Straipsnis yra tyrimų temos „Ankštinių augalų atsparumo patogenams ir kenkėjams gerinimas“ dalis, peržiūrėti visus 5 straipsnius
Grybelinės augalų ligos nekrozės Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary sukėlėjas taiko daugiapakopę strategiją skirtingiems augalams šeimininkams užkrėsti. Šiame tyrime siūloma naudoti diaminą L-ornitiną, nebaltyminę aminorūgštį, kuri stimuliuoja kitų nepakeičiamųjų aminorūgščių sintezę, kaip alternatyvią valdymo strategiją, siekiant sustiprinti Phaseolus vulgaris L. molekulinį, fiziologinį ir biocheminį atsaką į baltąjį pelėsį, kurį sukelia Pseudomonas sclerotiorum. In vitro eksperimentai parodė, kad L-ornitinas reikšmingai slopino S. pyrenoidosa micelio augimą priklausomai nuo dozės. Be to, jis galėjo reikšmingai sumažinti baltojo pelėsio sunkumą šiltnamio sąlygomis. Be to, L-ornitinas stimuliavo apdorotų augalų augimą, o tai rodo, kad išbandytos L-ornitino koncentracijos nebuvo fitotoksinės apdorotiems augalams. Be to, L-ornitinas sustiprino nefermentinių antioksidantų (bendrų tirpių fenolių ir flavonoidų) ir fermentinių antioksidantų (katalazės (CAT), peroksidazės (POX) ir polifenolio oksidazės (PPO)) raišką ir padidino trijų su antioksidantais susijusių genų (PvCAT1, PvSOD ir PvGR) raišką. Be to, in silico analizė atskleidė numatomą oksaloacetato acetilhidrolazės (SsOAH) baltymo buvimą S. sclerotiorum genome, kuris funkcinės analizės, konservatyvių domenų ir topologijos požiūriu buvo labai panašus į Aspergillus fijiensis (AfOAH) ir Penicillium sp. (PlOAH) oksaloacetato acetilhidrolazės (SsOAH) baltymus. Įdomu tai, kad L-ornitino pridėjimas prie bulvių dekstrozės sultinio (PDB) terpės reikšmingai sumažino SsOAH geno raišką S. sclerotiorum micelyje. Panašiai, egzogeninis L-ornitino panaudojimas reikšmingai sumažino SsOAH geno raišką grybelinėse micelėse, surinktose iš apdorotų augalų. Galiausiai, L-ornitino panaudojimas reikšmingai sumažino oksalo rūgšties sekreciją tiek PDB terpėje, tiek užkrėstuose lapuose. Apibendrinant galima teigti, kad L-ornitinas atlieka pagrindinį vaidmenį palaikant redokso būseną, taip pat stiprinant užkrėstų augalų apsauginį atsaką. Šio tyrimo rezultatai gali padėti sukurti novatoriškus, aplinkai nekenksmingus baltojo pelėsio kontrolės metodus ir sušvelninti jo poveikį pupelių auginimui ir kitiems augalams.
Baltasis pelėsis, kurį sukelia nekrotrofinis grybelis Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, yra niokojanti, derlių mažinanti liga, kelianti rimtą grėsmę pasaulinei pupelių (Phaseolus vulgaris L.) gamybai (Bolton ir kt., 2006). Sclerotinia sclerotiorum yra vienas sunkiausiai kontroliuojamų dirvožemyje plintančių grybinių augalų patogenų, turintis platų šeimininkų spektrą – daugiau nei 600 augalų rūšių – ir gebėjimą greitai ir nespecifiškai susmulkinti šeimininko audinius (Liang ir Rollins, 2018). Nepalankiomis sąlygomis jis pereina kritinę savo gyvavimo ciklo fazę, ilgą laiką išlikdamas ramybės būsenoje kaip juodos, kietos, į sėklas panašios struktūros, vadinamos „skleročiais“ dirvožemyje, arba kaip balti, pūkuoti dariniai užkrėstų augalų grybienoje ar stiebo šerdyje (Schwartz ir kt., 2005). S. sclerotiorum geba formuoti skleročius, kurie leidžia jai ilgai išgyventi užkrėstuose laukuose ir išlikti ligos metu (Schwartz ir kt., 2005). Skleročiai yra turtingi maistinių medžiagų, gali ilgai išlikti dirvožemyje ir būti pagrindiniu užkratu vėlesnėms infekcijoms (Schwartz ir kt., 2005). Palankiomis sąlygomis skleročiai sudygsta ir išskiria ore esančias sporas, kurios gali užkrėsti visas antžemines augalo dalis, įskaitant, bet neapsiribojant, žiedais, stiebais ar ankštimis (Schwartz ir kt., 2005).
Sclerotinia sclerotiorum naudoja daugiapakopę strategiją šeimininkiniams augalams užkrėsti, apimančią daugybę koordinuotų įvykių – nuo ​​sklerotijų dygimo iki simptomų atsiradimo. Iš pradžių S. sclerotiorum iš grybą primenančių darinių, vadinamų apoteciais, gamina suspenduotas sporas (vadinamas askosporomis), kurios pasklinda ore ir ant užkrėstų augalų liekanų išsivysto į nejudrius skleročius (Bolton ir kt., 2006). Tada grybelis išskiria oksalo rūgštį, virulentiškumo faktorių, kuris kontroliuoja augalo ląstelių sienelių pH, skatina fermentinį skaidymą ir audinių invaziją (Hegedus ir Rimmer, 2005) ir slopina šeimininko augalo oksidacinį protrūkį. Šis rūgštėjimo procesas silpnina augalo ląstelių sienelę, sudarydamas palankią aplinką normaliam ir efektyviam grybelio ląstelių sieneles skaidančių fermentų (LSS) veikimui, leisdamas patogenui įveikti fizinį barjerą ir prasiskverbti į šeimininko audinius (Marciano ir kt., 1983). Patekusi į organizmą, S. sclerotiorum išskiria daug CWDE, tokių kaip poligalakturonazė ir celiulazė, kurios palengvina jų plitimą užkrėstuose audiniuose ir sukelia audinių nekrozę. Pažeidimų ir hifų kilimėlių progresavimas sukelia būdingus baltojo pelėsio simptomus (Hegedus ir Rimmer, 2005). Tuo tarpu augalai-šeimininkai atpažįsta su patogenais susijusius molekulinius modelius (PAMP) per modelių atpažinimo receptorius (PRR), sukeldami signalizacijos įvykių seriją, kuri galiausiai aktyvuoja gynybinius atsakus.
Nepaisant dešimtmečius trukusių ligų kontrolės pastangų, pupelėse, kaip ir kituose komerciniuose pasėliuose, vis dar trūksta tinkamo atsparaus gemalo plazmos dėl patogeno atsparumo, išgyvenamumo ir prisitaikymo. Todėl ligų valdymas yra itin sudėtingas ir reikalauja integruotos, daugialypės strategijos, apimančios kultūrinių praktikų, biologinės kontrolės ir cheminių fungicidų derinį (O'Sullivan ir kt., 2021). Cheminė baltojo pelėsio kontrolė yra veiksmingiausia, nes fungicidai, tinkamai ir tinkamu laiku naudojami, gali veiksmingai kontroliuoti ligos plitimą, sumažinti infekcijos sunkumą ir sumažinti derliaus nuostolius. Tačiau per didelis fungicidų naudojimas ir per didelis jų vartojimas gali lemti atsparių S. sclerotiorum padermių atsiradimą ir neigiamai paveikti netikslinius organizmus, dirvožemio sveikatą ir vandens kokybę (Le Cointe ir kt., 2016; Ceresini ir kt., 2024). Todėl aplinkai nekenksmingų alternatyvų paieška tapo svarbiausiu prioritetu.
Poliaminai (PR), tokie kaip putrescinas, spermidinas, sperminas ir kadaverinas, gali būti perspektyvios alternatyvos prieš dirvožemyje plintančius augalų patogenus, taip visiškai arba iš dalies sumažinant pavojingų cheminių fungicidų naudojimą (Nehela ir kt., 2024; Yi ir kt., 2024). Aukštesniuosiuose augaluose PR dalyvauja daugelyje fiziologinių procesų, įskaitant, bet neapsiribojant, ląstelių dalijimąsi, diferenciaciją ir atsaką į abiotinius ir biotinius stresorius (Killiny ir Nehela, 2020). Jie gali veikti kaip antioksidantai, padėti surišti reaktyviąsias deguonies formas (ROS), palaikyti redokso homeostazę (Nehela ir Killiny, 2023), indukuoti su gynyba susijusius genus (Romero ir kt., 2018), reguliuoti įvairius medžiagų apykaitos kelius (Nehela ir Killiny, 2023), moduliuoti endogeninius fitohormonus (Nehela ir Killiny, 2019), sukurti sisteminį įgytą atsparumą (SAR) ir reguliuoti augalų ir patogenų sąveiką (Nehela ir Killiny, 2020; Asija ir kt., 2022; Czerwoniec, 2022). Verta paminėti, kad konkretūs PA mechanizmai ir vaidmuo augalų apsaugoje skiriasi priklausomai nuo augalų rūšies, patogenų ir aplinkos sąlygų. Gausiausia PA augaluose yra biosintezuojama iš nepakeičiamo poliamino L-ornitino (Killiny ir Nehela, 2020).
L-ornitinas atlieka daug vaidmenų augalų augime ir vystymesi. Pavyzdžiui, ankstesni tyrimai parodė, kad ryžiuose (Oryza sativa) ornitinas gali būti susijęs su azoto perdirbimu (Liu ir kt., 2018), ryžių derliumi, kokybe ir aromatu (Lu ir kt., 2020) bei vandens streso reakcija (Yang ir kt., 2000). Be to, egzogeninis L-ornitino panaudojimas žymiai padidino cukrinių runkelių (Beta vulgaris) atsparumą sausrai (Hussein ir kt., 2019) ir sumažino druskos stresą svogūnų (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu ir Çavuşoǧlu, 2021) ir anakardžių (Anacardium occidentale) augaluose (da Rocha ir kt., 2012). Potencialus L-ornitino vaidmuo abiotinio streso apsaugoje gali būti susijęs su jo dalyvavimu prolino kaupime apdorotuose augaluose. Pavyzdžiui, anksčiau buvo pranešta, kad su prolino metabolizmu susiję genai, tokie kaip ornitino delta aminotransferazės (delta-OAT) ir prolino dehidrogenazės (ProDH1 ir ProDH2) genai, dalyvauja Nicotiana benthamiana ir Arabidopsis thaliana apsaugoje nuo ne šeimininko Pseudomonas syringae padermių (Senthil-Kumar ir Mysore, 2012). Kita vertus, grybelinė ornitino dekarboksilazė (ODC) yra būtina patogenų augimui (Singh ir kt., 2020). Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici ODC nukreipimas naudojant šeimininko sukeltą genų nutildymą (HIGS), žymiai padidino pomidorų augalų atsparumą Fusarium vytuliui (Singh ir kt., 2020). Tačiau egzogeninio ornitino panaudojimo potencialus vaidmuo kovojant su biotiniais stresais, tokiais kaip fitopatogenai, nebuvo gerai ištirtas. Dar svarbiau, kad ornitino poveikis atsparumui ligoms ir susiję biocheminiai bei fiziologiniai reiškiniai išlieka iš esmės neištirti.
Suprasti S. sclerotiorum infekcijos ankštiniuose augaluose sudėtingumą yra svarbu kuriant veiksmingas kontrolės strategijas. Šiame tyrime siekėme nustatyti galimą diamino L-ornitino, kaip pagrindinio veiksnio, stiprinant ankštinių augalų gynybos mechanizmus ir atsparumą Sclerotinia sclerotiorum infekcijai, vaidmenį. Mes keliame hipotezę, kad be užkrėstų augalų gynybinių atsakų stiprinimo, L-ornitinas taip pat atlieka svarbų vaidmenį palaikant redokso būseną. Manome, kad galimas L-ornitino poveikis yra susijęs su fermentinių ir nefermentinių antioksidacinių gynybos mechanizmų reguliavimu ir trukdymu grybelių patogeniškumo / virulentiškumo faktoriams bei susijusiems baltymams. Šis dvejopas L-ornitino funkcionalumas daro jį perspektyviu kandidatu kuriant tvarią strategiją, skirtą baltojo pelėsio poveikiui sušvelninti ir paprastųjų ankštinių augalų atsparumui šiam stipriam grybeliniam patogenui padidinti. Šio tyrimo rezultatai gali padėti kurti novatoriškus, aplinkai nekenksmingus baltojo pelėsio kontrolės metodus ir mažinti jo poveikį ankštinių augalų auginimui.
Šiame tyrime kaip eksperimentinė medžiaga buvo naudojama jautri komercinė paprastųjų pupų veislė „Giza 3“ (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3). Sveikas sėklas maloniai suteikė Ankštinių augalų tyrimų skyrius, Lauko kultūrų tyrimų institutas (FCRI), Žemės ūkio tyrimų centras (ARC), Egiptas. Penkios sėklos buvo pasėtos į plastikinius vazonėlius (vidinis skersmuo 35 cm, gylis 50 cm), pripildytus S. sclerotiorum užkrėsto dirvožemio šiltnamio sąlygomis (25 ± 2 °C, santykinė oro drėgmė 75 ± 1 %, 8 val. šviesos / 16 val. tamsos). Praėjus 7–10 dienų po sėjos (DPS), daigai buvo retinami, kad kiekviename vazonėlyje liktų tik du vienodai augantys daigai su trimis visiškai išsiskleidusiais lapais. Visi vazoniniai augalai buvo laistomi kartą per dvi savaites ir tręšiami kas mėnesį rekomenduojama norma atitinkamai veislei.
Norint paruošti 500 mg/l koncentracijos L-ornitindiamino (dar žinomo kaip (+)-(S)-2,5-diaminopentano rūgštis; „Sigma-Aldrich“, Darmštatas, Vokietija), 50 mg pirmiausia buvo ištirpinta 100 ml sterilaus distiliuoto vandens. Tada gautas tirpalas buvo praskiestas ir naudojamas vėlesniuose eksperimentuose. Trumpai tariant, in vitro buvo išbandytos šešios L-ornitino koncentracijų serijos (12,5, 25, 50, 75, 100 ir 125 mg/l). Be to, kaip neigiama kontrolė (mock) buvo naudojamas sterilus distiliuotas vanduo, o kaip teigiama kontrolė – komerciniai fungicidai „Rizolex-T“ 50 % drėkinamieji milteliai (20 % toklofosmetilo + 30 % tiramo; „KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company“, Kafr El Zayat, Garbijos gubernija, Egiptas). Komercinis fungicidas „Rizolex-T“ buvo tiriamas in vitro penkiomis koncentracijomis (2, 4, 6, 8 ir 10 mg/l).
Paprastųjų pupelių stiebų ir ankščių, turinčių tipiškų baltojo pelėsio simptomų (užkrėtimo dažnis: 10–30 %), mėginiai buvo surinkti iš komercinių ūkių. Nors dauguma užkrėstų augalinių medžiagų buvo identifikuotos pagal rūšį/veislę (jautri komercinė veislė „Giza 3“), kitos, ypač gautos iš vietinių turgų, buvo nežinomos rūšies. Surinktos užkrėstos medžiagos pirmiausia buvo paviršutiniškai dezinfekuojamos 0,5 % natrio hipochlorito tirpalu 3 minutes, po to kelis kartus perplaunamos steriliu distiliuotu vandeniu ir nusausinamos steriliu filtro popieriumi, kad būtų pašalintas vandens perteklius. Užkrėsti organai buvo supjaustyti mažais gabalėliais iš vidurinio audinio (tarp sveiko ir užkrėsto audinio), kultivuojami bulvių dekstrozės agaro (PDA) terpėje ir inkubuojami 25 ± 2 °C temperatūroje, esant 12 val. šviesos / 12 val. tamsos ciklui, 5 dienas, siekiant paskatinti skleročių susidarymą. Micelinio galiuko metodas taip pat buvo naudojamas grybų izolatams iš mišrių arba užterštų kultūrų išvalyti. Išgrynintas grybų izoliatas pirmiausia buvo identifikuotas remiantis jo kultūrinėmis morfologinėmis savybėmis, o vėliau, remiantis mikroskopiniais požymiais, patvirtinta, kad tai S. sclerotiorum. Galiausiai, siekiant atitikti Kocho postulatus, visi išgryninti izolatai buvo patikrinti dėl patogeniškumo jautrioje paprastųjų pupų veislėje „Giza 3“.
Be to, invazyviausias S. sclerotiorum izoliatas (3 izoliatas) buvo papildomai patvirtintas remiantis vidinės transkribuotos tarpinės (ITS) sekvenavimu, kaip aprašė White ir kt., 1990; Baturo-Ciesniewska ir kt., 2017. Trumpai tariant, izoliatai buvo kultivuojami bulvių dekstrozės sultinyje (PDB) ir inkubuojami 25 ± 2 °C temperatūroje 5–7 dienas. Tada grybelio micelis buvo surinktas, filtruojamas per marlę, du kartus plaunamas steriliu vandeniu ir džiovinamas steriliu filtro popieriumi. Genominė DNR buvo išskirta naudojant „Quick-DNA™ Fungal/Bacterial Miniprep Kit“ (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah ir kt., 2022, 2024). ITS rDNR regionas buvo amplifikuotas naudojant specifinę pradmenų porą ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; numatomas dydis: 540 bp) (Baturo-Ciesniewska ir kt., 2017). Išgryninti PGR produktai buvo pateikti sekvenavimui (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.). ITS rDNR sekos buvo sekvenuotos dvikrypčiu būdu, naudojant Sanger sekvenavimo metodą. Surinktos užklausos sekos buvo palygintos su naujausiais duomenimis GenBank ir Nacionaliniame biotechnologijų informacijos centre (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) naudojant BLASTn programinę įrangą. Užklausos seka buvo palyginta su 20 kitų S. sclerotiorum padermių / izoliatų, gautų iš naujausių duomenų NCBI GenBank (papildoma lentelė S1), naudojant ClustalW molekulinės evoliucinės genetikos analizės pakete (MEGA-11; 11 versija) (Kumar ir kt., 2024). Evoliucinė analizė atlikta naudojant didžiausios tikimybės metodą ir bendrąjį grįžtamojo laiko nukleotidų pakeitimo modelį (Nei ir Kumar, 2000). Parodytas medis su didžiausia logaritmine tikimybe. Pradinis euristinės paieškos medis parenkamas pasirenkant medį su didesne logaritmine tikimybe iš kaimyninio jungimo (NJ) medžio (Kumar ir kt., 2024) ir maksimalios parsimonijos (MP) medžio. NJ medis buvo sukonstruotas naudojant porinę atstumo matricą, apskaičiuotą naudojant bendrąjį grįžtamojo laiko modelį (Nei ir Kumar, 2000).
L-ornitino ir baktericido „Rizolex-T“ antibakterinis aktyvumas buvo nustatytas in vitro agaro difuzijos metodu. Metodas: Paimkite reikiamą L-ornitino tirpalo (500 mg/l) kiekį ir kruopščiai sumaišykite jį su 10 ml PDA maitinamosios terpės, kad paruoštumėte tirpalus, kurių galutinė koncentracija būtų atitinkamai 12,5, 25, 50, 75, 100 ir 125 mg/l. Kontroliniu tirpalu buvo naudojamos penkios fungicido „Rizolex-T“ koncentracijos (2, 4, 6, 8 ir 10 mg/l) ir sterilus distiliuotas vanduo. Terpei sukietėjus, į Petri lėkštelės centrą buvo perkeltas šviežiai paruoštas 4 mm skersmens Sclerotinia sclerotiorum kultūros micelio kamštis ir kultivuojamas 25±2 °C temperatūroje, kol micelis padengė visą kontrolinę Petri lėkštelę, po to buvo užregistruotas grybelio augimas. Apskaičiuokite S. sclerotiorum radialinio augimo slopinimo procentą pagal 1 lygtį:
Eksperimentas buvo pakartotas du kartus, kiekvienai kontrolinei / eksperimentinei grupei naudojant šešis biologinius pakartojimus ir penkis vazonus (po du augalus vazone). Kiekvienas biologinis pakartojimas buvo analizuojamas du kartus (du techniniai pakartojimai), siekiant užtikrinti eksperimentinių rezultatų tikslumą, patikimumą ir atkuriamumą. Be to, probito regresinė analizė buvo naudojama pusinės maksimalios slopinamosios koncentracijos (IC50) ir IC99 apskaičiuoti (Prentice, 1976).
Siekiant įvertinti L-ornitino potencialą šiltnamio sąlygomis, buvo atlikti du iš eilės einantys eksperimentai vazonuose. Trumpai tariant, vazonai buvo pripildyti sterilizuoto molio ir smėlio dirvožemio (3:1) ir inokuliuoti šviežiai paruošta S. sclerotiorum kultūra. Pirmiausia, invazyviausias S. sclerotiorum izoliatas (3 izoliatas) buvo kultivuojamas perpjaunant vieną sklerociją per pusę, padėjus ją veidu žemyn ant PDA ir inkubuojant 25 °C temperatūroje nuolatinėje tamsoje (24 val.) 4 dienas, siekiant paskatinti micelio augimą. Tada nuo priekinio krašto buvo paimti keturi 5 mm skersmens agaro kamščiai ir inokuliuoti 100 g sterilaus kviečių ir ryžių sėlenų mišinio (1:1, v/v), ir visos kolbos buvo inkubuojamos 25 ± 2 °C temperatūroje 12 val. šviesos / 12 val. tamsos cikle 5 dienas, siekiant paskatinti skleročių formavimąsi. Prieš įpilant dirvožemio, visų kolbų turinys buvo kruopščiai sumaišytas, kad būtų užtikrintas homogeniškumas. Tada į kiekvieną vazonėlį buvo įpilta 100 g kolonizuojančios sėlenų mišinio, siekiant užtikrinti pastovią patogenų koncentraciją. Inokuliuoti vazonėliai buvo palaistyti, kad suaktyvėtų grybelių augimas, ir 7 dienoms padėti į šiltnamio sąlygas.
Į kiekvieną vazonėlį buvo pasėtos penkios „Giza 3“ veislės sėklos. Vazonėliuose, apdorotuose L-ornitinu ir fungicidu „Rizolex-T“, sterilizuotos sėklos pirmiausia dvi valandas buvo mirkomos dviejų junginių vandeniniame tirpale, kurio galutinė IC99 koncentracija buvo atitinkamai apie 250 mg/l ir 50 mg/l, o po to prieš sėją vieną valandą džiovinamos ore. Kita vertus, sėklos buvo mirkomos steriliame distiliuotame vandenyje kaip neigiama kontrolė. Po 10 dienų, prieš pirmąjį laistymą, daigai buvo praretinti, kiekviename vazone paliekant tik po du tvarkingus daigus. Be to, siekiant užtikrinti S. sclerotiorum infekciją, toje pačioje vystymosi stadijoje (10 dienų) esantys pupelių augalo stiebai buvo nupjauti dviejose skirtingose ​​vietose sterilizuotu skalpeliu, o į kiekvieną žaizdelę buvo įdėta maždaug 0,5 g kolonizuojančio sėlenų mišinio, po to padidintas drėgnumas, siekiant paskatinti infekciją ir ligos vystymąsi visuose inokuliuotuose augaluose. Kontroliniai augalai buvo panašiai sužeisti, o į žaizdą buvo įdėtas toks pat kiekis (0,5 g) sterilaus, neapsaugoto sėlenų mišinio ir laikomas didelėje drėgmėje, siekiant imituoti ligos vystymosi aplinką ir užtikrinti nuoseklumą tarp gydymo grupių.
Apdorojimo metodas: Pupelių daigai buvo laistomi 500 ml L-ornitino (250 mg/l) vandeninio tirpalo arba fungicidu Rizolex-T (50 mg/l), laistant dirvą, po to apdorojimas buvo pakartotas tris kartus kas 10 dienų. Placebu gydytos kontrolinės grupės buvo laistomos 500 ml sterilaus distiliuoto vandens. Visi apdorojimai buvo atlikti šiltnamio sąlygomis (25 ± 2 °C, 75 ± 1 % santykinė drėgmė ir 8 val. šviesos / 16 val. tamsos fotoperiodas). Visi vazonai buvo laistomi kas dvi savaites ir kas mėnesį apdorojami subalansuotomis NPK trąšomis (20-20-20, su 3,6 % sieros ir TE mikroelementais; „Zain Seeds“, Egiptas), kurių koncentracija 3–4 g/l, purškiant per lapus pagal konkrečios veislės rekomendacijas ir gamintojo instrukcijas. Jei nenurodyta kitaip, 72 val. po apdorojimo (hpt) iš kiekvieno biologinio pakartojimo buvo surinkti visiškai išsisklaidę subrendę lapai (antras ir trečias lapai nuo viršaus), homogenizuoti, sujungti ir laikomi -80 °C temperatūroje tolesnei analizei, įskaitant, bet neapsiribojant, oksidacinio streso indikatorių histocheminį lokalizavimą in situ, lipidų peroksidaciją, fermentinius ir nefermentinius antioksidantus bei genų raišką.
Baltojo pelėsio infekcijos intensyvumas buvo vertinamas kas savaitę praėjus 21 dienai po inokuliacijos (dpi), naudojant 1–9 skalę (papildoma S2 lentelė), pagrįstą Petzoldto ir Dicksono skale (1996), modifikuota Terano ir kt. (2006). Trumpai tariant, pupelių augalų stiebai ir šakos buvo tiriami pradedant nuo inokuliacijos taško, siekiant stebėti pažeidimų progresavimą išilgai tarpbamblių ir mazgų. Tada buvo matuojamas pažeidimo atstumas nuo inokuliacijos taško iki tolimiausio taško išilgai stiebo ar šakos ir, atsižvelgiant į pažeidimo vietą, priskirtas 1–9 balas, kur (1) rodė, kad šalia inokuliacijos taško nėra matomos infekcijos, o (2–9) rodė laipsnišką pažeidimo dydžio didėjimą ir progresavimą išilgai mazgų/tarpbamblių (papildoma S2 lentelė). Baltojo pelėsio infekcijos intensyvumas buvo perskaičiuotas į procentus pagal 2 formulę:
Be to, plotas po ligos progresavimo kreive (AUDPC) buvo apskaičiuotas pagal formulę (Shaner ir Finney, 1977), kuri neseniai buvo pritaikyta paprastųjų pupų baltajam puviniui (Chauhan ir kt., 2020) naudojant 3 lygtį:
Kur Yi = ligos sunkumas laiko momentu ti, Yi+1 = ligos sunkumas kitu laiko momentu ti+1, ti = pirmojo matavimo laikas (dienomis), ti+1 = kito matavimo laikas (dienomis), n = bendras laiko taškų arba stebėjimo taškų skaičius. Pupelių augalo augimo parametrai, įskaitant augalo aukštį (cm), šakų skaičių vienam augalui ir lapų skaičių vienam augalui, buvo registruojami kas savaitę 21 dieną visuose biologiniuose pakartojimuose.
Kiekviename biologiniame kartotinyje lapų mėginiai (antras ir trečias visiškai išsivystę lapai nuo viršaus) buvo surinkti 45 dieną po apdorojimo (15 dienų po paskutinio apdorojimo). Kiekvieną biologinį kartotinį sudarė penki vazonai (po du augalus vazone). Apie 500 mg susmulkinto audinio buvo panaudota fotosintetiniams pigmentams (chlorofilui a, chlorofilui b ir karotenoidams) ekstrahuoti naudojant 80 % acetoną 4 °C temperatūroje tamsoje. Po 24 val. mėginiai buvo centrifuguoti, o supernatantas buvo surinktas chlorofilo a, chlorofilo b ir karotenoidų kiekiui nustatyti kolorimetriniu būdu, naudojant UV-160A spektrofotometrą („Shimadzu Corporation“, Japonija) pagal Lichtenthaler, 1987 m. metodą, matuojant absorbciją esant trims skirtingiems bangos ilgiams (A470, A646 ir A663 nm). Galiausiai fotosintetinių pigmentų kiekis buvo apskaičiuotas pagal Lichtenthaler (1987) aprašytas 4–6 formules.
Praėjus 72 val. po apdorojimo (hpt), iš kiekvieno biologinio pakartojimo buvo surinkti lapai (antras ir trečias visiškai išsivystę lapai nuo viršaus), kad būtų galima in situ histochemiškai nustatyti vandenilio peroksido (H2O2) ir superoksido anijono (O2•−) lokalizaciją. Kiekvieną biologinį pakartojimą sudarė penki vazonai (po du augalus vazone). Kiekvienas biologinis pakartojimas buvo analizuojamas du kartus (du techniniai pakartojimai), siekiant užtikrinti metodo tikslumą, patikimumą ir atkuriamumą. H2O2 ir O2•− buvo nustatyti naudojant 0,1 % 3,3′-diaminobenzidiną (DAB; „Sigma-Aldrich“, Darmštatas, Vokietija) arba nitromėlynąjį tetrazolį (NBT; „Sigma-Aldrich“, Darmštatas, Vokietija), laikantis Romero-Puertas ir kt. (2004) ir Adam ir kt. (1989) aprašytų metodų su nedideliais pakeitimais. Histocheminei H₂O₂ lokalizacijai in situ lapeliai buvo vakuume infiltruoti 0,1 % DAB 10 mM Tris buferyje (pH 7,8) ir po to inkubuoti kambario temperatūroje šviesoje 60 min. Lapeliai buvo balinti 0,15 % (v/v) TCA 4:1 (v/v) etanolio ir chloroformo tirpale („Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies“, Kairas, Egiptas) ir po to apšviesti, kol patamsėjo. Panašiai, vožtuvėliai buvo vakuume infiltruoti 10 mM kalio fosfato buferiu (pH 7,8), kuriame yra 0,1 m/t % HBT, siekiant histochemiškai lokalizuoti O₂•− in situ. Lapeliai buvo inkubuojami šviesoje kambario temperatūroje 20 min., po to balinti, kaip aprašyta aukščiau, ir po to apšviesti, kol atsirado tamsiai mėlynos/violetinės dėmės. Gautos rudos (kaip H₂O₂ indikatoriaus) arba melsvai violetinės (kaip O₂•− indikatoriaus) spalvos intensyvumas buvo įvertintas naudojant vaizdų apdorojimo paketo „ImageJ“ Fidžio versiją (http://fiji.sc; žiūrėta 2024 m. kovo 7 d.).
Malondialdehidas (MDA; kaip lipidų peroksidacijos žymuo) buvo nustatytas pagal Du ir Bramlage (1992) metodą su nedideliais pakeitimais. Kiekvieno biologinio pakartojimo lapai (antras ir trečias visiškai išsivystę lapai nuo viršaus) buvo surinkti praėjus 72 valandoms po apdorojimo (hpt). Kiekvieną biologinį pakartojimą sudarė penki vazonai (po du augalus vazone). Kiekvienas biologinis pakartojimas buvo analizuojamas du kartus (du techniniai pakartojimai), siekiant užtikrinti metodo tikslumą, patikimumą ir atkuriamumą. Trumpai tariant, 0,5 g sumalto lapų audinio buvo panaudota MDA ekstrakcijai 20 % trichloracto rūgštimi (TCA; „MilliporeSigma“, Burlingtonas, MA, JAV), kurioje yra 0,01 % butilinto hidroksitolueno (BHT; „Sigma-Aldrich“, Sent Luisas, MO, JAV). MDA kiekis supernatante buvo nustatytas kolorimetriškai, matuojant absorbciją esant 532 ir 600 nm, naudojant UV-160A spektrofotometrą („Shimadzu Corporation“, Japonija), ir tada išreikštas nmol g−1 FW.
Nefermentinių ir fermentinių antioksidantų įvertinimui iš kiekvieno biologinio pakartojimo 72 val. po apdorojimo (hpt) buvo surinkti lapai (antras ir trečias visiškai išsivystę lapai nuo viršaus). Kiekvieną biologinį pakartojimą sudarė penki vazonai (po du augalus vazone). Kiekvienas biologinis mėginys buvo analizuojamas du kartus (du techniniai mėginiai). Du lapai buvo sumalti skystu azotu ir panaudoti tiesiogiai fermentinių ir nefermentinių antioksidantų, bendro aminorūgščių kiekio, prolino kiekio, genų raiškos ir oksalatų kiekybinio nustatymo tyrimams.
Bendras tirpių fenolių kiekis buvo nustatytas naudojant Folin-Ciocalteu reagentą („Sigma-Aldrich“, Sent Luisas, Misūris, JAV), šiek tiek modifikuojant Kahkoneno ir kt. (1999) aprašytą metodą. Trumpai tariant, maždaug 0,1 g homogenizuoto lapų audinio buvo ekstrahuota 20 ml 80 % metanolio tamsoje 24 val., o po centrifugavimo surinktas supernatantas. 0,1 ml mėginio ekstrakto buvo sumaišyta su 0,5 ml Folin-Ciocalteu reagento (10 %), pakratyta 30 s ir palikta tamsoje 5 min. Tada į kiekvieną mėgintuvėlį buvo įpilta 0,5 ml 20 % natrio karbonato tirpalo (Na2CO3; „Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company“, Kairas, Egiptas), kruopščiai išmaišyta ir inkubuota kambario temperatūroje tamsoje 1 val. Po inkubacijos reakcijos mišinio absorbcija buvo matuojama esant 765 nm bangos ilgiui, naudojant UV-160A spektrofotometrą („Shimadzu Corporation“, Japonija). Bendra tirpių fenolių koncentracija mėginių ekstraktuose buvo nustatyta naudojant galio rūgšties kalibravimo kreivę („Fisher Scientific“, Hamptonas, Naujasis Hampšyras, JAV) ir išreikšta galio rūgšties ekvivalento miligramais vienam šviežios masės gramui (mg GAE g-1 šviežios masės).
Bendras tirpių flavonoidų kiekis buvo nustatytas pagal Djeridane ir kt. (2006) metodą su nedideliais pakeitimais. Trumpai tariant, 0,3 ml aukščiau gauto metanolio ekstrakto buvo sumaišyta su 0,3 ml 5 % aliuminio chlorido tirpalo (AlCl3; „Fisher Scientific“, Hamptonas, Naujasis Hampšyras, JAV), intensyviai maišoma ir inkubuojama kambario temperatūroje 5 minutes, po to įpilama 0,3 ml 10 % kalio acetato tirpalo („Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies“, Kairas, Egiptas), kruopščiai sumaišoma ir inkubuojama kambario temperatūroje 30 minučių tamsoje. Po inkubacijos reakcijos mišinio absorbcija buvo matuojama esant 430 nm bangos ilgiui, naudojant UV-160A spektrofotometrą („Shimadzu Corporation“, Japonija). Bendras tirpių flavonoidų kiekis mėginių ekstraktuose buvo nustatytas naudojant rutino kalibravimo kreivę („TCI America“, Portlandas, Oregonas, JAV) ir išreikštas rutino ekvivalento miligramais grame šviežios masės (mg RE g-1 šviežios masės).
Bendras laisvųjų aminorūgščių kiekis pupelių lapuose buvo nustatytas naudojant modifikuotą ninhidrino reagentą („Thermo Scientific Chemicals“, Waltham, MA, JAV), pagrįstą Yokoyama ir Hiramatsu (2003) pasiūlytu bei Sun ir kt. (2006) modifikuotu metodu. Trumpai tariant, 0,1 g sumalto audinio buvo ekstrahuota pH 5,4 buferiu, o 200 μl supernatanto buvo paveikta 200 μl ninhidrino (2 %) ir 200 μl piridino (10 %; „Spectrum Chemical“, Naujasis Brunsvikas, Naujasis Džersis, JAV), inkubuota verdančio vandens vonioje 30 min., po to atvėsinta ir išmatuota esant 580 nm bangos ilgiui, naudojant UV-160A spektrofotometrą („Shimadzu Corporation“, Japonija). Kita vertus, prolinas buvo nustatytas Bateso metodu (Bates ir kt., 1973). Prolinas buvo ekstrahuotas 3 % sulfosalicilo rūgštimi („Thermo Scientific Chemicals“, Waltham, MA, JAV) ir po centrifugavimo 0,5 ml supernatanto sumaišyta su 1 ml ledinės acto rūgšties („Fisher Scientific“, Hampton, NH, JAV) ir ninhidrino reagentu, inkubuota 90 °C temperatūroje 45 min., atvėsinta ir išmatuota esant 520 nm bangos ilgiui tuo pačiu spektrofotometru kaip aprašyta aukščiau. Bendras laisvųjų aminorūgščių ir prolino kiekis lapų ekstraktuose buvo nustatytas naudojant glicino ir prolino kalibravimo kreives („Sigma-Aldrich“, Sent Luisas, Misūris, JAV) ir išreikštas mg/g šviežios masės.
Norint nustatyti antioksidacinių fermentų fermentinį aktyvumą, maždaug 500 mg homogenizuoto audinio buvo ekstrahuota 3 ml 50 mM Tris buferio (pH 7,8), kuriame yra 1 mM EDTA-Na2 („Sigma-Aldrich“, Sent Luisas, Misūris, JAV) ir 7,5 % polivinilpirolidono (PVP; „Sigma-Aldrich“, Sent Luisas, Misūris, JAV), centrifuguota 10 000 × g greičiu 20 min. šaldyme (4 °C temperatūroje), o supernatantas (neapdorotas fermentų ekstraktas) buvo surinktas (El-Nagar ir kt., 2023; Osman ir kt., 2023). Katalazė (CAT) buvo paveikta 2 ml 0,1 M natrio fosfato buferio (pH 6,5; „Sigma-Aldrich“, Sent Luisas, Misūris, JAV) ir 100 μl 269 mM H2O2 tirpalo, siekiant nustatyti jos fermentinį aktyvumą pagal Aebi (1984) metodą su nedideliais pakeitimais (El-Nagar ir kt., 2023; Osman ir kt., 2023). Gvajakolio priklausomos peroksidazės (POX) fermentinis aktyvumas buvo nustatytas naudojant Harrach ir kt. (2009) metodą. (2008) su nedideliais pakeitimais (El-Nagar ir kt., 2023; Osman ir kt., 2023), o polifenolio oksidazės (PPO) fermentinis aktyvumas buvo nustatytas po reakcijos su 2,2 ml 100 mM natrio fosfato buferio (pH 6,0), 100 μl gvajakolio („TCI Chemicals“, Portlandas, Oregonas, JAV) ir 100 μl 12 mM H2O2. Metodas buvo šiek tiek modifikuotas nuo (El-Nagar ir kt., 2023; Osman ir kt., 2023). Tyrimas buvo atliktas po reakcijos su 3 ml katecholio tirpalo („Thermo Scientific Chemicals“, Waltham, MA, JAV) (0,01 M), šviežiai paruošto 0,1 M fosfato buferyje (pH 6,0). KAT aktyvumas buvo matuojamas stebint H2O2 skilimą esant 240 nm bangos ilgiui (A240), POX aktyvumas – stebint absorbcijos padidėjimą esant 436 nm bangos ilgiui (A436), o PPO aktyvumas – registruojant absorbcijos svyravimus esant 495 nm bangos ilgiui (A495) kas 30 s 3 minutes, naudojant UV-160A spektrofotometrą (Shimadzu, Japonija).
Realaus laiko RT-PGR buvo naudojama trijų su antioksidantais susijusių genų, įskaitant peroksisominę katalazę (PvCAT1; „GenBank“ prieigos Nr. KF033307.1), superoksido dismutazę (PvSOD; „GenBank“ prieigos Nr. XM_068639556.1) ir glutationo reduktazę (PvGR; „GenBank“ prieigos Nr. KY195009.1), transkripto lygiams nustatyti pupelių lapuose (antras ir trečias visiškai išsivysčiusius lapus nuo viršaus) praėjus 72 val. po paskutinio apdorojimo. Trumpai tariant, RNR buvo išskirta naudojant „Simply P Total RNA Extraction Kit“ (kat. Nr. BSC52S1; „BioFlux“, „Biori Technology“, Kinija) pagal gamintojo protokolą. Tada kDNR buvo susintetinta naudojant „TOP script™ cDNA Synthesis Kit“ pagal gamintojo instrukcijas. Aukščiau nurodytų trijų genų pradmenų sekos išvardytos papildomoje S3 lentelėje. PvActin-3 (GenBank prisijungimo numeris: XM_068616709.1) buvo naudojamas kaip namų tvarkymo genas, o santykinė geno raiška buvo apskaičiuota naudojant 2-ΔΔCT metodą (Livak ir Schmittgen, 2001). Buvo įrodytas aktino stabilumas biotinio streso (nesuderinamos sąveikos tarp paprastųjų ankštinių augalų ir antraknozės grybelio Colletotrichum lindemuthianum) ir abiotinio streso (sausros, druskingumo, žemos temperatūros) metu (Borges ir kt., 2012).
Iš pradžių atlikome viso genomo oksaloacetato acetilhidrolazės (OAH) baltymų analizę S. sclerotiorum bakterijose, naudodami baltymų-baltymų BLAST įrankį (BLASTp 2.15.0+) (Altschul ir kt., 1997, 2005). Trumpai tariant, panaudojome OAH iš Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; taksidas: 1191702; GenBank registracijos numeris XP_040799428.1; 342 aminorūgštys) ir Penicillium lagena (PlOAH; taksidas: 94218; GenBank registracijos numeris XP_056833920.1; 316 aminorūgščių) kaip užklausos sekas, kad nustatytume homologišką baltymą S. sclerotiorum bakterijoje (taksidas: 5180). BLASTp buvo atliktas naudojant naujausius S. sclerotiorum genomo duomenis, esančius „GenBank“ duomenų bazėje Nacionalinio biotechnologijų informacijos centro (NCBI) svetainėje http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/.
Be to, naudojant didžiausios tikimybės metodą MEGA11 (Tamura ir kt., 2021) ir JTT matricos pagrindu sukurtą modelį (Jones ir kt., 1992), buvo nustatytas numatytas OAH genas iš S. sclerotiorum (SsOAH) ir evoliucinė analizė bei filogenetinis medis iš AfOAH iš A. fijiensis CBS 313.89 bei PlOAH iš P. lagena. Filogenetinis medis buvo sujungtas su visų numatytų OAH genų (SsOAH) iš S. sclerotiorum baltymų sekų daugybine lygiavimo analize ir užklausos seka naudojant apribojimais pagrįstą lygiavimo įrankį (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) (Papadopoulos ir Agarwala, 2007). Be to, geriausiai atitinkančios S. sclerotiorum SsOAH aminorūgščių sekos buvo sulygiuotos su užklausos sekomis (AfOAH ir PlOAH) (Larkin ir kt., 2007) naudojant ClustalW (//www.genome.jp/tools-bin/clustalw), o išsaugoti regionai sulygiavime buvo vizualizuoti naudojant ESPript įrankį (3.0 versija; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php).
Be to, numatyti S. sclerotiorum SsOAH funkciniai reprezentatyvūs domenai ir konservatyvios vietos buvo interaktyviai suskirstytos į skirtingas šeimas naudojant „InterPro“ įrankį (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (Blum ir kt., 2021). Galiausiai, naudojant „Protein Homology/Analogy Recognition Engine“ („Phyre2“ serverio 2.0 versija; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley ir kt., 2015) buvo atliktas numatyto S. sclerotiorum SsOAH trimatis (3D) struktūros modeliavimas ir patvirtinimas naudojant SWISS-MODEL serverį (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini ir kt., 2014). Numatomos trimatės struktūros (PDB formatu) buvo interaktyviai vizualizuotos naudojant UCSF-Chimera paketą (1.15 versija; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/) (Pettersen ir kt., 2004).
Kiekybinė realaus laiko fluorescencinė PGR buvo naudojama oksaloacetato acetilhidrolazės (SsOAH; „GenBank“ registracijos numeris: XM_001590428.1) transkripcijos lygiui Sclerotinia sclerotiorum micelyje nustatyti. Trumpai tariant, S. sclerotiorum buvo inokuliuota į kolbą su PDB ir patalpinta į kratomąjį inkubatorių (modelis: I2400, „New Brunswick Scientific Co.“, Edisonas, Naujasis Džersis, JAV) 25 ± 2 °C temperatūroje 24 val., esant 150 aps./min., ir nuolatinėje tamsoje (24 val.), siekiant paskatinti micelio augimą. Po to ląstelės buvo apdorotos L-ornitinu ir fungicidu Rizolex-T, esant galutinėms IC50 koncentracijoms (atitinkamai maždaug 40 ir 3,2 mg/l), ir po to kultivuojamos dar 24 val. tomis pačiomis sąlygomis. Po inkubacijos kultūros buvo centrifuguojamos 2500 aps./min. greičiu 5 min., o supernatantas (grybelio micelis) buvo surinktas genų ekspresijos analizei. Panašiai, grybelio grybiena buvo surinkta praėjus 0, 24, 48, 72, 96 ir 120 val. po užkrėtimo iš užkrėstų augalų, kurių užkrėstų audinių paviršiuje susiformavo baltasis pelėsis ir medvilninė grybiena. Iš grybelio grybienos buvo išskirta RNR, o tada susintetinta kDNR, kaip aprašyta aukščiau. SsOAH pradmenų sekos išvardytos papildomoje S3 lentelėje. SsActin (GenBank registracijos numeris: XM_001589919.1) buvo naudojamas kaip namų apyvokos genas, o santykinė geno raiška buvo apskaičiuota naudojant 2-ΔΔCT metodą (Livak ir Schmittgen, 2001).
Oksalo rūgšties kiekis bulvių dekstrozės sultinyje (PDB) ir augalų mėginiuose, kuriuose buvo grybelio patogeno Sclerotinia sclerotiorum, buvo nustatytas pagal Xu ir Zhang (2000) metodą su nedideliais pakeitimais. Trumpai tariant, S. sclerotiorum izolatai buvo inokuliuoti į kolbas su PDB ir po to kultivuojami kratomajame inkubatoriuje (modelis I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, JAV) esant 150 aps./min. greičiui, 25 ± 2 °C temperatūroje, 3–5 dienas nuolatinėje tamsoje (24 val.), siekiant paskatinti grybienos augimą. Po inkubacijos grybienos kultūra pirmiausia buvo filtruojama per Whatman #1 filtro popierių, o po to centrifuguojama 2500 aps./min. greičiu 5 minutes, kad būtų pašalintas likęs grybiena. Supernatantas buvo surinktas ir laikomas 4 °C temperatūroje tolesniam kiekybiniam oksalato nustatymui. Augalų mėginiams paruošti maždaug 0,1 g augalinių audinių fragmentų buvo tris kartus ekstrahuota distiliuotu vandeniu (po 2 ml kiekvieną kartą). Tada mėginiai buvo centrifuguoti 2500 aps./min. greičiu 5 minutes, supernatantas buvo sausai filtruojamas per „Whatman Nr. 1“ filtro popierių ir surinktas tolesnei analizei.
Kiekybinei oksalo rūgšties analizei reakcijos mišinys buvo paruoštas stikliniame mėgintuvėlyje su kamščiu tokia tvarka: 0,2 ml mėginio (arba PDB kultūros filtrato, arba oksalo rūgšties standartinio tirpalo), 0,11 ml bromfenolio mėlynojo (BPB, 1 mM; „Fisher Chemical“, Pitsburgas, PA, JAV), 0,198 ml 1 M sieros rūgšties (H2SO4; „Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies“, Kairas, Egiptas) ir 0,176 ml 100 mM kalio dichromato (K2Cr2O7; „TCI Chemicals“, Portlandas, OR, JAV), o tada tirpalas buvo praskiestas iki 4,8 ml distiliuotu vandeniu, intensyviai sumaišytas ir nedelsiant supiltas į 60 °C vandens vonią. Po 10 min. reakcija buvo sustabdyta įpilant 0,5 ml natrio hidroksido tirpalo (NaOH; 0,75 M). Reakcijos mišinio absorbcija (A600) buvo matuojama esant 600 nm bangos ilgiui, naudojant UV-160 spektrofotometrą („Shimadzu Corporation“, Japonija). Kultūros filtratų ir augalų mėginių kiekybiniam nustatymui kontroliniai tirpalai buvo naudojami PDB ir distiliuotas vanduo. Oksalo rūgšties koncentracijos kultūros filtratuose, išreikštos oksalo rūgšties mikrogramais PDB terpės mililitre (μg.mL−1), ir lapų ekstraktuose, išreikštos oksalo rūgšties mikrogramais šviežios masės grame (μg.g−1 FW), buvo nustatytos naudojant oksalo rūgšties kalibravimo kreivę („Thermo Fisher Scientific Chemicals“, Waltham, MA, JAV).
Viso tyrimo metu visi eksperimentai buvo suplanuoti taikant visiškai atsitiktinių imčių dizainą (CRD), naudojant šešis biologinius pakartojimus kiekvienam apdorojimui ir penkis vazonus kiekvienam biologiniam pakartojimui (po du augalus vazonėlyje), jei nenurodyta kitaip. Biologiniai pakartojimai buvo analizuojami du kartus (du techniniai pakartojimai). Techniniai pakartojimai buvo naudojami to paties eksperimento pakartojamumui patikrinti, tačiau nebuvo naudojami statistinėje analizėje, siekiant išvengti klaidingų pakartojimų. Duomenys buvo statistiškai analizuojami naudojant dispersinę analizę (ANOVA), po kurios buvo atliktas Tukey-Kramerio sąžiningai reikšmingo skirtumo (HSD) testas (p ≤ 0,05). In vitro eksperimentams IC50 ir IC99 vertės buvo apskaičiuotos naudojant probito modelį ir 95 % patikimumo intervalai.
Iš skirtingų sojų pupelių laukų El Ghabiya gubernijoje, Egipte, buvo surinkti keturi izoliatai. PDA terpėje visi izoliatai išaugino kreminės baltos spalvos micelį, kuris greitai tapo vatos baltumo (1A pav.), o vėliau, skleročių stadijoje, įgavo smėlio arba rudos spalvos atspalvį. Skleročiai paprastai yra tankūs, juodi, sferinės arba netaisyklingos formos, 5,2–7,7 mm ilgio ir 3,4–5,3 mm skersmens (1B pav.). Nors keturi izoliatai po 10–12 dienų inkubacijos 25 ± 2 °C temperatūroje kultūros terpės krašte išsivystė ribinis skleročių raštas (1A pav.), skleročių skaičius vienoje lėkštelėje tarp jų reikšmingai skyrėsi (P < 0,001), o 3 izoliatas turėjo didžiausią skleročių skaičių (32,33 ± 1,53 skleročių vienoje lėkštelėje; 1C pav.). Panašiai, 3-iasis izoliatas PDB išskyrė daugiau oksalo rūgšties nei kiti izoliatai (3,33 ± 0,49 μg.mL−1; 1D pav.). 3-iasis izoliatas pasižymėjo tipiškomis fitopatogeninio grybelio Sclerotinia sclerotiorum morfologinėmis ir mikroskopinėmis savybėmis. Pavyzdžiui, ant PDA 3-iojo izoliato kolonijos sparčiai augo, buvo kreminės baltos spalvos (1A pav.), atvirkštinės smėlio arba šviesiai lašišos gelsvai rudos spalvos ir joms prireikė 6–7 dienų 25 ± 2 °C temperatūroje, kad visiškai padengtų 9 cm skersmens lėkštelės paviršių. Remiantis minėtomis morfologinėmis ir mikroskopinėmis savybėmis, 3-iasis izoliatas buvo identifikuotas kaip Sclerotinia sclerotiorum.
1 pav. S. sclerotiorum izoliatų, išskirtų iš paprastųjų ankštinių augalų, charakteristikos ir patogeniškumas. (A) Keturių S. sclerotiorum izoliatų micelio augimas PDA terpėje, (B) keturių S. sclerotiorum izoliatų skleročiai, (C) skleročių skaičius (vienoje lėkštelėje), (D) oksalo rūgšties sekrecija PDB terpėje (μg.mL−1) ir (E) keturių S. sclerotiorum izoliatų ligos sunkumas (%) ant jautrių komercinių ankštinių augalų veislės Giza 3 šiltnamio sąlygomis. Vertės yra penkių biologinių pakartojimų vidurkis ± SD (n = 5). Skirtingos raidės rodo statistiškai reikšmingus skirtumus tarp apdorojimo būdų (p < 0,05). (F–H) Tipiniai baltojo pelėsio simptomai pasirodė atitinkamai ant antžeminių stiebų ir žiedynų, praėjus 10 dienų po inokuliacijos 3 izoliatu (dpi). (I) S. sclerotiorum izoliato Nr. 3 vidinio transkribuoto tarpiklio (ITS) regiono evoliucinė analizė atlikta naudojant didžiausios tikimybės metodą ir palyginta su 20 etaloninių izoliatų / padermių, gautų iš Nacionalinio biotechnologijų informacijos centro (NCBI) duomenų bazės (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Skaičiai virš klasterizavimo linijų rodo regiono aprėptį (%), o skaičiai po klasterizavimo linijomis rodo šakos ilgį.
Be to, patogeniškumui patvirtinti keturi gauti S. sclerotiorum izolatai buvo panaudoti jautrios komercinės pupų veislės Giza 3 inokuliacijai šiltnamio sąlygomis, kas atitinka Kocho postulatus (1E pav.). Nors visi gauti grybelių izolatai buvo patogeniški ir galėjo užkrėsti žaliąsias pupeles (v. Giza 3), sukeldami tipinius baltojo pelėsio simptomus visose antžeminėse dalyse (1F pav.), ypač ant stiebų (1G pav.) ir ankščių (1H pav.) praėjus 10 dienų po inokuliacijos (dpi), 3 izoliatas buvo agresyviausias dviejų nepriklausomų eksperimentų metu. 3 izoliatas pasižymėjo didžiausiu ligos sunkumu (%) pupų augaluose (atitinkamai 24,0 ± 4,0, 58,0 ± 2,0 ir 76,7 ± 3,1 praėjus atitinkamai 7, 14 ir 21 dienai po užkrėtimo; 1F pav.).
Invazyviausio S. sclerotiorum izoliato Nr. 3 identifikavimas buvo papildomai patvirtintas remiantis vidinės transkribuotos tarpinės (ITS) sekoskaita (1I pav.). Filogenetinė analizė tarp 3 izoliato ir 20 etaloninių izoliatų/štamų parodė didelį jų panašumą (>99 %). Verta paminėti, kad S. sclerotiorum izoliatas Nr. 3 (533 bp) yra labai panašus į amerikietišką S. sclerotiorum izoliatą LPM36, išskirtą iš sausų žirnių sėklų („GenBank“ registracijos numeris MK896659.1; 540 bp), ir kinišką S. sclerotiorum izoliatą YKY211 („GenBank“ registracijos numeris OR206374.1; 548 bp), kuris sukelia violetinės (Matthiola incana) stiebų puvinį, kurie visi yra sugrupuoti atskirai dendrogramos viršuje (1I pav.). Naujoji seka buvo įkelta į NCBI duomenų bazę ir pavadinta „Sclerotinia sclerotiorum – izoliatas YN-25“ (GenBank prieigos numeris PV202792). Matyti, kad 3 izoliatas yra invazyviausias izoliatas; todėl šis izoliatas buvo pasirinktas tyrimui visuose tolesniuose eksperimentuose.
Diamino L-ornitino (Sigma-Aldrich, Darmštatas, Vokietija) antibakterinis aktyvumas, esant skirtingoms koncentracijoms (12,5, 25, 50, 75, 100 ir 125 mg/l), prieš S. sclerotiorum 3 izoliatą buvo tirtas in vitro. Pažymėtina, kad L-ornitinas pasižymėjo antibakteriniu poveikiu ir palaipsniui slopino S. sclerotiorum hifų radialinį augimą priklausomai nuo dozės (2A, B pav.). Esant didžiausiai išbandytai koncentracijai (125 mg/l), L-ornitinas pademonstravo didžiausią micelio augimo slopinimo greitį (99,62 ± 0,27 %; 2B pav.), kuris buvo lygiavertis komercinio fungicido Rizolex-T (slopinimo greitis 99,45 ± 0,39 %; 2C pav.) didžiausiai išbandytai koncentracijai (10 mg/l), o tai rodo panašų veiksmingumą.
2 pav. L-ornitino antibakterinis aktyvumas prieš Sclerotinia sclerotiorum in vitro. (A) Skirtingų L-ornitino koncentracijų antibakterinio aktyvumo prieš S. sclerotiorum palyginimas su komerciniu fungicidu Rizolex-T (10 mg/l). (B, C) S. sclerotiorum micelio augimo slopinimo greitis (%) po apdorojimo skirtingomis L-ornitino koncentracijomis (12,5, 25, 50, 75, 100 ir 125 mg/l) arba Rizolex-T (2, 4, 6, 8 ir 10 mg/l). Vertės yra penkių biologinių pakartojimų vidurkis ± SD (n = 5). Skirtingos raidės žymi statistinius skirtumus tarp apdorojimo būdų (p < 0,05). (D, E) L-ornitino ir komercinio fungicido Rizolex-T Probit modelio regresinė analizė. Probito modelio regresijos linija pavaizduota kaip ištisinė mėlyna linija, o pasikliautinasis intervalas (95 %) – kaip punktyrinė raudona linija.
Be to, buvo atlikta probito regresinė analizė, o atitinkami grafikai pateikti 1 lentelėje ir 2D, E paveiksluose. Trumpai tariant, priimtina L-ornitino nuolydžio vertė (y = 2,92x − 4,67) ir susijusios reikšmingos statistikos vertės (Cox & Snell R2 = 0,3709, Nagelkerke R2 = 0,4998 ir p < 0,0001; 2D paveikslas) parodė sustiprėjusį priešgrybelinį aktyvumą prieš S. sclerotiorum, palyginti su komerciniu fungicidu Rizolex-T (y = 1,96x − 0,99, Cox & Snell R2 = 0,1242, Nagelkerke R2 = 0,1708 ir p < 0,0001) (1 lentelė).
1 lentelė. L-ornitino ir komercinio fungicido „Rizolex-T“ pusinės maksimalios slopinamosios koncentracijos (IC50) ir IC99 (mg/l) vertės prieš S. sclerotiorum.
Apskritai L-ornitinas (250 mg/l) reikšmingai sumažino baltojo pelėsio vystymąsi ir sunkumą ant apdorotų paprastųjų pupelių augalų, palyginti su neapdorotais S. sclerotiorum užkrėstais augalais (kontrolinė grupė; 3A pav.). Trumpai tariant, nors neapdorotų užkrėstų kontrolinių augalų ligos sunkumas palaipsniui didėjo (52,67 ± 1,53, 83,21 ± 2,61 ir 92,33 ± 3,06 %), L-ornitinas reikšmingai sumažino ligos sunkumą (%) viso eksperimento metu (8,97 ± 0,15, 18,00 ± 1,00 ir 26,36 ± 3,07) atitinkamai 7, 14 ir 21 dieną po apdorojimo (3A pav.). Panašiai, kai S. sclerotiorum užkrėsti pupelių augalai buvo apdoroti 250 mg/l L-ornitino, plotas po ligos progresavimo kreive (AUDPC) sumažėjo nuo 1274,33 ± 33,13 neapdorotoje kontrolinėje grupėje iki 281,03 ± 7,95, tai buvo šiek tiek mažiau nei teigiamos kontrolės 50 mg/l Rizolex-T fungicido atveju (183,61 ± 7,71; 3B pav.). Ta pati tendencija pastebėta ir antrajame eksperimente.
3 pav. Egzogeninio L-ornitino panaudojimo poveikis paprastųjų pupų baltojo puvinio, kurį sukelia Sclerotinia sclerotiorum, vystymuisi šiltnamio sąlygomis. (A) Paprastųjų pupų baltojo pelėsio ligos progresavimo kreivė po apdorojimo 250 mg/l L-ornitinu. (B) Paprastųjų pupų baltojo pelėsio plotas po ligos progresavimo kreive (AUDPC) po apdorojimo L-ornitinu. Vertės yra penkių biologinių pakartojimų vidurkis ± SD (n = 5). Skirtingos raidės žymi statistiškai reikšmingus skirtumus tarp apdorojimo būdų (p < 0,05).
Egzogeninis 250 mg/l L-ornitino panaudojimas palaipsniui didino augalo aukštį (4A pav.), šakų skaičių vienam augalui (4B pav.) ir lapų skaičių vienam augalui (4C pav.) po 42 dienų. Nors komercinis fungicidas Rizolex-T (50 mg/l) turėjo didžiausią poveikį visiems tirtiems mitybos parametrams, egzogeninis 250 mg/l L-ornitino panaudojimas turėjo antrą pagal dydį poveikį, palyginti su neapdorotais kontroliniais mėginiais (4A–C pav.). Kita vertus, L-ornitino apdorojimas neturėjo reikšmingos įtakos fotosintetinių pigmentų chlorofilo a (4D pav.) ir chlorofilo b (4E pav.) kiekiui, tačiau šiek tiek padidino bendrą karotinoidų kiekį (0,56 ± 0,03 mg/g fr m/g), palyginti su neigiama kontrole (0,44 ± 0,02 mg/g fr m/g) ir teigiama kontrole (0,46 ± 0,02 mg/g fr m/g; 4F pav.). Apskritai šie rezultatai rodo, kad L-ornitinas nėra fitotoksiškas apdorotiems ankštiniams augalams ir netgi gali skatinti jų augimą.
4 pav. Egzogeninio L-ornitino panaudojimo poveikis Sclerotinia sclerotiorum užkrėstų pupelių lapų augimo savybėms ir fotosintezės pigmentams šiltnamio sąlygomis. (A) Augalo aukštis (cm), (B) Šakų skaičius viename augale, (C) Lapų skaičius viename augale, (D) Chlorofilo a kiekis (mg g-1 fr wt), (E) Chlorofilo b kiekis (mg g-1 fr wt), (F) Bendras karotinoidų kiekis (mg g-1 fr wt). Vertės yra penkių biologinių pakartojimų vidurkis ± SD (n = 5). Skirtingos raidės rodo statistiškai reikšmingus skirtumus tarp apdorojimo būdų (p < 0,05).
Reaktyviųjų deguonies formų (ROS; išreikštų kaip vandenilio peroksidas [H2O2]) ir laisvųjų radikalų (išreikštų kaip superoksido anijonai [O2•−]) histocheminė lokalizacija in situ parodė, kad egzogeninis L-ornitino (250 mg/l) panaudojimas reikšmingai sumažino H2O2 (96,05 ± 5,33 nmol.g−1 FW; 5A pav.) ir O2•− (32,69 ± 8,56 nmol.g−1 FW; 5B pav.) kaupimąsi, palyginti su neapdorotų užkrėstų augalų (atitinkamai 173,31 ± 12,06 ir 149,35 ± 7,94 nmol.g−1 FW) ir augalų, apdorotų 50 mg/l komercinio fungicido Rizolex-T (atitinkamai 170,12 ± 9,50 ir 157,00 ± 7,81 nmol.g−1 fr wt) kaupimu po 72 val. Didelis H2O2 ir O2•− kiekis susikaupė veikiant HPT (5A, B pav.). Panašiai, TCA pagrindu atliktas malondialdehido (MDA) tyrimas parodė, kad S. sclerotiorum užkrėstų pupelių augalų lapuose susikaupė didesnis MDA kiekis (113,48 ± 10,02 nmol.g fr wt) (5C pav.). Tačiau egzogeninis L-ornitino panaudojimas reikšmingai sumažino lipidų peroksidaciją, ką rodo MDA kiekio sumažėjimas apdorotuose augaluose (33,08 ± 4,00 nmol.g fr wt).
5 pav. Egzogeninio L-ornitino panaudojimo poveikis pagrindiniams oksidacinio streso žymenims ir nefermentiniams antioksidaciniams gynybos mechanizmams pupelių lapuose, užkrėstuose S. sclerotiorum, praėjus 72 val. po užkrėtimo šiltnamio sąlygomis. (A) Vandenilio peroksidas (H2O2; nmol g−1 FW) po 72 hpt, (B) superoksido anijonas (O2•−; nmol g−1 FW) po 72 hpt, (C) malondialdehidas (MDA; nmol g−1 FW) po 72 hpt, (D) bendras tirpių fenolių kiekis (mg GAE g−1 FW) po 72 hpt, (E) bendras tirpių flavonoidų kiekis (mg RE g−1 FW) po 72 hpt, (F) bendras laisvųjų aminorūgščių kiekis (mg g−1 FW) po 72 hpt ir (G) prolino kiekis (mg g−1 FW) po 72 hpt. Vertės yra 5 biologinių pakartojimų vidurkis ± standartinis nuokrypis (vidurkis ± SD) (n = 5). Skirtingos raidės rodo statistiškai reikšmingus skirtumus tarp gydymo būdų (p < 0,05).