius 24 ir 72 valandų derliaus nuėmimo laikotarpiu. Vienintelis skirtumas atsirado po 72 RDPI valandų. Palyginti su tuo, kurį sukėlė maitinimasis Ms, bendras Sl maitinimo sukeltas metabolizmas buvo didesnis.
(A) Eksperimento planas: paprastosios kiaulės (S1) arba ekspertai (Ms) žolėdžiai šeriami gėlintais ąsočiųjų augalų lapais, o imituojant žolėdžių mitybą, standartizuotų lapų pradūrimui naudojamas Ms (W + OSM) OS. S1 (W + OSSl) lervos arba vanduo (W + W). Kontrolinė grupė (C) yra nepažeistas lapas. (B) Indukuojamumo (RDPI, palyginti su kontroline diagrama), įvairovės (Hj indeksas) ir specializacijos (δj indeksas) indeksas, apskaičiuotas specialiam metabolitų žemėlapiui (599 MS/MS; duomenų failas S1). Žvaigždutės rodo reikšmingus skirtumus tarp tiesioginio žolėdžių maitinimo ir kontrolinės grupės (Studento t-testas su poriniu t-testu, *P < 0,05 ir ***P < 0,001). ns, nesvarbu. (C) Pagrindinio (mėlynas langelis, aminorūgštis, organinė rūgštis ir cukrus; duomenų failas S2) ir specialiojo metabolito spektro (raudonas langelis 443 MS/MS; duomenų failas S1) laiko skiriamosios gebos indeksas po imituoto žolėdžių apdorojimo. Spalvota juosta nurodo 95 % pasikliautinį intervalą. Žvaigždutė žymi reikšmingą skirtumą tarp apdorojimo ir kontrolės [kvadratinė dispersijos analizė (ANOVA), po kurios seka Tukey sąžiningai reikšmingas skirtumas (HSD) post hoc daugybiniams palyginimams, *P < 0,05, **P < 0,01 ir *** P < 0,001]. (D) Sklaidos diagramų ir specialiųjų metabolitų profilių specializacija (pakartotiniai mėginiai su skirtingais apdorojimo būdais).
Norėdami ištirti, ar žolėdžių sukeltas metabolomo lygmens pertvarkymas atsispindi atskirų metabolitų lygio pokyčiuose, pirmiausia sutelkėme dėmesį į metabolitus, anksčiau tirtus Nepenthes pallens lapuose, kuriems įrodytas atsparumas žolėdžiams. Fenolio amidai yra hidroksicinamamidų-poliamino junginiai, kurie kaupiasi vabzdžių žolėdžių augimo procese ir, kaip žinoma, mažina vabzdžių aktyvumą (32). Ieškojome atitinkamų MS/MS pirmtakų ir nubraižėme jų kaupiamąsias kinetines kreives (S1 pav.). Nenuostabu, kad fenolių dariniai, kurie tiesiogiai nedalyvauja gynyboje nuo žolėdžių, pavyzdžiui, chlorogeno rūgštis (CGA) ir rutinas, po žolėdžių augimo sumažėja. Priešingai, žolėdžiai gali labai sustiprinti fenolių amidus. Nuolatinis dviejų žolėdžių maitinimasis lėmė beveik tokį patį fenolamidų sužadinimo spektrą, ir šis modelis buvo ypač akivaizdus fenolamidų de novo sintezės metu. Tas pats reiškinys bus stebimas ir tyrinėjant 17-hidroksigeranilnonanediolio diterpenų glikozidų (17-HGL-DTG) gamybinį kelią, kuris gamina daug aciklinių diterpenų, pasižyminčių veiksmingomis antiherbivojinėmis funkcijomis (33), iš kurių Ms maitinimasis Sl sukėlė panašų raiškos profilį (S1 pav.)).
Galimas tiesioginių žolėdžių maitinimosi eksperimentų trūkumas yra skirtingas žolėdžių lapų suvartojimo greitis ir maitinimosi laikas, dėl kurio sunku pašalinti žolėdžiams būdingą žaizdų ir žolėdžių poveikį. Siekdami geriau išspręsti žolėdžių rūšies specifiškumą indukuoto lapų metabolinio atsako atveju, imitavome Ms ir Sl lervų maitinimąsi, nedelsdami pritaikydami šviežiai surinktą OS (OSM ir OSS1) standartinei nuoseklių lapų pozicijų punkcijos W vertei. Ši procedūra vadinama W + OS apdorojimu ir standartizuoja indukciją tiksliai nustatydama žolėdžio sukelto atsako pradžią, nesukeldama painiavos dėl audinių netekimo greičio ar kiekio skirtumų poveikio (2A pav.) (34). Naudodami MS/MS analizės ir skaičiavimo srautą, gavome 443 MS/MS spektrus (duomenų failas S1), kurie sutapo su spektrais, anksčiau surinktais iš tiesioginio maitinimo eksperimentų. Šio MS/MS duomenų rinkinio informacijos teorijos analizė parodė, kad lapams specializuotų metabolomų perprogramavimas imituojant žolėdžius parodė OS specifines indukcijas (2C pav.). Visų pirma, palyginti su OSS1 gydymu, OSM sukėlė metabolomo specializacijos padidėjimą po 4 valandų. Verta paminėti, kad, palyginti su tiesioginio žolėdžių maitinimo eksperimentiniais duomenimis, metabolinė kinetika, vizualizuota dvimatėje erdvėje naudojant Hj ir δj kaip koordinates, ir metabolomo specializacijos kryptingumas, reaguojant į imituotą žolėdžių gydymą laikui bėgant, padidėjo nuosekliai (2D pav.). Tuo pačiu metu kiekybiškai įvertinome aminorūgščių, organinių rūgščių ir cukrų kiekį (duomenų failas S2), kad ištirtume, ar šis tikslinis metabolomo patirties padidėjimas yra susijęs su centrinės anglies metabolizmo pertvarka, reaguojant į imituotus žolėdžius (S2 pav.). Siekdami geriau paaiškinti šį modelį, toliau stebėjome anksčiau aptartų fenolamido ir 17-HGL-DTG kelių metabolinės kaupimosi kinetiką. Žolėdžių OS specifinė indukcija transformuojama į diferencinį fenolamido metabolizmo pertvarkymo modelį (S3 pav.). Fenolio amidus, kuriuose yra kumarino ir kofeilo fragmentų, pirmiausia indukuoja OSS1, o OSM sukelia specifinę ferulilo konjugatų indukciją. 17-HGL-DTG signalo perdavimo kelyje buvo aptikta skirtinga OS indukcija, kurią sukelia pasroviui esantys maloninimo ir dimaloninimo produktai (S3 pav.).
Toliau tyrėme OS sukeltą transkriptomo plastiškumą, naudodami laiko eigos mikrogardelių duomenų rinkinį, kuris imituoja OSM naudojimą žolėdžių rozetinių augalų lapams apdoroti. Mėginių ėmimo kinetika iš esmės sutampa su šiame metabolomikos tyrime naudota kinetika (35). Palyginti su metabolomo rekonfigūracija, kurioje metabolinis plastiškumas laikui bėgant ypač padidėja, lapuose stebime trumpalaikius transkripcijos pliūpsnius, kuriuos sukelia Ms, kur transkriptomo indukuotumas (RDPI) ir specializacija (δj) yra lygūs 1. Šiuo laiko momentu reikšmingai padidėjo valandų skaičius ir įvairovė (Hj), BMP1 raiška reikšmingai sumažėjo, o po to transkriptomo specializacija atsipalaidavo (S4 pav.). Metabolinės genų šeimos (tokios kaip P450, glikoziltransferazė ir BAHD aciltransferazė) dalyvauja specialių metabolitų surinkimo iš struktūrinių vienetų, gautų iš pirminio metabolizmo, procese, remiantis minėtu ankstyvuoju didelės specializacijos modeliu. Kaip atvejo tyrimas buvo analizuojamas fenilalanino kelias. Analizė patvirtino, kad pagrindiniai fenolamidų metabolizmo genai žolėdžiuose yra labai indukuojami OS, palyginti su nepritrauktais augalais, ir jų raiškos modeliai yra glaudžiai susiję. Transkripcijos faktorius MYB8 ir struktūriniai genai PAL1, PAL2, C4H ir 4CL šio kelio priešakyje parodė ankstyvą transkripcijos inicijavimą. Aciltransferazės, kurios atlieka svarbų vaidmenį galutiniame fenolamido surinkime, tokios kaip AT1, DH29 ir CV86, pasižymi ilgalaikiu reguliacijos padidėjimu (S4 pav.). Šie stebėjimai rodo, kad ankstyva transkriptomo specializacijos inicijavimas ir vėlesnis metabolomikos specializacijos sustiprėjimas yra susieti režimai, kurie gali būti dėl sinchroninės reguliavimo sistemos, kuri inicijuoja galingą gynybinį atsaką.
Augalų hormonų signalizacijos rekonfigūracija veikia kaip reguliavimo sluoksnis, integruojantis žolėdžių informaciją, kad būtų perprogramuota augalų fiziologija. Po žolėdžių modeliavimo išmatavome pagrindinių augalų hormonų kategorijų kaupiamąją dinamiką ir vizualizavome jų tarpusavio raišką laike [Pirsono koreliacijos koeficientas (PCC) > 0,4] (3A pav.). Kaip ir tikėtasi, su biosinteze susiję augalų hormonai yra susieti augalų hormonų saviraiškos tinkle. Be to, metabolinis specifiškumas (Si indeksas) susiejamas su šiuo tinklu, siekiant pabrėžti skirtingų apdorojimo būdų sukeltus augalų hormonus. Išskiriamos dvi pagrindinės žolėdžių specifinio atsako sritys: viena yra JA klasteryje, kur JA (jo biologiškai aktyvi forma JA-Ile) ir kiti JA dariniai rodo didžiausią Si balą; kita yra etilenas (ET). Giberelinas parodė tik vidutinį žolėdžių specifiškumo padidėjimą, o kiti augalų hormonai, tokie kaip citokininas, auksinas ir abscizinė rūgštis, turėjo mažą indukcijos specifiškumą žolėdžiams. Lyginant su vien tik W + W naudojimu, JA darinių didžiausios vertės amplifikacija taikant OS (W + OS) iš esmės gali būti transformuota į stiprų specifinį JA indikatorių. Netikėtai žinoma, kad OSM ir OSS1 su skirtingu elicitoriaus kiekiu sukelia panašų JA ir JA-Ile kaupimąsi. Priešingai nei OSS1, OSM yra specifiškai ir stipriai indukuojamas OSM, o OSS1 nestiprina bazinių žaizdų atsako (3B pav.).
(A) Koekspresijos tinklo analizė, pagrįsta PCC skaičiavimu, žolėdžių sukeltos augalų hormonų kaupimosi kinetikos modeliavimui. Mazgas žymi vieną augalo hormoną, o mazgo dydis – augalo hormonui būdingą Si indeksą tarp apdorojimų. (B) JA, JA-Ile ir ET kaupimasis lapuose, kurį sukėlė skirtingi apdorojimai, pažymėtas skirtingomis spalvomis: abrikosinė, W + OSM; mėlyna, W + OSSl; juoda, W + W; pilka, C (kontrolė). Žvaigždutės rodo reikšmingus skirtumus tarp apdorojimo ir kontrolės (dvipusė ANOVA, po kurios atliktas Tukey HSD post hoc daugybinis palyginimas, *** P <0,001). (C)697 MS/MS (duomenų failas S1) informacijos teorijos analizė JA biosintezėje ir sutrikusiame suvokimo spektre (irAOC ir irCOI1) ir (D)585 MS/MS (duomenų failas S1) ETR1 su sutrikusiu ET signalu. Du imituoti žolėdžių apdorojimai suaktyvino augalų linijas ir tuščio nešiklio (EV) kontrolinius augalus. Žvaigždutės rodo reikšmingus skirtumus tarp W+OS apdorojimo ir nepažeistos kontrolės (dvipusė ANOVA, po kurios atliktas Tukey HSD post hoc daugybinis palyginimas, *P<0,05, **P<0,01 ir ***P<0,001). (E) Išsklaidyti grafikai, rodantys išsklaidytą pasipriešinimą specializacijai. Spalvos žymi skirtingas genetiškai modifikuotas padermes; simboliai žymi skirtingus apdorojimo metodus: trikampis – W + OSS1; stačiakampis – W + OSM; apskritimas C
Toliau, pagrindiniuose JA ir ET biosintezės (irAOC ir irACO) ir suvokimo (irCOI1 ir sETR1) etapuose, naudojame genetiškai modifikuotą susilpnintų Nepenthes padermę (irCOI1 ir sETR1), kad išanalizuotume šių dviejų augalų hormonų metabolizmą žolėdžių organizme. Santykinis perprogramavimo indėlis. Remdamiesi ankstesniais eksperimentais, patvirtinome žolėdžių OS indukciją tuščiuose nešikliuose (EV) augaluose (3 pav., C–D) ir bendrą Hj indekso sumažėjimą, kurį sukėlė OSM, tuo tarpu δj indeksas padidėjo. Atsakas yra ryškesnis nei atsakas, kurį sukėlė OSS1. Dviejų linijų grafikas, kuriame Hj ir δj yra koordinatės, rodo specifinį dereguliavimą (3E pav.). Akivaizdžiausia tendencija yra ta, kad padermėse, neturinčiose JA signalo, žolėdžių sukelti metabolomų įvairovės ir specializacijos pokyčiai beveik visiškai eliminuojami (3C pav.). Priešingai, tylus ET suvokimas sETR1 augaluose, nors bendras poveikis žolėdžių metabolizmo pokyčiams yra daug mažesnis nei JA signalizacijos, sumažina Hj ir δj indeksų skirtumą tarp OSM ir OSS1 sužadinimų (3D pav. ir S5 pav.). Tai rodo, kad be pagrindinės JA signalo perdavimo funkcijos, ET signalo perdavimas taip pat atlieka žolėdžių rūšiai būdingo metabolinio atsako tikslinimo funkciją. Atsižvelgiant į šią tikslinimo funkciją, bendras metabolomo indukuojamumas sETR1 augaluose nepakito. Kita vertus, palyginti su sETR1 augalais, irACO augalai sukėlė panašią bendrą žolėdžių sukeltų metabolinių pokyčių amplitudę, tačiau parodė reikšmingus Hj ir δj balų skirtumus tarp OSM ir OSS1 sužadinimų (S5 pav.).
Siekdami nustatyti specializuotus metabolitus, kurie atlieka svarbų vaidmenį žolėdžių rūšiai būdingame atsake, ir tiksliai sureguliuoti jų gamybą naudojant ET signalus, panaudojome anksčiau sukurtą struktūrinį MS/MS metodą. Šis metodas remiasi dviejų klasterių sudarymo metodu, siekiant iš naujo nustatyti metabolinę šeimą iš MS/MS fragmentų [normalizuota skaliarinė sandauga (NDP)] ir panašumo balo, pagrįsto neutralumo praradimu (NL). MS/MS duomenų rinkinys, sudarytas analizuojant ET transgenines linijas, davė 585 MS/MS (duomenų failas S1), kurie buvo išskaidyti sugrupuojant juos į septynis pagrindinius MS/MS modulius (M) (4A pav.). Kai kurie iš šių modulių yra tankiai supakuoti anksčiau apibūdintais specialiais metabolitais: pavyzdžiui, M1, M2, M3, M4 ir M7 yra gausūs įvairių fenolių darinių (M1), flavonoidų glikozidų (M2), acilinių cukrų (M3 ir M4) ir 17-HGL-DTG (M7). Be to, kiekviename modulyje apskaičiuojama atskiro metabolito metabolinė specifinė informacija (Si indeksas), o jo Si pasiskirstymą galima intuityviai matyti. Trumpai tariant, MS/MS spektrams, pasižymintiems dideliu žolėdžių ir genotipo specifiškumu, būdingos didelės Si vertės, o eksceso statistika rodo kailio pasiskirstymą dešiniajame uodegos kampe. Vienas toks lieso koloido pasiskirstymas buvo aptiktas M1 modulyje, kuriame fenolio amidas parodė didžiausią Si dalį (4B pav.). Anksčiau minėtas žolėdžių indukuojamas 17-HGL-DTG M7 modulyje parodė vidutinį Si balą, rodantį vidutinį skirtingo reguliavimo laipsnį tarp dviejų OS tipų. Priešingai, dauguma konstituciškai gaminamų specializuotų metabolitų, tokių kaip rutinas, CGA ir acilcukrūs, yra tarp mažiausių Si balų. Siekiant geriau ištirti struktūrinį sudėtingumą ir Si pasiskirstymą tarp specialiųjų metabolitų, kiekvienam moduliui buvo sukurtas molekulinis tinklas (4B pav.). Svarbi OD teorijos prognozė (apibendrinta 1B paveiksle) yra ta, kad specialiųjų metabolitų reorganizacija po žolėdžių turėtų lemti vienpusius didelės gynybinės vertės metabolitų pokyčius, ypač padidinant jų specifiškumą (priešingai nei atsitiktinis pasiskirstymas) (režimas). Gynybinis metabolitas, numatytas MT teorijos. Dauguma M1 sukauptų fenolių darinių yra funkciškai susiję su vabzdžių našumo sumažėjimu (32). Lyginant Si vertes M1 metabolituose tarp indukuotų lapų ir EV kontrolinių augalų sudedamųjų lapų po 24 valandų, pastebėjome, kad daugelio metabolitų po žolėdžių vabzdžių metabolinis specifiškumas turi reikšmingą didėjimo tendenciją (4C paveikslas). Specifinis Si vertės padidėjimas buvo aptiktas tik gynybiniuose fenolamiduose, tačiau kitų fenolių ir nežinomų metabolitų, egzistuojančių šiame modulyje, Si vertės padidėjimo neaptikta. Tai specializuotas modelis, susijęs su OD teorija. Pagrindinės žolėdžių sukeltų metabolinių pokyčių prognozės yra nuoseklios. Norėdami patikrinti, ar šį fenolamidų spektro ypatumą sukėlė OS-specifinis ET, nubraižėme metabolito Si indeksą ir nustatėme skirtingą OSM ir OSS1 raiškos vertę EV ir sETR1 genotipuose (4D pav.). sETR1 genotipuose fenamido sukeltas skirtumas tarp OSM ir OSS1 buvo labai sumažintas. Dviejų klasterių metodas taip pat buvo taikomas MS/MS duomenims, surinktiems iš padermių, kuriose nepakako JA, kad būtų galima nustatyti pagrindinius MS/MS modulius, susijusius su JA reguliuojama metaboline specializacija (S6 pav.).
(A) 585 MS/MS klasterizavimo rezultatai, pagrįsti bendru fragmentu (NDP panašumu) ir bendru neutralumo praradimu (NL panašumu), rodo, kad modulis (M) atitinka žinomą junginių šeimą arba nežinomą ar blogai metabolizuojamą metabolitų sudėtį. Šalia kiekvieno modulio parodytas metabolito (MS/MS) specifinis (Si) pasiskirstymas. (B) Modulinis molekulinis tinklas: mazgai žymi MS/MS ir briaunas, NDP (raudona) ir NL (mėlyna) MS/MS balus (ribinė vertė > 0,6). Laipsniškas metabolito specifiškumo indeksas (Si), nuspalvintas pagal modulį (kairėje) ir susietas su molekuliniu tinklu (dešinėje). (C) EV augalo M1 modulis konstitucinėje (kontrolinėje) ir indukuotoje būsenoje (imituojamas žolėdis) po 24 valandų: molekulinio tinklo diagrama (Si vertė yra mazgo dydis, gynybinis fenolamidas paryškintas mėlyna spalva). (D) Spektro linijos sETR1 su sutrikusiu EV ir ET suvokimu M1 molekulinio tinklo diagrama: žaliu apskritimu pažymėtas mazgas vaizduoja fenolio junginį ir reikšmingą skirtumą (P reikšmę) tarp W + OSM ir W + OSS1 apdorojimo, atsižvelgiant į mazgo dydį. CP, N-kofeil-tirozinas; CS, N-kofeil-spermidinas; FP, N-ferulo rūgšties esterio-šlapimo rūgšties; FS, N-ferulil-spermidinas; CoP, N', N“-kumarolil-tirozinas; DCS, N', N”-dikafeil-spermidinas; CFS, N', N”-kofeil, feruloil-spermidinas; Lycium barbarum (Lycium barbarum) vaisiaus Son uogoje; Nick. O-AS, O-acilcukrus.
Analizę išplėtėme nuo vieno susilpninto Nepenthes genotipo iki natūralių populiacijų, kur anksčiau buvo aprašyti stiprūs vidurūšiniai žolėdžių JA lygių ir specifinių metabolitų lygių pokyčiai natūraliose populiacijose (26). Šį duomenų rinkinį panaudojome 43 gemalinėms plazmoms aprėpti. Šios gemalinės plazmos susideda iš 123 N. pallens augalų rūšių. Šie augalai buvo paimti iš sėklų, surinktų skirtingose ​​vietinėse buveinėse Jutoje, Nevadoje, Arizonoje ir Kalifornijoje (S7 pav.), apskaičiavome metabolomo įvairovę (čia vadinamą populiacijos lygiu (β įvairove)) ir specializaciją, kurią sukelia OSM. Remdamiesi ankstesniais tyrimais, stebėjome platų metabolinių pokyčių spektrą Hj ir δj ašyse, o tai rodo, kad gemalinės plazmos turi reikšmingų skirtumų savo metabolinių reakcijų į žolėdžius plastiškume (S7 pav.). Ši organizacija primena ankstesnius stebėjimus apie žolėdžių sukeltų JA pokyčių dinaminį diapazoną ir išlaikė labai didelę vertę vienoje populiacijoje (26, 36). Naudodami JA ir JA-Ile bendro lygio koreliacijai tarp Hj ir δj patikrinti, nustatėme reikšmingą teigiamą koreliaciją tarp JA ir metabolomo β įvairovės bei specializacijos indekso (S7 pav.). Tai rodo, kad žolėdžių sukeltas JA indukcijos heterogeniškumas, aptiktas populiacijos lygmeniu, gali būti susijęs su pagrindiniais metaboliniais polimorfizmais, kuriuos sukelia atranka iš vabzdžių žolėdžių.
Ankstesni tyrimai parodė, kad tabako rūšys labai skiriasi savo rūšimi ir santykine priklausomybe nuo indukuotų ir konstitucinių metabolinių gynybos mechanizmų. Manoma, kad šiuos antižolininkų signalo perdavimo ir gynybos pajėgumų pokyčius reguliuoja vabzdžių populiacijos slėgis, augalo gyvavimo ciklas ir gynybos gamybos sąnaudos nišoje, kurioje auga tam tikra rūšis. Mes tyrėme šešių Nicotiana rūšių, kilusių iš Šiaurės Amerikos ir Pietų Amerikos, žolėdžių sukelto lapų metabolomo pertvarkymo nuoseklumą. Šios rūšys yra glaudžiai susijusios su Nepenthes North America, būtent Nicolas Bociflo. La, N. nicotinis, Nicotiana n. attenuated grass, Nicotiana tabacum, linijinis tabakas, tabakas (Nicotiana spegazzinii) ir tabako lapų tabakas (Nicotiana obtusifolia) (5A pav.) (37). Šešios iš šių rūšių, įskaitant gerai apibūdintą rūšį N. please, yra vienmečiai petunijų klado augalai, o obtusifolia N. yra daugiamečiai seserinės Trigonophyllae klado augalai (38). Vėliau šioms septynioms rūšims buvo atlikta W + W, W + OSM ir W + OSS1 indukcija, siekiant ištirti vabzdžių maitinimosi metabolinį pertvarkymą rūšių lygmeniu.
(A) „Bootstrap“ filogenetinis medis, pagrįstas didžiausia tikimybe [branduolinio glutamino sintezei (38)] ir septynių glaudžiai susijusių Nicotiana rūšių geografiniu pasiskirstymu (skirtingos spalvos) (37). (B) Septynių Nicotiana rūšių metabolinių profilių specializuotos įvairovės sklaidos diagrama (939 MS/MS; duomenų failas S1). Rūšių lygmeniu metabolomo įvairovė neigiamai koreliuoja su specializacijos laipsniu. Rūšių lygmens koreliacijos tarp metabolinės įvairovės ir specializacijos bei JA kaupimo analizė parodyta 2 paveiksle. S9. Spalva, skirtingi tipai; trikampis, W + OSS1; stačiakampis, W + OSM; (C) Nicotiana JA ir JA-Ile dinamika surūšiuota pagal OS sužadinimo amplitudę (dvipusė ANOVA ir Tukey HSD po daugkartinio palyginimo, * P <0,05, ** P <0,01 ir * ** W + OS ir W + W palyginimui, P <0,001). Kiekvienos rūšies (D) įvairovės ir (E) specializacijos langelių diagrama, imitavus žolėdžius ir metilinius JA (MeJA). Žvaigždute pažymėtas reikšmingas skirtumas tarp W + OS ir W + W arba lanolino plius W (Lan + W) arba Lan plius MeJA (Lan + MeJa) ir Lan kontrolės (dvifaktorinė dispersinė analizė, po kurios atlikta Tukey HSD post hoc daugybinė palyginimas, *P < 0,05, **P < 0,01 ir ***P < 0,001).
Naudodami dvigubo klasterio metodą, nustatėme 9 modulius iš 939 MS/MS (duomenų failas S1). Skirtingų apdorojimo būdų perkonfigūruota MS/MS sudėtis labai skiriasi tarp skirtingų modulių tarp rūšių (S8 pav.). Vizualizuojant Hj (čia vadinamą rūšies lygmens γ įvairove) ir δj matyti, kad skirtingos rūšys metabolinėje erdvėje agreguojasi į labai skirtingas grupes, kur rūšių lygmens pasiskirstymas paprastai yra ryškesnis nei sužadinimas. Išskyrus N. linear ir N. obliquus, jos pasižymi plačiu indukcinių efektų dinaminiu diapazonu (5B pav.). Priešingai, tokios rūšys kaip N. purpurea ir N. obtusifolia turi mažiau akivaizdų metabolinį atsaką į gydymą, tačiau metabolomas yra įvairesnis. Rūšims būdingas indukuoto metabolinio atsako pasiskirstymas lėmė reikšmingą neigiamą koreliaciją tarp specializacijos ir gama įvairovės (PCC = -0,46, P = 4,9×10-8). OS sukelti JA lygių pokyčiai teigiamai koreliuoja su metabolomo specializacija ir neigiamai koreliuoja su kiekvienos rūšies metaboline gama įvairove (5B pav. ir S9 pav.). Verta paminėti, kad 5C paveiksle šnekamojoje kalboje vadinamos „signalo atsako“ rūšimis, tokios kaip Nepenthes nematodes, Nepenthes nepenthes, Nepenthes acute ir Nepenthes attenuated, sukėlė reikšmingų požymių po 30 minučių. Naujausi OS specifiniai JA ir JA-Ile protrūkiai, o kitos bakterijos, vadinamos „signalo nereaguojančiomis“, tokios kaip Nepenthes mills, Nepenthes powdery ir N. obtusifolia, rodo tik JA-Ile Edge indukciją be jokio OS specifiškumo (5C pav.). Metabolizmo lygmeniu, kaip minėta pirmiau, susilpnintų Nepenthes atveju signalui reaguojančios medžiagos parodė OS specifiškumą ir reikšmingai padidino δj, tuo pačiu sumažindamos Hj. Šis OS specifinis pradinio poveikio efektas nebuvo aptiktas rūšyse, kurios priskiriamos prie signalui nereaguojančių rūšių (5 pav., D ir E). OS specifiniai metabolitai dažniau dalijasi tarp signalui reaguojančių rūšių, ir šie signalo klasteriai klasterizuojasi su rūšimis, kurių signalo atsakas yra silpnesnis, o rūšys, kurių signalo atsakas yra silpnesnis, rodo mažesnę tarpusavio priklausomybę (S8 pav.). Šis rezultatas rodo, kad OS specifinė JA indukcija ir OS specifinė pasroviui esančio metabolomo konfigūracija yra susietos rūšies lygmeniu.
Toliau, norėdami ištirti, ar šiuos jungimosi būdus riboja JA prieinamumas, kurį sukelia egzogeninis JA, esantis augalų citoplazmoje, panaudojome lanolino pastą, kurios sudėtyje yra metilo JA (MeJA). Greita deesterifikacija yra JA. Pastebėjome tą pačią tendenciją, kad dėl nuolatinio JA tiekimo laipsniškai keičiasi nuo signalui reaguojančių rūšių iki signalui nereaguojančių rūšių (5 pav., D ir E). Trumpai tariant, MeJA gydymas stipriai perprogramavo linijinių nematodų, N. obliquus, N. aquaticus, N. pallens ir N. mikimotoi, metabolomus, todėl reikšmingai padidėjo δj ir sumažėjo Hj. N. purpurea parodė tik δj padidėjimą, bet ne Hj. N. obtusifolia, kuri, kaip anksčiau buvo įrodyta, kaupia itin mažą JA kiekį, taip pat silpnai reaguoja į MeJA gydymą metabolomų pertvarkymo požiūriu. Šie rezultatai rodo, kad JA gamyba arba signalo perdavimas yra fiziologiškai ribotas signalui nereaguojančiose rūšyse. Norėdami patikrinti šią hipotezę, ištyrėme keturias rūšis (N. pallens, N. mills, N. pink ir N. microphylla), kurias sukėlė W + W, W + OSM ir W + OSS1 transkriptomas (39). Atsižvelgiant į metabolomo pertvarkymo modelį, rūšys yra gerai atskirtos transkriptomo erdvėje, tarp kurių N. attenuated parodė didžiausią OS sukeltą RDPI, o N. gracilis – mažiausią (6A pav.). Tačiau nustatyta, kad N. oblonga sukelta transkriptomo įvairovė buvo mažiausia tarp keturių rūšių, priešingai nei didžiausia N. oblonga metabonomine įvairovė, anksčiau nustatyta septyniose rūšyse. Ankstesni tyrimai parodė, kad su ankstyvaisiais gynybos signalais, įskaitant JA signalus, susijusių genų rinkinys paaiškina ankstyvųjų gynybos atsakų, kuriuos sukelia žolėdžiais susiję elicitoriai, specifiškumą Nicotiana rūšyse (39). Palyginus JA signalizacijos kelius tarp šių keturių rūšių, paaiškėjo įdomus modelis (6B pav.). Dauguma šio kelio genų, tokių kaip AOC, OPR3, ACX ir COI1, šiose keturiose rūšyse parodė santykinai aukštą indukcijos lygį. Tačiau pagrindinis genas JAR4 paverčia JA į biologiškai aktyvią JA-Ile sukauptų transkriptų formą, ir jo transkripcijos lygis yra labai žemas, ypač N. mills, Nepenthes pieris ir N. microphylla rūšyse. Be to, N. bifidum neaptiktas tik kito geno AOS transkriptas. Šie genų raiškos pokyčiai gali lemti ekstremalius fenotipus, kuriuos sukelia maža JA gamyba signalo anerginėse rūšyse ir N. gracilis indukcija.
(A) Informacijos teorijos analizė, skirta keturių glaudžiai susijusių tabako rūšių, paimtų praėjus 30 minučių po žolėdžių augimo indukcijos, ankstyvųjų transkripcijos atsakų perprogramavimui. RDPI apskaičiuojamas lyginant žolėdžių OS sukeltus lapus su žaizdų kontrole. Spalvos žymi skirtingas rūšis, o simboliai – skirtingus apdorojimo metodus. (B) Genų raiškos JA signalizacijos keliuose analizė tarp keturių rūšių. Supaprastintas JA kelias parodytas šalia langelių diagramos. Skirtingos spalvos žymi skirtingus apdorojimo metodus. Žvaigždutė rodo, kad yra reikšmingas skirtumas tarp W + OS apdorojimo ir W + W kontrolės (Studento t-teste poriniams skirtumams, *P < 0,05, **P < 0,01 ir ***P < 0,001). OPDA, 12-oksofitodieno rūgštis; OPC-8: 0,3-okso-2(2′(Z)-pentenil)-ciklopentano-1-oktano rūgštis.
Paskutinėje dalyje nagrinėjome, kaip vabzdžių rūšims būdingas skirtingų augalų rūšių metabolomo pertvarkymas gali būti atsparus žolėdžiams. Ankstesni tyrimai pabrėžė Nicotiana gentį. Jų atsparumas Ms ir lervoms labai skiriasi (40). Čia nagrinėjome šio modelio ir jų metabolinio plastiškumo ryšį. Naudodami minėtas keturias tabako rūšis ir tikrindami koreliaciją tarp žolėdžių sukeltos metabolomo įvairovės ir specializacijos bei augalų atsparumo Ms ir Sl, nustatėme, kad atsparumas, įvairovė ir specializacija generalistiniam Sl All yra teigiamai koreliuojami, o koreliacija tarp atsparumo ekspertų moterims ir specializacijos yra silpna, o koreliacija su įvairove nėra reikšminga (S10 pav.). Kalbant apie atsparumą S1, tiek susilpnintos N. chinensis, tiek N. gracilis, kurios anksčiau buvo įrodyta, kad pasižymi ir JA signalo perdavimo lygiais, ir metabolomo plastiškumu, labai skirtingai reagavo į žolėdžių indukciją ir taip pat parodė panašų didelį atsparumą. Lytis.
Per pastaruosius šešiasdešimt metų augalų apsaugos teorija suteikė teorinį pagrindą, kuriuo remdamiesi tyrėjai numatė daugybę specializuotų augalų metabolitų evoliucijos ir funkcijų. Dauguma šių teorijų nesilaiko įprastos stiprių išvadų procedūros (41). Jos siūlo pagrindines prognozes (3) tame pačiame analizės lygmenyje. Kai pagrindinių prognozių patikrinimas leidžia analizuoti konkrečias teorijas, tai leis Ši sritis juda į priekį. Būti palaikoma, bet atmesti kitas (42). Vietoj to, naujoji teorija teikia prognozes skirtingais analizės lygmenimis ir prideda naują aprašomųjų svarstymų sluoksnį (42). Tačiau dvi funkciniu lygmeniu pasiūlytas teorijas – MT ir OD – galima lengvai paaiškinti kaip svarbias specializuotų metabolinių pokyčių, kuriuos sukelia žolėdžiai, prognozes: OD teorija mano, kad pokyčiai specializuotoje metabolinėje „erdvėje“ yra labai kryptingi. MT teorija mano, kad šie pokyčiai bus nekryptiniai ir atsitiktinai išsidėstę metabolinėje erdvėje, ir linkę turėti didelės gynybinės vertės metabolitus. Ankstesni OD ir MT prognozių tyrimai buvo patikrinti naudojant siaurą a priori „gynybos“ junginių rinkinį. Šie metabolitų pagrindu atliekami testai neleidžia analizuoti metabolomo rekonfiguracijos masto ir trajektorijos žolėdžių gyvenimo metu ir neleidžia atlikti bandymų nuoseklioje statistinėje sistemoje, reikalaujant pagrindinių prognozių, kurias galima laikyti visuma. Kiekybiškai įvertinti augalo metabolomo pokyčius. Čia panaudojome novatorišką metabolomikos technologiją, pagrįstą skaičiavimo MS, ir atlikome dekonvoliucijos MS analizę bendrąja informacijos teorijos aprašų valiuta, kad patikrintume skirtumą tarp dviejų siūlomų teorijų pasauliniu metabolomikos lygmeniu. Pagrindinė šios teorijos prognozė. Informacijos teorija buvo taikoma daugelyje sričių, ypač biologinės įvairovės ir maistinių medžiagų srautų tyrimų kontekste (43). Tačiau, kiek mums žinoma, tai yra pirmasis taikymas, naudojamas aprašyti augalų metabolinę informacinę erdvę ir spręsti ekologines problemas, susijusias su laikinais metaboliniais pokyčiais reaguojant į aplinkos ženklus. Visų pirma, šio metodo gebėjimas slypi jo gebėjime palyginti augalų rūšių viduje ir tarp jų vykstančius modelius, siekiant ištirti, kaip žolėdžiai išsivystė iš skirtingų rūšių į tarprūšinius makroevoliucinius modelius skirtinguose evoliucijos lygiuose. Metabolizmas.
Pagrindinių komponenčių analizė (PCA) konvertuoja daugiamatį duomenų rinkinį į dimensijų mažinimo erdvę, kad būtų galima paaiškinti pagrindinę duomenų tendenciją, todėl ji paprastai naudojama kaip tiriamoji technika duomenų rinkiniui analizuoti, pavyzdžiui, dekonvoliucijos metabolomui. Tačiau dimensijų mažinimas praras dalį informacijos turinio duomenų rinkinyje, o PCA negali pateikti kiekybinės informacijos apie charakteristikas, kurios yra ypač svarbios ekologinei teorijai, pavyzdžiui: kaip žolėdžiai pertvarko įvairovę specializuotose srityse (pvz., gausumas, pasiskirstymas) ir metabolitus? Kurie metabolitai yra tam tikro žolėdžio indukuotos būsenos prognozuotojai? Specifiškumo, įvairovės ir indukuojamumo požiūriu, lapams būdingo metabolito profilio informacijos turinys yra suskaidomas ir nustatoma, kad žolėdžių valgymas gali aktyvuoti specifinį metabolizmą. Netikėtai pastebėjome, kad, kaip aprašyta įgyvendintuose informacijos teorijos rodikliuose, susidariusi metabolizmo situacija labai sutampa po dviejų žolėdžių (naktį maitinamo generalisto Sl) ir Solanaceae ekspertės Ms. atakų. Nors jų maitinimosi elgesys ir koncentracija labai skiriasi. Riebalų rūgščių ir aminorūgščių konjugato (FAC) iniciatorius OS (31). Naudojant žolėdžių OS standartizuotoms durtinėms žaizdoms gydyti, imituotas žolėdžių gydymas taip pat parodė panašią tendenciją. Ši standartizuota augalų reakcijos į žolėdžių atakas modeliavimo procedūra pašalina painiavos veiksnius, kuriuos sukelia žolėdžių valgymo elgsenos pokyčiai, dėl kurių skirtingu metu atsiranda skirtingas žalos laipsnis (34). FAC, kuris yra žinomas kaip pagrindinė OSM priežastis, sumažina JAS ir kitų augalų hormonų atsaką OSS1, o OSS1 sumažina šimtus kartų (31). Tačiau OSS1 sukėlė panašų JA kaupimosi lygį, palyginti su OSM. Anksčiau buvo įrodyta, kad JA atsakas susilpnintuose Nepenthes yra labai jautrus OSM, kur FAC gali išlaikyti savo aktyvumą net praskiestas vandeniu santykiu 1:1000 (44). Todėl, palyginti su OSM, nors FAC OSS1 yra labai mažas, jo pakanka, kad sukeltų pakankamą JA protrūkį. Ankstesni tyrimai parodė, kad poriną primenantys baltymai (45) ir oligosacharidai (46) gali būti naudojami kaip molekuliniai užuominos, sukeliančios augalų apsaugos reakcijas OSS1. Tačiau vis dar neaišku, ar šie OSS1 elicitoriai yra atsakingi už JA kaupimąsi, pastebėtą šiame tyrime.
Nors yra nedaug tyrimų, apibūdinančių skirtingus metabolinius pirštų atspaudus, kuriuos sukelia skirtingų žolėdžių arba egzogeninių JA arba SA (salicilo rūgšties) taikymas (47), niekas netaikė žolėdžių rūšiai būdingo augalų žolių tinklo sutrikimo ir jo poveikio konkrečiai asmeninei informacijai. Bendras metabolizmo poveikis yra sistemingai tiriamas. Ši analizė dar kartą patvirtino, kad vidinis hormonų tinklo ryšys su kitais augalų hormonais, išskyrus JA, formuoja žolėdžių sukeltos metabolinės reorganizacijos specifiškumą. Visų pirma, nustatėme, kad OSM sukeltas ET buvo žymiai didesnis nei OSS1. Šis režimas atitinka didesnį FAC kiekį OSM, kuris yra būtina ir pakankama sąlyga ET protrūkiui sukelti (48). Augalų ir žolėdžių sąveikos kontekste ET signalizacijos funkcija augalams būdingoje metabolitų dinamikoje vis dar yra sporadinė ir nukreipta tik į vieną junginių grupę. Be to, daugumoje tyrimų ET reguliavimui tirti buvo naudojamas egzogeninis ET arba jo pirmtakų arba įvairių inhibitorių taikymas, tarp kurių šie egzogeniniai cheminiai taikymai sukels daug nespecifinių šalutinių poveikių. Mūsų žiniomis, šis tyrimas yra pirmasis didelio masto sistemingas ET vaidmens panaudojimas sutrikusių transgeninių augalų auginimui ir suvokimui, siekiant koordinuoti augalų metabolomo dinamiką, tyrimas. Žolėdžiams būdinga ET indukcija galiausiai gali moduliuoti metabolomo atsaką. Reikšmingiausia yra transgeninė ET biosintezės (ACO) ir suvokimo (ETR1) genų manipuliacija, kuri atskleidė žolėdžiams būdingą fenolamidų kaupimąsi de novo. Anksčiau buvo įrodyta, kad ET gali tiksliai sureguliuoti JA sukeltą nikotino kaupimąsi reguliuodamas putrescino N-metiltransferazę (49). Tačiau mechaniniu požiūriu nėra aišku, kaip ET tiksliai sureguliuoja fenamido indukciją. Be ET signalo perdavimo funkcijos, metabolinis srautas taip pat gali būti nukreiptas į S-adenozil-1-metioniną, kad būtų reguliuojamas investavimas į poliaminofenolio amidus. S-adenozil-1-metioninas yra ET ir bendras poliamino biosintezės kelio tarpinis produktas. Mechanizmas, kuriuo ET signalas reguliuoja fenolamido kiekį, reikalauja tolesnių tyrimų.
Ilgą laiką dėl didelio nežinomos struktūros specialiųjų metabolitų skaičiaus intensyvus dėmesys specifinėms metabolinių kategorijoms negalėjo griežtai įvertinti metabolinės įvairovės pokyčių laike po biologinių sąveikų. Šiuo metu, remiantis informacijos teorijos analize, pagrindinis MS/MS spektro gavimo, pagrįsto nešališkais metabolitais, rezultatas yra tas, kad žolėdžiai, mintantys žolėdžiais arba juos imituojantys, toliau mažina bendrą lapo metabolomo metabolinę įvairovę, tuo pačiu didindami jo specializacijos laipsnį. Šis laikinas žolėdžių sukeltas metabolomo specifiškumo padidėjimas yra susijęs su sinergetiniu transkriptomo specifiškumo padidėjimu. Prie šios didesnės metabolomo specializacijos labiausiai prisidedantis požymis (turintis didesnę Si vertę) yra specialus metabolitas, turintis anksčiau apibūdintą žolėdžio funkciją. Šis modelis atitinka OD teorijos prognozę, tačiau MT prognozė, susijusi su metabolomo perprogramavimo atsitiktinumu, nėra nuosekli. Tačiau šie duomenys taip pat atitinka mišraus modelio (geriausias MT; 1B pav.) prognozę, nes kiti neapibūdinti metabolitai su nežinomomis gynybinėmis funkcijomis vis dar gali laikytis atsitiktinio Si pasiskirstymo.
Šiame tyrime dar kartą pastebėtas vertas dėmesio modelis yra tas, kad nuo mikroevoliucijos lygmens (vienas augalas ir tabako populiacija) iki didesnio evoliucinio masto (glaudžiai giminingos tabako rūšys) skirtingi evoliucinės organizacijos lygiai yra „geriausioje gynyboje“. Žolėdžių gebėjimai labai skiriasi. Moore ir kt. (20) bei Kessler ir Kalske (1) nepriklausomai pasiūlė tris Whittakerio (50) iš pradžių išskirti biologinės įvairovės funkcinius lygius paversti konstituciniais ir indukuotais cheminės įvairovės pokyčiais laike; šie autoriai neapibendrino nei vieno didelio masto metabolomų duomenų rinkimo procedūros, nei kito. Šiame tyrime atliekant nedidelius Whittakerio funkcinės klasifikacijos pakeitimus, α-metabolinė įvairovė bus laikoma MS/MS spektrų įvairove tam tikrame augale, o β-metabolinė įvairovė – pagrindiniu populiacijų grupės vidurūšiniu metabolizmu, o γ-metabolinė įvairovė bus panašių rūšių analizės išplėtimas.
JA signalas yra būtinas įvairiems žolėdžių metaboliniams atsakams. Tačiau trūksta griežtų kiekybinių JA biosintezės vidurūšinio reguliavimo indėlio į metabolomų įvairovę tyrimų, ir vis dar neaišku, ar JA signalas yra bendra streso sukeltos metabolinės diversifikacijos vieta aukštesniu makroevoliuciniu mastu. Pastebėjome, kad žolėdžių Nepenthes žolėdžių žolėdžių žolėdumas skatina metabolomų specializaciją, o metabolomų specializacijos skirtumai Nicotiana rūšių populiacijoje ir tarp artimai susijusių Nicotiana rūšių yra sistemingai teigiamai koreliuojami su JA signalizacija. Be to, sutrikus JA signalui, vieno genotipo žolėdžio sukeltas metabolinis specifiškumas bus panaikintas (3 pav., C ir E). Kadangi natūraliai susilpnintų Nepenthes populiacijų metabolinio spektro pokyčiai dažniausiai yra kiekybiniai, metabolinės β įvairovės ir specifiškumo pokyčius šioje analizėje daugiausia gali lemti stiprus metabolitais turtingų junginių kategorijų sužadinimas. Šios junginių klasės dominuoja dalyje metabolomo profilio ir lemia teigiamą koreliaciją su JA signalais.
Kadangi glaudžiai susijusių tabako rūšių biocheminiai mechanizmai labai skiriasi, metabolitai yra specifiškai identifikuojami kokybiniu aspektu, todėl jis yra labiau analitiškas. Informacijos teorijos atliktas užfiksuoto metabolinio profilio apdorojimas atskleidžia, kad žolėdžių indukcija paaštrina kompromisą tarp metabolinės gama įvairovės ir specializacijos. JA signalas vaidina pagrindinį vaidmenį šiame kompromise. Metabolomo specializacijos padidėjimas atitinka pagrindinę OD prognozę ir yra teigiamai koreliuojamas su JA signalu, o JA signalas yra neigiamai koreliuojamas su metaboline gama įvairove. Šie modeliai rodo, kad augalų OD pajėgumą daugiausia lemia JA plastiškumas, tiek mikroevoliuciniu, tiek platesniu evoliuciniu mastu. Egzogeniniai JA taikymo eksperimentai, kuriais apeinami JA biosintezės defektai, dar labiau atskleidžia, kad glaudžiai susijusias tabako rūšis galima atskirti į signalą reaguojančias ir į signalą nereaguojančias rūšis, kaip ir jų JA režimą bei metabolomo plastiškumą, kurį sukelia žolėdžiai. Į signalą nereaguojančios rūšys negali reaguoti dėl savo nesugebėjimo gaminti endogeninio JA, todėl joms taikomi fiziologiniai apribojimai. Tai gali būti dėl kai kurių pagrindinių JA signalizacijos kelio genų (AOS ir JAR4 N. crescens) mutacijų. Šis rezultatas pabrėžia, kad šiuos tarprūšinius makroevoliucinius modelius gali daugiausia lemti vidinių hormonų suvokimo ir reagavimo į juos pokyčiai.
Be augalų ir žolėdžių sąveikos, medžiagų apykaitos įvairovės tyrinėjimas yra susijęs su visais svarbiais teoriniais pasiekimais tiriant biologinę adaptaciją prie aplinkos ir sudėtingų fenotipinių požymių evoliuciją. Padidėjus šiuolaikiniais MS prietaisais surenkamų duomenų kiekiui, hipotezių apie medžiagų apykaitos įvairovę tikrinimas dabar gali peržengti individualių/kategorijų metabolitų skirtumus ir atlikti globalią analizę, siekiant atskleisti netikėtus modelius. Didelės apimties analizės procese svarbi metafora yra prasmingų žemėlapių, kuriuos būtų galima naudoti duomenims tirti, sumanymo idėja. Todėl svarbus dabartinio nešališko MS/MS metabolomikos ir informacijos teorijos derinio rezultatas yra tas, kad jis suteikia paprastą rodiklį, kurį galima naudoti žemėlapiams sudaryti, kad būtų galima naršyti medžiagų apykaitos įvairovę skirtingais taksonominiais masteliais. Tai yra pagrindinis šio metodo reikalavimas. Mikro/makro evoliucijos ir bendrijų ekologijos tyrimas.
Makroevoliucijos lygmeniu Ehrlicho ir Raveno (51) augalų ir vabzdžių koevoliucijos teorijos esmė yra numatyti, kad tarprūšinės medžiagų apykaitos įvairovės kitimas yra augalų linijų diversifikacijos priežastis. Tačiau per penkiasdešimt metų nuo šio novatoriško darbo paskelbimo ši hipotezė buvo retai tikrinama (52). Taip yra daugiausia dėl panašių medžiagų apykaitos savybių filogenetinių savybių, būdingų skirtingoms tolimojo nuotolio augalų linijoms. Šis retumas gali būti naudojamas tikslinės analizės metodams įtvirtinti. Dabartinis MS/MS darbo eiga, apdorojama informacijos teorijos, kiekybiškai įvertina nežinomų metabolitų MS/MS struktūrinį panašumą (be išankstinio metabolitų atrankos) ir paverčia šiuos MS/MS į MS/MS rinkinį, taigi profesionalioje medžiagų apykaitoje šie makroevoliucijos modeliai lyginami klasifikavimo skalėje. Paprasti statistiniai rodikliai. Procesas panašus į filogenetinę analizę, kuri gali naudoti sekų lygiavimą, kad būtų galima kiekybiškai įvertinti diversifikacijos greitį arba charakteristikų evoliuciją be išankstinio prognozavimo.
Biocheminiu lygmeniu Firno ir Joneso (53) atrankos hipotezė rodo, kad metabolinė įvairovė palaikoma skirtingais lygmenimis, siekiant gauti žaliavų anksčiau nesusijusių arba pakeistų metabolitų biologiniam aktyvumui pasireikšti. Informacijos teorijos metodai suteikia sistemą, kurioje šie metabolitams būdingi evoliuciniai perėjimai, vykstantys metabolitų specializacijos metu, gali būti kiekybiškai įvertinti kaip siūlomo evoliucinio atrankos proceso dalis: biologiškai aktyvi adaptacija nuo mažo specifiškumo prie didelio specifiškumo. Tam tikroje aplinkoje slopinami metabolitai.
Apskritai molekulinės biologijos pradžioje buvo sukurtos svarbios augalų apsaugos teorijos, o dedukcinės hipotezės pagrįsti metodai yra plačiai laikomi vienintele mokslo pažangos priemone. Taip yra daugiausia dėl techninių apribojimų, susijusių su viso metabolomo matavimu. Nors hipotezėmis pagrįsti metodai yra ypač naudingi renkantis kitus priežastinius mechanizmus, jų gebėjimas pagerinti mūsų supratimą apie biocheminius tinklus yra labiau ribotas nei skaičiavimo metodų, šiuo metu prieinamų šiuolaikiniame duomenų imliame moksle. Todėl teorijos, kurių negalima numatyti, yra gerokai už turimų duomenų ribų, todėl hipotetinės formulės/bandymo ciklo, susijusio su pažanga tyrimų srityje, negalima panaikinti (4). Numatome, kad čia pristatytas metabolomikos skaičiavimo darbo eiga gali vėl sužadinti susidomėjimą naujausiais (kaip) ir galutiniais (kodėl) metabolinės įvairovės klausimais ir prisidėti prie naujos teoriškai pagrįsto duomenų mokslo eros. Ši era iš naujo peržvelgė svarbias teorijas, įkvėpusias ankstesnes kartas.
Tiesioginis žolėdžių maitinimas atliekamas užauginant antros stadijos lervą arba Sl lervą ant vieno šviesiai spalvoto ąsotenio lapo, priklausančio rožiniam augalui, po 10 augalų kopijų kiekvienam augalui. Vabzdžių lervos buvo suspaudžiamos spaustukais, o likęs lapų audinys surinktas praėjus 24 ir 72 valandoms po užkrėtimo, greitai užšaldomas ir išskiriami metabolitai.
Imituokite žolėdžių poveikį labai sinchronizuotu būdu. Metodas yra toks: audinio rašto ratukais pradurti tris spyglių eiles kiekvienoje trijų visiškai išsiskleidusių augalo lapų vidurio šonkaulių pusėje audinio girliandos augimo stadijoje ir nedelsiant užtepti 1:5 praskiesto Ms. Arba pirštinėmis į dūrio žaizdą įterpti S1 OS. Nuimti ir apdoroti lapą, kaip aprašyta aukščiau. Pirminiams metabolitams ir augalų hormonams išskirti naudokite anksčiau aprašytą metodą (54).
Egzogeniniams JA taikymams kiekvienos rūšies šešių rožių augalų trys lapkočiai apdorojami 20 μl lanolino pastos, kurioje yra 150 μg MeJA (Lan + MeJA), ir 20 μl lanolino su žaizdų gydymo priemone (Lan + W) arba kaip kontrolė naudojama 20 μl gryno lanolino. Lapai buvo nuimami praėjus 72 valandoms po apdorojimo, užšaldomi skystame azote ir laikomi -80 °C temperatūroje iki naudojimo.
Mūsų tyrimų grupėje buvo identifikuotos keturios JA ir ET transgeninės linijos: irAOC (36), irCOI1 (55), irACO ir sETR1 (48). irAOC gene pastebimai sumažėjo JA ir JA-Ile kiekis, o irCOI1 nebuvo jautrus JA. Palyginti su EV, JA-Ile kaupimasis padidėjo. Panašiai irACO sumažina ET gamybą, o palyginti su EV, sETR1, kuris nėra jautrus ET, padidina ET gamybą.
Neinvaziniam ET matavimui naudojamas fotoakustinis lazerinis spektrometras („Sensor Sense ETD-300“ realaus laiko ET jutiklis). Iškart po apdorojimo pusė lapų buvo nupjauta ir perkelta į 4 ml sandarų stiklinį buteliuką, o viršutinėje erdvėje leista kauptis per 5 valandas. Matavimo metu kiekvienas buteliukas 8 minutes buvo praplaunamas 2 litrų/valandą gryno oro srove, kuri prieš tai buvo praleista per „Sensor Sense“ pateiktą katalizatorių, kad būtų pašalintas CO2 ir vanduo.
Mikrogardelių duomenys iš pradžių buvo paskelbti (35) ir išsaugoti Nacionalinio biotechnologijų informacijos centro (NCBI) genų ekspresijos išsamioje duomenų bazėje (prisijungimo numeris GSE30287). Šiam tyrimui buvo išskirti duomenys apie lapus, atsiradusius dėl W + OSM apdorojimo, ir nepažeistą kontrolinę grupę. Neapdorotas intensyvumas yra log2. Prieš statistinę analizę pradinė vertė buvo konvertuota ir normalizuota iki 75-ojo procentilio naudojant R programinės įrangos paketą.
Originalūs Nicotiana rūšių RNR sekoskaitos (RNR-sekvenavimo) duomenys buvo gauti iš NCBI trumpųjų skaitymų archyvų (SRA), projekto numeris PRJNA301787, kurį pateikė Zhou ir kt. (39), ir tęsiama, kaip aprašyta (56). Šiame tyrime analizei buvo atrinkti neapdoroti duomenys, apdoroti W + W, W + OSM ir W + OSS1, atitinkantys Nicotiana rūšis, ir apdoroti taip: pirmiausia, neapdoroti RNR sekoskaitos rodmenys buvo konvertuoti į FASTQ formatą. HISAT2 konvertuoja FASTQ į SAM, o SAMtools konvertuoja SAM failus į surūšiuotus BAM failus. „StringTie“ naudojama genų raiškai apskaičiuoti, o jos raiškos metodas yra tas, kad fragmentų yra tūkstančiui bazių fragmentų milijonui sekvenuotų transkripcijos fragmentų.
Analizėje naudojama „Acclaim“ chromatografinė kolonėlė (150 mm x 2,1 mm; dalelių dydis 2,2 μm) ir 4 mm x 4 mm apsauginė kolonėlė pagamintos iš tos pačios medžiagos. „Dionex UltiMate 3000“ itin efektyviosios skysčių chromatografijos (UHPLC) sistemoje naudojamas toks dvejetainis gradientas: 0–0,5 minutės, izokratinis 90 % A [dejonizuotas vanduo, 0,1 % (v/v) acetonitrilas ir 0,05 % skruzdžių rūgštis], 10 % B (acetonitrilas ir 0,05 % skruzdžių rūgštis); 0,5–23,5 minutės, gradiento fazė yra atitinkamai 10 % A ir 90 % B; 23,5–25 minutės, izokratinis 10 % A ir 90 % B. Srauto greitis yra 400 μl/min. Visoms MS analizėms kolonėlės eliuentas įpurškiamas į kvadrupolio ir skrydžio laiko (qTOF) analizatorių, turintį elektropurškimo šaltinį, veikiantį teigiamos jonizacijos režimu (kapiliarinė įtampa – 4500 V; kapiliarinis išėjimas – 130 V; džiovinimo temperatūra – 200 °C; džiovinimo oro srautas – 10 litrų/min.).
Atlikite MS/MS fragmentų analizę (toliau – MS/MS), kuri yra nesvarbi arba neatskiriama nuo duomenų, kad gautumėte struktūrinės informacijos apie bendrą aptinkamą metabolinį profilį. Neatrenkamojo MS/MS metodo koncepcija remiasi tuo, kad kvadrupolis turi labai didelį masės izoliacijos langą [todėl visus masės ir krūvio santykio (m/z) signalus laikykite fragmentais]. Dėl šios priežasties, kadangi „Impact II“ prietaisas negalėjo sukurti CE posvyrio, buvo atliktos kelios nepriklausomos analizės, naudojant padidintas susidūrimo sukeltos disociacijos susidūrimo energijos (CE) vertes. Trumpai tariant, pirmiausia išanalizuokite mėginį UHPLC-elektropurškimo jonizacijos/qTOF-MS metodu, naudodami vienos masės spektrometrijos režimą (mažos fragmentacijos sąlygos, generuojamos fragmentacijos šaltinio viduje), skenuodami nuo m/z 50 iki 1500, esant 5 Hz pasikartojimo dažniui. MS/MS analizei naudokite azotą kaip susidūrimo dujas ir atlikite nepriklausomus matavimus esant šioms keturioms skirtingoms susidūrimo sukeltos disociacijos įtampoms: 20, 30, 40 ir 50 eV. Viso matavimo proceso metu kvadrupolis turi didžiausią masės izoliacijos langą – nuo ​​m/z 50 iki 1500. Kai priekinio kūno m/z ir izoliacijos pločio eksperimentas nustatytas į 200, masės diapazoną automatiškai aktyvuoja prietaiso valdymo programinė įranga ir 0 Da. Masės fragmentus nuskaitykite kaip ir vienos masės režimu. Masės kalibravimui naudokite natrio formiatą (50 ml izopropanolio, 200 μl skruzdžių rūgšties ir 1 ml 1 M NaOH vandeninio tirpalo). Naudojant „Bruker“ didelio tikslumo kalibravimo algoritmą, duomenų failas kalibruojamas atlikus vidutinio spektro skaičiavimą per tam tikrą laikotarpį. Norėdami konvertuoti neapdorotus duomenų failus į „NetCDF“ formatą, naudokite „Data Analysis v4.0“ programinės įrangos („Brook Dalton“, Bremenas, Vokietija) eksportavimo funkciją. MS/MS duomenų rinkinys buvo išsaugotas atviroje metabolomikos duomenų bazėje „MetaboLights“ (www.ebi.ac.uk) su prieigos numeriu MTBLS1471.
MS/MS surinkimas gali būti realizuotas naudojant koreliacijos analizę tarp MS1 ir MS/MS kokybės signalų, esant mažai ir didelei susidūrimo energijai, bei naujai įdiegtomis taisyklėmis. R skriptas naudojamas pirmtako pasiskirstymo produktui koreliacijos analizei realizuoti, o C# skriptas (https://github.com/MPI-DL/indiscriminant-MS-MS-assembly-pipeline) – taisyklėms įgyvendinti.
Siekdami sumažinti klaidingai teigiamas paklaidas, kurias sukelia foninis triukšmas ir klaidinga koreliacija, kurią sukelia tam tikrų m/z požymių aptikimas tik keliuose mėginiuose, naudojame R paketo XCMS „užpildytos smailės“ funkciją (fono triukšmo korekcijai). Ji turėtų būti naudojama „NA“ (neaptiktos smailės) intensyvumui pakeisti. Naudojant užpildytos smailės funkciją, duomenų rinkinyje vis tiek yra daug „0“ intensyvumo reikšmių, kurios turės įtakos koreliacijos skaičiavimui. Tada palyginame duomenų apdorojimo rezultatus, gautus naudojant užpildytos smailės funkciją ir nenaudojant užpildytos smailės funkcijos, ir apskaičiuojame foninio triukšmo reikšmę pagal vidutinę pakoreguotą įvertintą reikšmę, o tada šias 0 intensyvumo reikšmes pakeičiame apskaičiuota fono reikšme. Taip pat atsižvelgėme tik į tas ypatybes, kurių intensyvumas tris kartus viršijo fono reikšmę, ir laikėme jas „tikrosiomis smailėmis“. PCC skaičiavimams atsižvelgiama tik į mėginio pirmtako (MS1) ir fragmentų duomenų rinkinių, turinčių bent aštuonias tikras smailes, m/z signalus.
Jei pirmtako kokybės požymio intensyvumas visame mėginyje reikšmingai koreliuoja su to paties kokybės požymio, veikiamo mažos arba didelės susidūrimo energijos, sumažėjusiu intensyvumu, ir CAMERA nepažymi šio požymio kaip izotopo smailės, jį galima išsamiau apibrėžti. Tuomet, apskaičiuojant visas įmanomas pirmtako ir produkto poras per 3 s (apytikslis smailės išlaikymo sulaikymo laiko langas), atliekama koreliacijos analizė. Fragmentu laikomas tik tada, kai m/z vertė yra mažesnė už pirmtako vertę ir MS/MS fragmentacija įvyksta toje pačioje mėginio vietoje duomenų rinkinyje kaip ir pirmtakas, iš kurio jis gautas.
Remiantis šiomis dviem paprastomis taisyklėmis, mes atmetame nurodytus fragmentus, kurių m/z vertės yra didesnės nei identifikuoto pirmtako m/z, ir remdamiesi mėginio pozicija, kurioje yra pirmtakas, ir nurodytu fragmentu. Taip pat galima pasirinkti daugelio MS1 režimu sugeneruotų šaltinio fragmentų sugeneruotus kokybės požymius kaip kandidatus pirmtakus, taip generuojant perteklinius MS/MS junginius. Siekdami sumažinti šį duomenų perteklių, jei spektrų NDP panašumas viršija 0,6 ir jie priklauso CAMERA anotuotai chromatogramai „pcgroup“, mes juos sujungsime. Galiausiai, visus keturis su pirmtaku ir fragmentais susijusius CE rezultatus sujungsime į galutinį dekonvoliuotą sudėtinį spektrą, pasirinkdami didžiausio intensyvumo smailę iš visų kandidatų smailių, turinčių tą pačią m/z vertę skirtingose ​​susidūrimo energijose. Vėlesni apdorojimo etapai grindžiami sudėtinio spektro koncepcija ir atsižvelgia į skirtingas CE sąlygas, reikalingas norint maksimaliai padidinti fragmentacijos tikimybę, nes kai kuriuos fragmentus galima aptikti tik esant konkrečiai susidūrimo energijai.
Metabolizmo profilio indukuojamumui apskaičiuoti buvo naudojamas RDPI (30). Metabolizmo spektro įvairovė (Hj indeksas) apskaičiuojama pagal MS/MS pirmtakų gausą, naudojant MS/MS dažnių pasiskirstymo Šenono entropiją pagal šią Martínez ir kt. (8) aprašytą lygtį. Hj = −∑i = 1mPijlog2(Pij), kur Pij atitinka i-tojo MS/MS santykinį dažnį j-tajame mėginyje (j = 1, 2,…, m) (i = 1, 2,…, m) t).
Metabolinis specifiškumas (Si indeksas) apibrėžiamas kaip tam tikros MS/MS ekspresijos tapatumas, atsižvelgiant į nagrinėjamų mėginių dažnį. MS/MS specifiškumas apskaičiuojamas taip: Si = 1t (∑j = 1tPijPilog2PijPi).
Naudokite šią formulę, kad išmatuotumėte kiekvieno j mėginio metabolomui būdingą δj indeksą ir MS/MS specifiškumo vidurkį δj = ∑i = 1mPijSi.
MS/MS spektrai sulygiuojami poromis, o panašumas apskaičiuojamas pagal du balus. Pirmiausia, naudojant standartinį NDP (dar vadinamą kosinuso koreliacijos metodu), naudojama ši lygtis segmentų panašumui tarp spektrų įvertinti: NDP = (∑iS1 ir S2WS1, iWS2, i) 2∑iWS1, i2∑iWS2, i2, kur S1 ir S2 Atitinkamai 1 ir 2 spektrams, taip pat WS1, i ir WS2, i reiškia svorį, pagrįstą smailės intensyvumu, kai i-tosios bendros smailės skirtumas tarp dviejų spektrų yra mažesnis nei 0,01 Da. Svoris apskaičiuojamas taip: W = [smailės intensyvumas] m [kokybė] n, m = 0,5, n = 2, kaip siūlo „MassBank“.
Buvo įdiegtas antras vertinimo metodas, apimantis bendro NL tarp MS/MS analizę. Šiuo tikslu panaudojome 52 NL sąrašus, dažnai sutinkamus MS fragmentacijos proceso metu, kartu ir konkretesnį NL (duomenų failas S1), kuris anksčiau buvo anotuotas susilpnėjusių Nepenthes rūšių antrinių metabolitų MS/MS spektrui (9, 26). Kiekvienam MS/MS sukurti dvejetainį vektorių, atitinkantį atitinkamai esamą ir neegzistuojantį kai kuriuos NL. Remiantis Euklido atstumo panašumu, NL panašumo balas apskaičiuojamas kiekvienai dvejetainių NL vektorių porai.
Dvigubam klasterizavimui atlikti naudojome R paketą „DiffCoEx“, kuris yra pagrįstas svertinės genų koekspresijos analizės (WGCNA) išplėtimu. Naudodami MS/MS spektrų NDP ir NL vertinimo matricas, naudojome „DiffCoEx“ lyginamosios koreliacijos matricai apskaičiuoti. Dvejetainis klasterizavimas atliekamas nustatant parametrą „cutreeDynamic“ į method = „hybrid“, cutHeight = 0,9999, deepSplit = T ir minClusterSize = 10. „DiffCoEx“ R šaltinio kodą iš papildomo 1 failo atsisiuntė Tesson ir kt. (57); Reikalingą R WGCNA programinės įrangos paketą galima rasti adresu https://horvath.genetics.ucla.edu/html/CoexpressionNetwork/Rpackages/WGCNA.
Norėdami atlikti MS/MS molekulinio tinklo analizę, apskaičiavome porinį spektrinį junglumą pagal NDP ir NL panašumo tipus ir panaudojome „Cytoscape“ programinę įrangą tinklo topologijai vizualizuoti, naudodami organinį išdėstymą „CyFilescape yFiles“ išdėstymo algoritmo plėtinio programoje.
Statistinei duomenų analizei atlikti naudojama R 3.0.1 versija. Statistinis reikšmingumas buvo įvertintas naudojant dvifaktorinę dispersinę analizę (ANOVA), po kurios sekė Tukey sąžiningai reikšmingo skirtumo (HSD) post-hoc testas. Siekiant išanalizuoti skirtumą tarp žolėdžių gydymo ir kontrolinės grupės, dviejų mėginių grupių, turinčių tą pačią dispersiją, dvipusis pasiskirstymas buvo analizuojamas naudojant Student'o t testą.
Papildomos šio straipsnio medžiagos ieškokite adresu http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/24/eaaz0381/DC1
Tai yra atviros prieigos straipsnis, platinamas pagal „Creative Commons Attribution-NonCommercial“ licenciją, kuri leidžia naudoti, platinti ir atgaminti bet kokioje terpėje, jei galutinis panaudojimas nėra skirtas komercinei naudai ir jei prielaida yra ta, kad originalus kūrinys yra teisingas. Nuoroda.
Pastaba: prašome jūsų pateikti savo el. pašto adresą tik tam, kad asmuo, kurį rekomenduojate puslapiui, žinotų, jog norite, kad jis matytų el. laišką ir kad tai nėra šlamštas. Mes neužfiksuosime jokių el. pašto adresų.
Šis klausimas naudojamas norint patikrinti, ar esate lankytojas, ir užkirsti kelią automatiniam šlamšto siuntimui.
Informacijos teorija suteikia universalią valiutą specialiųjų metabolomų palyginimui ir testo gynybos teorijų prognozavimui.
Informacijos teorija suteikia universalią valiutą specialiųjų metabolomų palyginimui ir testo gynybos teorijų prognozavimui.
©2021 Amerikos mokslo pažangos asociacija. visos teisės saugomos. AAAS yra HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ir COUNTER partneris. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.