Dėkojame, kad apsilankėte Nature.com. Jūsų naudojama naršyklės versija turi ribotą CSS palaikymą. Kad užtikrintumėte geriausią patirtį, rekomenduojame naudoti atnaujintą naršyklę (arba išjungti suderinamumo režimą „Internet Explorer“). Tuo tarpu, siekdami užtikrinti nuolatinį palaikymą, svetainę rodysime be stilių ir „JavaScript“.
Didelės insulino nanodalelės (ND) su dideliu užpildu buvo naudojamos skirtingose ​​dozavimo formose. Šio darbo tikslas – įvertinti šaldymo ir purškimo džiovinimo procesų poveikį insulinu užpildytų chitozano nanodalelių struktūrai, naudojant arba nenaudojant manitolio kaip krioprotektanto. Taip pat įvertinome šių nanodalelių kokybę jas ištirpindami. Prieš dehidrataciją chitozano/natrio tripolifosfato/insulino skersiniais ryšiais susietų nanodalelių dalelių dydis buvo optimizuotas iki 318 nm, PDI buvo 0,18, kapsuliavimo efektyvumas – 99,4 %, o užpildas – 25,01 %. Po atkūrimo visos nanodalelės, išskyrus tas, kurios buvo pagamintos šaldymo ir džiovinimo metodu nenaudojant manitolio, išlaikė savo sferinę dalelių struktūrą. Palyginti su manitolio turinčiomis nanodalelėmis, dehidratuotomis purškiant, manitolio neturinčios purškimo džiovintos nanodalelės taip pat pasižymėjo mažiausiu vidutiniu dalelių dydžiu (376 nm) ir didžiausiu užpildu (25,02 %), o džiovinant kapsuliavimo greitis (98,7 %) ir PDI (0,20) buvo panašūs. arba šaldymo džiovinimo metodais. Purškiant džiovinant be manitolio, džiovintos nanodalelės taip pat lėmė greičiausiai išsiskiriantį insuliną ir didžiausią ląstelių įsisavinimo efektyvumą. Šis darbas rodo, kad purškiant džiovinant galima dehidratuoti insulino nanodaleles be krioprotektantų, palyginti su įprastais šaldymo džiovinimo metodais, todėl padidėja įkrovimo talpa, sumažėja priedų poreikis ir eksploatavimo išlaidos.
Nuo pat atradimo 1922 m.1,2,3 insulinas ir jo farmaciniai preparatai išgelbėjo 1 tipo diabetu (T1DM) ir 2 tipo diabetu (T1DM) sergančių pacientų gyvybes. Tačiau dėl savo savybių, kaip didelės molekulinės masės baltymas, insulinas lengvai agreguojamas, skaidomas proteolitinių fermentų ir pašalinamas pirmojo prasiskverbimo būdu. Žmonėms, kuriems diagnozuotas 1 tipo diabetas, insulino injekcijos reikalingos visą likusį gyvenimą. Daugeliui pacientų, kuriems iš pradžių diagnozuotas 2 tipo diabetas, taip pat reikalingos ilgalaikės insulino injekcijos. Kasdienės insulino injekcijos yra rimtas kasdienio skausmo ir diskomforto šaltinis šiems asmenims, turintis neigiamos įtakos psichinei sveikatai. Todėl plačiai tiriamos kitos insulino vartojimo formos, sukeliančios mažiau diskomforto, pavyzdžiui, geriamasis insulinas,5 nes jos gali atkurti maždaug 5 milijardų žmonių, sergančių diabetu, gyvenimo kokybę visame pasaulyje.
Nanodalelių technologija padarė didelę pažangą bandant vartoti geriamąjį insuliną4,6,7. Tokia technologija veiksmingai kapsuliuoja ir apsaugo insuliną nuo degradacijos, kad būtų galima jį tiksliai tiekti į konkrečias kūno vietas. Tačiau nanodalelių formulių naudojimas turi keletą apribojimų, daugiausia dėl dalelių suspensijų stabilumo problemų. Laikymo metu gali atsirasti tam tikra agregacija, dėl kurios sumažėja insulinu prisotintų nanodalelių biologinis prieinamumas8. Be to, siekiant užtikrinti insulino nanodalelių (NP) stabilumą, taip pat reikia atsižvelgti į nanodalelių ir insulino polimerinės matricos cheminį stabilumą. Šiuo metu šaldymo-džiovinimo technologija yra auksinis standartas kuriant stabilias NP, kartu užkertant kelią nepageidaujamiems pokyčiams laikymo metu9.
Tačiau šaldymo džiovinimui reikia pridėti krioprotektantų, kad NP sferinė struktūra nebūtų paveikta ledo kristalų mechaninio įtempimo. Tai žymiai sumažina insulino nanodalelių kiekį po liofilizacijos, nes krioprotektantas užima didžiąją dalį svorio santykio. Todėl pagamintos insulino NP dažnai netinka sausų miltelių, tokių kaip geriamosios tabletės ir geriamosios plėvelės, gamybai, nes reikia didelio kiekio sausų nanodalelių, kad būtų pasiektas insulino terapinis langas.
Purškiamasis džiovinimas yra gerai žinomas ir nebrangus pramoninio masto sausų miltelių gamybos iš skystųjų fazių procesas farmacijos pramonėje10,11. Dalelių formavimo proceso kontrolė leidžia tinkamai kapsuliuoti kelis bioaktyvius junginius12, 13. Be to, tai tapo efektyvia technika kapsuliuotiems baltymams, skirtiems vartoti per burną, paruošti. Purškiamo džiovinimo metu vanduo labai greitai išgaruoja, todėl dalelių šerdies temperatūra išlieka žema11,14, todėl jį galima naudoti kapsuliuojant karščiui jautrius komponentus. Prieš purškiamą džiovinimą, dangos medžiaga turi būti kruopščiai homogenizuota tirpalu, kuriame yra kapsuliuoti ingredientai11,14. Skirtingai nuo šaldymo, homogenizavimas prieš kapsuliavimą purškiamo džiovinimo metu pagerina kapsuliavimo efektyvumą dehidratacijos metu. Kadangi purškiamo džiovinimo kapsuliavimo procesui nereikia krioprotekcijos, purškiamas džiovinimas gali būti naudojamas džiovintoms NP su dideliu užpildo kiekiui gauti.
Šiame tyrime aprašomas insulinu prisotintų nanodalelių gamyba, susiejant chitozaną ir natrio tripolifosfatą jonų gelio metodu. Jonų geliacija yra paruošimo metodas, leidžiantis gaminti nanodaleles elektrostatinės sąveikos tarp dviejų ar daugiau joninių dalelių metu tam tikromis sąlygomis. Optimizuotų chitozano/natrio tripolifosfato/insulino susietų nanodalelių dehidratacijai buvo naudojami tiek šaldymo, tiek purškimo džiovinimo metodai. Po dehidratacijos jų morfologija buvo analizuojama SEM. Jų rekombinacijos gebėjimas buvo įvertintas matuojant jų dydžio pasiskirstymą, paviršiaus krūvį, PDI, kapsuliavimo efektyvumą ir įkrovos kiekį. Skirtingais dehidratacijos metodais gautų pakartotinai ištirpintų nanodalelių kokybė taip pat buvo įvertinta lyginant jų insulino apsaugą, atpalaidavimo elgseną ir ląstelių įsisavinimo efektyvumą.
Mišraus tirpalo pH ir chitozano bei insulino santykis yra du pagrindiniai veiksniai, turintys įtakos galutinių NP dalelių dydžiui ir kapsuliavimo efektyvumui (EE), nes jie tiesiogiai veikia jonotropinį želatinizacijos procesą. Nustatyta, kad mišraus tirpalo pH yra labai susijęs su dalelių dydžiu ir kapsuliavimo efektyvumu (1a pav.). Kaip parodyta 1a pav., pH padidėjus nuo 4,0 iki 6,0, vidutinis dalelių dydis (nm) sumažėjo, o EE reikšmingai padidėjo, o pH padidėjus iki 6,5, vidutinis dalelių dydis pradėjo didėti, o EE nepakito. Didėjant chitozano ir insulino santykiui, didėja ir vidutinis dalelių dydis. Be to, EE pokyčių nepastebėta, kai nanodalelės buvo paruoštos esant chitozano ir insulino masės santykiui, didesniam nei 2,5:1 (m/m) (1b pav.). Todėl šiame tyrime optimalios paruošimo sąlygos (pH 6,0, chitozano ir insulino masės santykis 2,5:1) buvo naudojamos insulino prisotintoms dalelėms paruošti. nanodalelės tolesniems tyrimams. Esant tokioms paruošimo sąlygoms, vidutinis insulino nanodalelių dydis buvo optimizuotas iki 318 nm (1c pav.), PDI buvo 0,18, įterpimo efektyvumas buvo 99,4 %, dzeta potencialas buvo 9,8 mV, o insulino kiekis buvo 25,01 % (m/m). Remiantis transmisijinės elektroninės mikroskopijos (TEM) rezultatais, optimizuotos nanodalelės buvo maždaug sferinės ir atskiros, santykinai vienodo dydžio (1d pav.).
Insulino nanodalelių parametrų optimizavimas: (a) pH įtaka insulino nanodalelių (paruoštų esant 5:1 chitozano ir insulino masės santykiui) vidutiniam skersmeniui ir kapsuliavimo efektyvumui (EE); (b) chitozanas ir insulino masės santykio įtaka insulino nanodalelių (paruoštų esant 6 pH) vidutiniam skersmeniui ir kapsuliavimo efektyvumui (EE); (c) optimizuotų insulino nanodalelių dydžio pasiskirstymas; (d) optimizuotų insulino nanodalelių TEM mikrografija.
Gerai žinoma, kad chitozanas yra silpnas polielektrolitas, kurio pKa yra 6,5. Rūgštinėje terpėje jis yra teigiamai įkrautas, nes jo pagrindinė amino grupė yra protonuota vandenilio jonais15. Todėl jis dažnai naudojamas kaip nešiklis neigiamai įkrautoms makromolekulėms kapsuliuoti. Šiame tyrime chitozanas buvo naudojamas insulinui, kurio izoelektrinis taškas yra 5,3, kapsuliuoti. Kadangi chitozanas naudojamas kaip dangos medžiaga, didėjant jo daliai, atitinkamai didėja ir išorinio nanodalelių sluoksnio storis, todėl padidėja vidutinis dalelių dydis. Be to, didesnis chitozano kiekis gali kapsuliuoti daugiau insulino. Mūsų atveju EE buvo didžiausias, kai chitozano ir insulino santykis pasiekė 2,5:1, o reikšmingų EE pokyčių nebuvo, kai santykis toliau didėjo.
Be chitozano ir insulino santykio, pH taip pat atliko svarbų vaidmenį ruošiant nanodaleles. Gan ir kt. 17 tyrė pH poveikį chitozano nanodalelių dalelių dydžiui. Jie nustatė nuolatinį dalelių dydžio mažėjimą, kol pH pasiekė 6,0, o esant pH > 6,0 buvo pastebėtas reikšmingas dalelių dydžio padidėjimas, o tai atitinka mūsų stebėjimus. Šis reiškinys atsiranda dėl to, kad didėjant pH, insulino molekulė įgyja neigiamą paviršiaus krūvį, todėl sudaromos palankesnės sąlygos elektrostatinei sąveikai su chitozano / natrio tripolifosfato (TPP) kompleksu, dėl ko dalelės tampa mažos, o EE – didelės. Tačiau, kai pH buvo pakoreguotas iki 6,5, chitozano amino grupės buvo deprotonuotos, dėl ko chitozanas susilankstė. Taigi, esant aukštam pH, amino jonai mažiau veikiami TPP ir insulino, todėl sumažėja skersinis sujungimas, padidėja galutinis vidutinis dalelių dydis ir sumažėja EE.
Liofilizuotų ir purškiant džiovintų nanodalelių morfologinių savybių analizė gali padėti pasirinkti geresnius dehidratacijos ir miltelių formavimo metodus. Pageidaujamas metodas turėtų užtikrinti vaisto stabilumą, vienodą dalelių formą, didelį vaisto kiekį ir gerą tirpumą pradiniame tirpale. Šiame tyrime, siekiant geriau palyginti šiuos du metodus, dehidratacijos metu buvo naudojamos insulino nanodalelės su 1 % manitolio arba be jo. Manitolis naudojamas kaip užpildas arba krioprotektantas įvairiose sausų miltelių formuluotėse, skirtose šalčiui ir purškimui džiovinti. Liofilizuotoms insulino nanodalelėms be manitolio, kaip parodyta 2a paveiksle, skenuojančios elektroninės mikroskopijos (SEM) metu buvo pastebėta labai porėta miltelių struktūra su dideliais, netaisyklingais ir šiurkščiais paviršiais. Po dehidratacijos milteliuose aptikta nedaug atskirų dalelių (2e pav.). Šie rezultatai parodė, kad dauguma nanodalelių suskilo šalčiui džiovinant be jokio krioprotektanto. Liofilizuotoms ir purškiant džiovintoms insulino nanodalelėms, turinčioms 1 % manitolio, buvo pastebėtos sferinės nanodalelės su lygiais paviršiais (2b, d, f, h pav.). Purškiant džiovintos insulino nanodalelės be manitolio išliko sferinės, bet paviršiuje raukšlėjosi. (2c pav.). Sferiniai ir raukšlėti paviršiai išsamiau aptariami toliau pateiktuose atpalaidavimo elgsenos ir ląstelių įsisavinimo bandymuose. Remiantis džiovintų NP matoma išvaizda, tiek purškiant džiovintos NP be manitolio, tiek šaldant džiovintos ir purškiant džiovintos NP su manitoliu davė smulkius NP miltelius (2f, g, h pav.). Kuo didesnis paviršiaus plotas tarp dalelių paviršių, tuo didesnis tirpumas ir atitinkamai didesnis atpalaidavimo greitis.
Įvairių dehidratuotų insulino NP morfologija: (a) liofilizuotų insulino NP be manitolio SEM vaizdas; (b) liofilizuotų insulino NP su manitoliu SEM vaizdas; (c) purškiant džiovintos insulino NP be manitolio SEM vaizdas; (d) purškiant džiovintų insulino NP su manitoliu SEM vaizdas; (e) liofilizuotų insulino NP miltelių be manitolio vaizdas; (f) liofilizuotų insulino NP su manitoliu vaizdas; (g) purškiant džiovintų insulino NP miltelių be manitolio vaizdas; (h) purškiant džiovintų insulino NP miltelių su manitoliu vaizdas.
Šaltinio džiovinimo metu manitolis veikia kaip krioprotektantas, išlaikantis NP amorfinėje formoje ir apsaugantis nuo ledo kristalų daromos žalos19. Priešingai, purškiamojo džiovinimo metu šaldymo etapo nėra. Todėl šiame metode manitolis nereikalingas. Iš tiesų, purškiamojo džiovinimo būdu gautos NP be manitolio davė smulkesnes NP, kaip aprašyta anksčiau. Tačiau manitolis vis tiek gali veikti kaip užpildas purškiamojo džiovinimo procese, suteikdamas NP sferiškesnę struktūrą20 (2d pav.), o tai padeda pasiekti vienodą tokių kapsuliuotų NP atpalaidavimo elgseną. Be to, akivaizdu, kad tiek šaldytu būdu, tiek purškiamojo džiovinimo būdu gautose insulino NP, kuriose yra manitolio, galima aptikti didelių dalelių (2b, d pav.), o tai gali būti dėl manitolio kaupimosi dalelių šerdyje kartu su kapsuliuotu insulinu. Chitozano sluoksnis. Verta paminėti, kad šiame tyrime, siekiant užtikrinti, kad po dehidratacijos sferinė struktūra išliktų nepakitusi, manitolio ir chitozano santykis palaikomas 5:1, kad didelis užpildo kiekis taip pat galėtų padidinti džiovintų NP dalelių dydį.
Furjė transformacijos infraraudonųjų spindulių susilpninto visiško atspindžio (FTIR-ATR) spektroskopija apibūdino fizinį laisvo insulino, chitozano, chitozano, TPP ir insulino mišinį. Visos dehidratuotos NP buvo apibūdintos naudojant FTIR-ATR spektroskopiją. Pažymėtina, kad kapsulėse, liofilizuotose su manitoliu, ir purškiant džiovintose NP su manitoliu ir be jo, buvo pastebėtas 1641, 1543 ir 1412 cm⁻¹ juostų intensyvumas (3 pav.). Kaip anksčiau buvo pranešta, šis stiprumo padidėjimas buvo susijęs su kryžminiu sujungimu tarp chitozano, TPP ir insulino. Chitozano ir insulino sąveikos tyrimas parodė, kad insulinu prisotintų chitozano nanodalelių FTIR spektruose chitozano juosta persidengia su insulino juosta, padidindama karbonilo (1641 cm⁻¹) ir amino (1543 cm⁻¹) juostas. TPP tripolifosfato grupės yra sujungtos su amonio grupėmis chitozane, sudarydamos 1412 cm⁻¹ juostą.
Laisvojo insulino, chitozano, chitozano/TPP/insulino fizikinių mišinių ir skirtingais metodais dehidratuotų nanodalelių FTIR-ATR spektrai.
Be to, šie rezultatai atitinka SEM rezultatus, kurie parodė, kad kapsuluotos NP išliko nepažeistos tiek purškiant, tiek šaldant džiovinant manitoliu, tačiau be manitolio tik purškiant džiovinant susidarė kapsuluotos dalelės. Priešingai, šaldant džiovintų NP be manitolio FTIR-ATR spektriniai rezultatai buvo labai panašūs į fizinio chitozano, TPP ir insulino mišinio rezultatus. Šis rezultatas rodo, kad šaldant džiovintose NP be manitolio kryžminių jungčių tarp chitozano, TPP ir insulino nebėra. Šaldant džiovinant be krioprotektanto, NP struktūra buvo sunaikinta, ką galima pamatyti SEM rezultatuose (2a pav.). Remiantis dehidratuotų insulino NP morfologija ir FTIR rezultatais, rekonstrukcijos eksperimentams buvo naudojamos tik liofilizuotos, purškiant džiovintos ir manitolio neturinčios NP, o manitolio neturinčios NP – dėl manitolio neturinčių NP skilimo dehidratacijos metu. Aptarkite.
Dehidratacija naudojama ilgalaikiam laikymui ir perdirbimui į kitas formuluotes. Sausų nanodalelių (NP) gebėjimas atsistatyti po laikymo yra labai svarbus jų naudojimui skirtingose ​​formuluotėse, tokiose kaip tabletės ir plėvelės. Pastebėjome, kad be manitolio purškiant džiovintų insulino nanodalelių vidutinis dalelių dydis po atkūrimo padidėjo tik nežymiai. Kita vertus, purškiant džiovintų ir liofilizuotų insulino nanodalelių su manitoliu dalelių dydis reikšmingai padidėjo (1 lentelė). Šiame tyrime po visų NP rekombinacijos PDI ir EE reikšmingai nepakito (p > 0,05) (1 lentelė). Šis rezultatas rodo, kad dauguma dalelių po pakartotinio ištirpinimo išliko nepakitusios. Tačiau pridėjus manitolio, liofilizuotų ir purškiant džiovintų manitolio nanodalelių insulino kiekis labai sumažėjo (1 lentelė). Priešingai, purškiant džiovintų NP be manitolio insulino kiekis išliko toks pat kaip ir anksčiau (1 lentelė).
Gerai žinoma, kad nanodalelių kiekis yra labai svarbus vaistams tiekti. Mažo kiekio nanodalelėms (NP) reikia labai didelio kiekio medžiagos, kad būtų pasiektas terapinis slenkstis. Tačiau didelė tokių didelių NP koncentracijų klampa sukelia nepatogumų ir sunkumų vartojant per burną ir injekcines formas [22]. Be to, insulino NP taip pat gali būti naudojamos tabletėms ir klampioms bioplėvelėms gaminti [23, 24], o tam reikia naudoti didelį NP kiekį esant mažam kiekiui, todėl gaunamos didelės tabletės ir storos bioplėvelės, kurios netinka vartoti per burną. Todėl labai pageidaujamos dehidratuotos NP su dideliu insulino kiekiu. Mūsų rezultatai rodo, kad didelis manitolio neturinčių purškiamųjų džiovintų NP insulino kiekis gali suteikti daug patrauklių privalumų šiems alternatyviems tiekimo būdams.
Visos dehidratuotos NP buvo laikomos šaldytuve tris mėnesius. SEM rezultatai parodė, kad visų dehidratuotų NP morfologija per tris mėnesius reikšmingai nepakito (4 pav.). Atkūrus vandenyje, visų NP per tris mėnesius nuo laikymo laikotarpio šiek tiek sumažėjo EE ir išsiskyrė maždaug nedidelis kiekis (~5 %) insulino (2 lentelė). Tačiau vidutinis visų nanodalelių dydis padidėjo. Purškiant džiovintų NP be manitolio dalelių dydis padidėjo iki 525 nm, o purškiant džiovintų ir liofilizuotų NP su manitoliu – atitinkamai iki 872 ir 921 nm (2 lentelė).
Tris mėnesius laikytų skirtingų dehidratuotų insulino nanodalelių morfologija: (a) liofilizuotų insulino nanodalelių su manitoliu SEM vaizdas; (b) purškiant džiovintų insulino nanodalelių be manitolio SEM vaizdas; (c) purškiant džiovintų insulino nanodalelių be manitolio SEM vaizdai.
Be to, manitoliu purškiant ir liofilizuojant iš naujo išdžiovintose insulino nanodalelėse (S2 pav.) buvo pastebėta nuosėdų. Tai gali būti dėl to, kad didelės dalelės netinkamai išsisklaidė vandenyje. Visi aukščiau pateikti rezultatai rodo, kad purškiamojo džiovinimo technika gali apsaugoti insulino nanodaleles nuo dehidratacijos ir kad didelį insulino nanodalelių kiekį galima gauti be jokių užpildų ar krioprotektantų.
Insulino sulaikymas buvo tiriamas pH = 2,5 terpėje su pepsinu, tripsinu ir α-chimotripsinu, siekiant parodyti NP apsauginį gebėjimą nuo fermentinio virškinimo po dehidratacijos. Dehidratuotų NP insulino sulaikymas buvo lyginamas su šviežiai paruoštų NP insulino sulaikymu, o laisvas insulinas buvo naudojamas kaip neigiama kontrolė. Šiame tyrime laisvas insulinas parodė greitą insulino eliminaciją per 4 valandas visuose trijuose fermentiniuose apdorojimuose (5a–c pav.). Priešingai, liofilizuotų NP su manitoliu ir purškiant džiovintų NP su manitoliu arba be jo insulino eliminacijos tyrimas parodė žymiai didesnę šių NP apsaugą nuo fermentinio virškinimo, kuri buvo panaši į šviežiai paruoštų insulino NP (1 pav.). Padedant nanodalelėms pepsine, tripsinu ir α-chimotripsinu, per 4 valandas buvo galima apsaugoti atitinkamai daugiau nei 50 %, 60 % ir 75 % insulino (5a–c pav.). Šis insulino apsauginis gebėjimas gali padidinti didesnės insulino absorbcijos į kraują tikimybę25. Šie rezultatai rodo, kad purškiant džiovinant su arba be manitolio ir šaldant džiovinant su manitoliu, galima išsaugoti NP apsauginį insulino poveikį po dehidratacijos.
Dehidratuotų insulino NP apsaugos ir atpalaidavimo elgsena: (a) insulino apsauga pepsino tirpale; (b) insulino apsauga tripsino tirpale; (c) insulino apsauga α-chimotripsino tirpalu; (d) dehidratuotų NP atpalaidavimo elgsena pH = 2,5 tirpale; (e) dehidratuotų NP atpalaidavimo elgsena pH = 6,6 tirpale; (f) dehidratuotų NP atpalaidavimo elgsena pH = 7,0 tirpale.
Šviežiai paruošti ir atkurti sauso insulino NP buvo inkubuojami įvairiuose buferiuose (pH = 2,5, 6,6, 7,0) 37 °C temperatūroje, imituojant skrandžio, dvylikapirštės žarnos ir viršutinės plonosios žarnos pH aplinką, siekiant ištirti insulino poveikį atsparumui insulinui. Išsiskyrimo elgsena skirtingose ​​aplinkose. Virškinimo trakto fragmentas. Esant pH = 2,5, insulinu pripildytos NP ir pakartotinai ištirpintos sausos insulino NP per pirmąją valandą parodė pradinį staigų išsiskyrimą, po kurio per kitas 5 valandas sekė lėtas išsiskyrimas (5d pav.). Šis greitas išsiskyrimas pradžioje greičiausiai yra greitos baltymų molekulių, kurios nėra visiškai imobilizuotos dalelės vidinėje struktūroje, desorbcijos paviršiaus rezultatas. Esant pH = 6,5, insulinu pripildytos NP ir ištirpintos sausos insulino NP per 6 valandas parodė sklandų ir lėtą išsiskyrimą, nes tiriamojo tirpalo pH buvo panašus į NP paruošto tirpalo pH (5e pav.). Esant pH = 7, NP buvo nestabilios ir beveik visiškai suskilo per pirmąsias dvi valandas (5f pav.). Taip yra todėl, kad esant aukštesniam pH vyksta chitozano deprotonacija, dėl kurios susidaro mažiau kompaktiškas polimerų tinklas ir išsiskiria pakrautas insulinas.
Be to, purškiant džiovintos insulino nanodalelės be manitolio pasižymėjo greitesniu atpalaidavimo profiliu nei kitos dehidratuotos nanodalelės (5d–f pav.). Kaip aprašyta anksčiau, be manitolio džiovintos atkurtos insulino nanodalelės pasižymėjo mažiausiu dalelių dydžiu. Mažos dalelės suteikia didesnį paviršiaus plotą, todėl didžioji dalis atitinkamo vaisto bus dalelių paviršiuje arba šalia jo, todėl vaistas išsiskiria greitai26.
NP citotoksiškumas buvo tirtas MTT tyrimu. Kaip parodyta S4 paveiksle, nustatyta, kad visos dehidratuotos NP neturėjo reikšmingo poveikio ląstelių gyvybingumui esant 50–500 μg/ml koncentracijoms, o tai rodo, kad visas dehidratuotas NP galima saugiai naudoti terapiniam langui pasiekti.
Kepenys yra pagrindinis organas, per kurį insulinas atlieka savo fiziologines funkcijas. HepG2 ląstelės yra žmogaus hepatomos ląstelių linija, dažniausiai naudojama kaip in vitro hepatocitų pasisavinimo modelis. Čia HepG2 ląstelės buvo naudojamos įvertinti NP, dehidratuotų šaldymo ir purškimo džiovinimo metodais, pasisavinimą ląstelėse. Ląstelių pasisavinimas buvo įvertintas konfokaliniu lazeriniu skenavimu, naudojant srauto citometriją ir regėjimą, po kelių valandų inkubacijos su laisvu FITC insulinu, kurio koncentracija buvo 25 μg/ml, šviežiai paruoštomis FITC insulinu pripildytomis NP ir dehidratuotomis FITC insulinu pripildytomis NP, esant vienodoms insulino koncentracijoms. Buvo atlikti kiekybinės mikroskopijos (CLSM) stebėjimai. Liofilizuotos NP be manitolio buvo sunaikintos dehidratacijos metu ir šiame bandyme nebuvo įvertintos. Šviežiai paruoštų insulinu pripildytų NP, liofilizuotų NP su manitoliu ir purškimo būdu džiovintų NP su manitoliu ir be jo (6a pav.) tarpląstelinis fluorescencijos intensyvumas buvo atitinkamai 4,3, 2,6, 2,4 ir 4,1 karto didesnis nei laisvųjų. FITC-insulino grupėje (6b pav.). Šios Rezultatai rodo, kad kapsuliuotas insulinas yra stipresnis ląstelių pasisavinime nei laisvas insulinas, daugiausia dėl mažesnio tyrimo metu susidariusių insulinu prisotintų nanodalelių dydžio.
HepG2 ląstelių pasisavinimas po 4 val. inkubacijos su šviežiai paruoštomis ir dehidratuotomis NP: (a) FITC insulino pasisavinimo pasiskirstymas HepG2 ląstelėse. (b) Fluorescencijos intensyvumo geometrinis vidurkis, analizuotas srauto citometrija (n = 3), *P < 0,05, palyginti su laisvu insulinu.
Panašiai CLSM vaizdai parodė, kad šviežiai paruoštų FITC insulinu pripildytų NP ir FITC insulinu pripildytų purškiant džiovintų NP (be manitolio) FITC fluorescencijos intensyvumas buvo daug stipresnis nei kitų mėginių (6a pav.). Be to, pridėjus manitolio, didesnis tirpalo klampumas padidino atsparumą ląstelių pasisavinimui, todėl sumažėjo insulino proliferacija. Šie rezultatai rodo, kad purškiant džiovintos NP be manitolio pasižymėjo didžiausiu ląstelių pasisavinimo efektyvumu, nes jų dalelių dydis buvo mažesnis nei liofilizuotų NP po pakartotinio ištirpinimo.
Chitozanas (vidutinė molekulinė masė 100 kDa, 75–85 % deacetilinta) buvo įsigytas iš „Sigma-Aldrich“ (Oakvilis, Ontarijas, Kanada). Natrio tripolifosfatas (TPP) buvo įsigytas iš „VWR“ (Radnoras, Pensilvanija, JAV). Šiame tyrime naudotas rekombinantinis žmogaus insulinas buvo įsigytas iš „Fisher Scientific“ (Walthamas, Masačusetsas, JAV). Fluoresceino izotiocianatu (FITC) žymėtas žmogaus insulinas ir 4',6-diamidino-2-fenilindoldihidrochloridas (DAPI) buvo įsigytas iš „Sigma-Aldrich“ (Oakvilis, Ontarijas, Kanada). HepG2 ląstelių linija buvo gauta iš ATCC (Manasasas, Virdžinija, JAV). Visi kiti reagentai buvo analitinės arba chromatografinės klasės.
Paruoškite 1 mg/ml CS tirpalą ištirpindami jį dvigubai distiliuotame vandenyje (DD vandenyje), kuriame yra 0,1 % acto rūgšties. Paruoškite 1 mg/ml TPP ir insulino tirpalus, ištirpindami juos atitinkamai DD vandenyje ir 0,1 % acto rūgštyje. Preemulsija buvo paruošta naudojant „Polytron PCU-2-110“ didelio greičio homogenizatorių („Brinkmann Ind. Westbury, NY, JAV“). Paruošimo procesas yra toks: pirmiausia į 4 ml insulino tirpalo įpilama 2 ml TPP tirpalo, mišinys maišomas 30 min. ir visiškai išmaišomas. Tada sumaišytas tirpalas lašinamas į CS tirpalą per švirkštą, dideliu greičiu maišant (10 000 aps./min.). Mišiniai 30 min. maišomi dideliu greičiu (15 000 aps./min.), ir jų pH sureguliuojamas iki tam tikro, kad būtų gautos susiūtos insulino nanodalelės. Siekiant dar labiau homogenizuoti ir sumažinti insulino nanodalelių dalelių dydį, jos dar 30 min. buvo sonikuojamos... ledo vonelėje naudojant zondo tipo sonikatorių (UP 200ST, „Hielscher Ultrasonics“, Teltovas, Vokietija).
Insulino NPS buvo tiriami pagal Z vidutinį skersmenį, polidispersiškumo indeksą (PDI) ir dzeta potencialą, naudojant dinaminio šviesos sklaidos (DLS) matavimus, naudojant „Litesizer 500“ (Anton Paar, Gracas, Austrija), skiedžiant juos DD vandeniu 25 °C temperatūroje. Morfologija ir dydžio pasiskirstymas buvo apibūdinti „Hitachi H7600“ transmisiniu elektroniniu mikroskopu (TEM) („Hitachi“, Tokijas, Japonija), o vaizdai vėliau buvo analizuojami naudojant „Hitachi“ vaizdavimo programinę įrangą („Hitachi“, Tokijas, Japonija). Norint įvertinti insulino NP kapsuliavimo efektyvumą (EE) ir įkrovimo talpą (LC), NP buvo pipete supilamos į ultrafiltracijos mėgintuvėlius, kurių molekulinės masės riba yra 100 kDa, ir centrifuguojamos 500 x g greičiu 30 min. Nekapsuliuoto insulino kiekis filtrate buvo kiekybiškai įvertintas naudojant „Agilent 1100“ serijos HPLC sistemą („Agilent“, Santa Klara, Kalifornija, JAV), kurią sudarė ketvirtinis siurblys, automatinis mėginių ėmiklis, kolonėlės šildytuvas ir DAD detektorius. Insulinas buvo analizuojamas C18 kolonėle. (Zorbax, 3,5 μm, 4,6 mm × 150 mm, „Agilent“, JAV) ir detektuojama esant 214 nm bangos ilgiui. Judanti fazė buvo acetonitrilas ir vanduo, turintys 0,1 % TFA, gradiento santykiai nuo 10/90 iki 100/0, ir veikimas 10 minučių. Judanti fazė buvo pumpuojama 1,0 ml/min. srauto greičiu. Kolonėlės temperatūra buvo nustatyta 20 °C. Apskaičiuokite EE ir LC procentus naudodami (1) ir (2) lygtis.
Siekiant optimizuoti insulino NP, buvo išbandyti įvairūs CS/insulino santykiai nuo 2,0 iki 4,0. Paruošimo metu buvo įlašinamas skirtingas CS tirpalo kiekis, o insulino/TPP mišinys buvo palaikomas pastovus. Insulino NP buvo ruošiamos pH intervale nuo 4,0 iki 6,5, kruopščiai kontroliuojant mišinio pH įlašinus visus tirpalus (insuliną, TPP ir CS). Insulino nanodalelių EE ir dalelių dydis buvo įvertinti esant skirtingoms pH vertėms ir CS/insulino masės santykiams, siekiant optimizuoti insulino NP susidarymą.
Optimizuotos insulino NP buvo dedamos ant aliuminio talpyklos ir uždengiamos audiniu, sutvirtintu lipnia juosta. Vėliau užsuktos talpyklos buvo dedamos į „Labconco FreeZone“ šaldymo džiovyklę („Labconco“, Kanzasas Sitis, Misūris, JAV) su dėklo tipo džiovintuvu. Temperatūra ir vakuumo slėgis buvo nustatyti ties -10 °C, 0,350 torų pirmąsias 2 val. ir 0 °C bei 0,120 torų likusias 22 val. iš 24 val., kad būtų gautos sausos insulino NP.
Kapsuluotam insulinui gaminti buvo naudojamas „Buchi Mini Spray Dryer B-290“ (BÜCHI, Flawil, Šveicarija). Pasirinkti džiovinimo parametrai: temperatūra 100 °C, tiekimo srautas 3 l/min. ir dujų srautas 4 l/min.
Insulino nanodalelės prieš ir po dehidratacijos buvo apibūdintos FTIR-ATR spektroskopija. Dehidratuotos nanodalelės, taip pat laisvas insulinas ir chitozanas buvo analizuojamos naudojant „Spectrum 100 FTIR“ spektrofotometrą („PerkinElmer“, Waltham, Masačusetsas, JAV) su universaliu ATR mėginių ėmimo priedu („PerkinElmer“, Waltham, Masačusetsas, JAV). Signalų vidurkiai buvo gauti iš 16 skenavimų, esant 4 cm2 skiriamajai gebai ir 4000–600 cm2 dažnių diapazone.
Sausų insulino nanodalelių morfologija buvo įvertinta naudojant liofilizuotų ir purškiamojo džiovinimo būdu gautų insulino nanodalelių SEM vaizdus, ​​užfiksuotus „Helios NanoLab 650“ fokusuoto jonų pluošto skenuojančiu elektroniniu mikroskopu (FIB-SEM) (FEI, Hillsboro, Oregonas, JAV). Pagrindinis naudotas parametras buvo 5 keV įtampa ir 30 mA srovė.
Visos dehidratuotos insulino nanodalelės buvo ištirpintos dehidratuotame vandenyje. Dalelių dydis, PDI, EE ir LC buvo dar kartą ištirti naudojant tą patį anksčiau minėtą metodą, siekiant įvertinti jų kokybę po dehidratacijos. Anhidroinsulino nanodalelių stabilumas taip pat buvo matuojamas tiriant nanodalelių savybes po ilgalaikio laikymo. Šiame tyrime visos nanodalelės po dehidratacijos buvo laikomos šaldytuve tris mėnesius. Po trijų mėnesių laikymo nanodalelės buvo tiriamos pagal morfologinį dalelių dydį, PDI, EE ir LC.
Ištirpinkite 5 ml atkurtų nanodalelių 45 ml imituoto skrandžio skysčio (pH 1,2, kuriame yra 1 % pepsino), žarnyno skysčio (pH 6,8, kuriame yra 1 % tripsino) arba chimotripsino tirpalo (100 µg/ml, fosfatiniame buferyje, pH 7,8), kad įvertintumėte insulino veiksmingumą apsaugant nanodaleles po dehidratacijos. Jos buvo inkubuojamos 37 °C temperatūroje, maišant 100 aps./min. greičiu. Įvairiais laiko momentais buvo surinkta 500 μl tirpalo, o insulino koncentracija nustatyta HPLC metodu.
Šviežiai paruoštų ir dehidratuotų insulino nanodalelių (NP) išsiskyrimo in vitro elgsena buvo tiriama dializės maišelio metodu (molekulinės masės riba – 100 kDa, „Spectra Por Inc.“). Šviežiai paruoštos ir atkurtos sausos NP buvo dializuojamos skysčiuose, kurių pH yra 2,5, 6,6 ir 7,0 (0,1 M fosfatiniu buferiniu tirpalu, PBS), siekiant imituoti skrandžio, dvylikapirštės žarnos ir viršutinės plonosios žarnos pH aplinką. Visi mėginiai buvo inkubuojami 37 °C temperatūroje, nuolat kratant 200 aps./min. greičiu. Skystis iš 5 ml dializės maišelio buvo išsiurbiamas tokiu laiku: 0,5, 1, 2, 3, 4 ir 6 val., o tūris nedelsiant papildytas šviežiu dializatu. Insulino užterštumas skystyje buvo analizuojamas HPLC metodu, o insulino išsiskyrimo iš nanodalelių greitis buvo apskaičiuotas pagal laisvo išsiskyrusio insulino ir bendro nanodalelėse įkapsuliuoto insulino santykį (3 lygtis).
Žmogaus hepatocelulinės karcinomos ląstelių linijos HepG2 ląstelės buvo auginamos 60 mm skersmens lėkštelėse, naudojant Dulbecco modifikuotą Eagle terpę (DMEM), kurioje yra 10 % vaisiaus galvijų serumo, 100 TV/ml penicilino ir 100 μg/ml streptomicino29. Kultūros buvo laikomos 37 °C temperatūroje, 95 % santykinėje drėgmėje ir 5 % CO2. Absorbcijos tyrimams HepG2 ląstelės buvo pasėtos 1 × 105 ląstelių/ml tankiu ant 8 šulinėlių „Nunc Lab-Tek“ kamerinių stiklelių sistemos („Thermo Fisher“, Niujorkas, JAV). Citotoksiškumo tyrimams jos buvo pasėtos į 96 šulinėlių plokšteles (Corning, Niujorkas, JAV) 5 × 104 ląstelių/ml tankiu.
MTT tyrimas buvo naudojamas šviežiai paruoštų ir dehidratuotų insulino NP citotoksiškumui įvertinti30. HepG2 ląstelės buvo pasėtos į 96 šulinėlių plokšteles, kurių tankis buvo 5 × 104 ląstelių/ml, ir kultivuojamos 7 dienas prieš tyrimą. Insulino NP buvo praskiestos iki įvairių koncentracijų (nuo 50 iki 500 μg/ml) kultūros terpėje ir po to suleistos ląstelėms. Po 24 valandų inkubacijos ląstelės buvo 3 kartus plaunamos PBS ir inkubuojamos su terpe, kurioje yra 0,5 mg/ml MTT, dar 4 valandas. Citotoksiškumas buvo įvertintas matuojant geltonojo tetrazolio MTT fermentinę redukciją į violetinį formazaną esant 570 nm bangos ilgiui, naudojant „Tecan infinite M200 pro“ spektrofotometro plokštelių skaitytuvą („Tecan“, Männedorfas, Šveicarija).
NP ląstelių pasisavinimo efektyvumas buvo patikrintas konfokalinės lazerinės skenavimo mikroskopijos ir srauto citometrijos analizės būdu. Kiekvienas „Nunc Lab-Tek“ kamerinės skaidrių sistemos šulinys buvo apdorotas laisvu FITC insulinu, FITC insulinu pripildytomis NP ir atkurtomis 25 μg/ml dehidratuotomis FITC insulino NP toje pačioje koncentracijoje ir inkubuotas 4 valandas. Ląstelės buvo 3 kartus plaunamos PBS ir fiksuotos 4 % paraformaldehidu. Branduoliai buvo dažomi 4',6-diamidino-2-fenilindoliu (DAPI). Insulino lokalizacija buvo stebima naudojant „Olympus FV1000“ lazerinio skenavimo / dviejų fotonų konfokalinį mikroskopą („Olympus“, Šindžiuku miestas, Tokijas, Japonija). Srauto citometrijos analizei į 96 šulinėlių plokšteles, pasėtas HepG2 ląstelėmis, buvo įdėtos tos pačios 10 μg/ml laisvo FITC insulino, FITC insulinu pripildytų NP ir ištirpintų dehidratuotų FITC insulino NP koncentracijos ir inkubuotos 4 valandas. Po 4 val. Inkubacijos metu ląstelės buvo pašalintos ir 3 kartus praplautos FBS. 5 × 104 ląstelių viename mėginyje buvo analizuojamos BD LSR II srauto citometru (BD, Franklin Lakes, Naujasis Džersis, JAV).
Visos vertės išreikštos kaip vidurkis ± standartinis nuokrypis. Visų grupių palyginimai buvo įvertinti naudojant vienfaktorinę ANOVA arba t-testą su IBM SPSS Statistics 26 for Mac (IBM, Endicott, Niujorkas, JAV), o p < 0,05 buvo laikoma statistiškai reikšminga.
Šis tyrimas parodo purškiamojo džiovinimo lankstumą ir gebėjimą dehidratuoti susietas chitozano / TPP / insulino nanodaleles, geriau jas rekonstruojant, palyginti su standartiniais šaldymo džiovinimo metodais, naudojant užpildus arba krioprotektorius, ir didesnę apkrovą. Optimizuotos insulino nanodalelės davė vidutinį 318 nm dalelių dydį ir 99,4 % kapsuliavimo efektyvumą. SEM ir FTIR rezultatai po dehidratacijos parodė, kad sferinė struktūra išliko tik purškiant džiovintose NP su manitoliu ir be jo bei liofilizuotose su manitoliu, tačiau liofilizuotos NP be manitolio dehidratacijos metu suskilo. Rekonstitūcijos gebėjimo teste purškiant džiovintos insulino nanodalelės be manitolio parodė mažiausią vidutinį dalelių dydį ir didžiausią apkrovą rekonstruojant. Visų šių dehidratuotų NP atpalaidavimo elgsena parodė, kad jos greitai atpalaiduojamos tirpaluose, kurių pH = 2,5 ir pH = 7, ir labai stabilios tirpale, kurio pH = 6,5. Palyginti su kitomis ištirpintomis dehidratuotomis NP, purškiant džiovintos NP be manitolio parodė greičiausiai atpalaiduojamą. Šis rezultatas atitinka stebėtą ląstelių įsisavinimo tyrimas, nes purškiant džiovintos NP be manitolio beveik visiškai išlaikė šviežiai paruoštų NP ląstelinį įsisavinimo efektyvumą. Šie rezultatai rodo, kad sausos insulino nanodalelės, paruoštos purškiant džiovinant be manitolio, yra tinkamiausios tolesniam perdirbimui į kitas bevandenes dozavimo formas, tokias kaip geriamosios tabletės arba bioadhezinės plėvelės.
Dėl intelektinės nuosavybės problemų, šio tyrimo metu sugeneruoti ir (arba) analizuoti duomenų rinkiniai nėra viešai prieinami, tačiau juos gali gauti atitinkami autoriai, pateikus pagrįstą prašymą.
Kagan, A. 2 tipo diabetas: socialinė ir mokslinė kilmė, medicininės komplikacijos ir pasekmės pacientams ir kitiems. (McFarlane, 2009).
Singh, AP, Guo, Y., Singh, A., Xie, W. ir Jiang, P. Insulino inkapsuliacijos sukūrimas: ar dabar galima vartoti per burną? J. Pharmacy.bio-pharmacy.reservoir.1, 74–92 (2019).
Wong, CY, Al-Salami, H. ir Dass, CR. Naujausi pasiekimai geriamųjų insulino prisotintų liposomų tiekimo sistemų, skirtų diabetui gydyti, srityje. Interpretation. J. Pharmacy. 549, 201–217 (2018).