Dėkojame, kad apsilankėte Nature.com. Jūsų naudojama naršyklės versija turi ribotą CSS palaikymą. Norėdami gauti geriausius rezultatus, rekomenduojame naudoti naujesnę naršyklės versiją (arba išjungti suderinamumo režimą „Internet Explorer“). Tuo tarpu, siekdami užtikrinti nuolatinį palaikymą, svetainę rodome be stiliaus ar „JavaScript“.
Propiono rūgštis (PPA) naudojama mitochondrijų disfunkcijos vaidmeniui neurologinės raidos sutrikimuose, tokiuose kaip autizmo spektro sutrikimas, tirti. Yra žinoma, kad PPA sutrikdo mitochondrijų biogenezę, metabolizmą ir apykaitą. Tačiau PPA poveikis mitochondrijų dinamikai, dalijimuisi ir susiliejimui išlieka problemiškas dėl sudėtingo šių mechanizmų laikinio pobūdžio. Šiame tyrime naudojame papildomus kiekybinio vaizdavimo metodus, siekdami ištirti, kaip PPA veikia mitochondrijų ultrastruktūrą, morfologiją ir dinamiką neuronų tipo SH-SY5Y ląstelėse. PPA (5 mM) sukėlė reikšmingą mitochondrijų ploto (p < 0,01), Fereto skersmens ir apimties (p < 0,05) bei 2 ploto (p < 0,01) sumažėjimą. Mitochondrijų įvykių lokatoriaus analizė parodė reikšmingą dalijimosi ir susiliejimo įvykių padidėjimą (p < 0,05), taip išlaikant mitochondrijų tinklo vientisumą stresinėmis sąlygomis. Be to, reikšmingai sumažėjo cMYC (p < 0,0001), NRF1 (p < 0,01), TFAM (p < 0,05), STOML2 (p < 0,0001) ir OPA1 (p < 0,05) mRNR raiška. 01). Tai iliustruoja mitochondrijų morfologijos, biogenezės ir dinamikos pertvarkymą, siekiant išlaikyti funkciją streso sąlygomis. Mūsų duomenys suteikia naujų įžvalgų apie PPA poveikį mitochondrijų dinamikai ir pabrėžia vaizdavimo metodų naudingumą tiriant sudėtingus reguliavimo mechanizmus, susijusius su mitochondrijų streso atsakais.
Mitochondrijos yra neatsiejama įvairių ląstelių funkcijų dalyvė, be jų įprastų vaidmenų energijos gamyboje ir biosintezėje. Mitochondrijų metabolizmas yra pagrindinis kalcio signalizacijos, metabolinės ir redokso homeostazės, uždegiminės signalizacijos, epigenetinių modifikacijų, ląstelių proliferacijos, diferenciacijos ir programuotos ląstelių mirties reguliatorius1. Mitochondrijų metabolizmas yra ypač svarbus neuronų vystymuisi, išgyvenimui ir funkcijai ir yra plačiai susijęs su įvairiomis neuropatologijos apraiškomis2,3,4.
Per pastarąjį dešimtmetį medžiagų apykaitos būsena iškilo kaip pagrindinis neurogenezės, diferenciacijos, brendimo ir plastiškumo reguliatorius5,6. Pastaruoju metu mitochondrijų morfologija ir dinamika tapo ypač svarbiais mitozės, dinaminio proceso, palaikančio sveikų mitochondrijų telkinį ląstelėse, komponentais. Mitochondrijų dinamiką reguliuoja sudėtingi tarpusavyje susiję keliai – nuo ​​mitochondrijų biogenezės ir bioenergetikos iki mitochondrijų dalijimosi, susiliejimo, pernašos ir klirenso7,8. Bet kurio iš šių integracinių mechanizmų sutrikimas sutrikdo sveikų mitochondrijų tinklų palaikymą ir turi didelių funkcinių pasekmių neurovystymuisi9,10. Iš tiesų, mitochondrijų dinamikos disreguliacija stebima sergant daugeliu psichikos, neurodegeneracinių ir neurovystymosi sutrikimų, įskaitant autizmo spektro sutrikimus (ASS)11,12.
ASD yra heterogeninis neurologinės raidos sutrikimas, turintis sudėtingą genetinę ir epigenetinę architektūrą. ASD paveldimumas neginčijamas, tačiau pagrindinė molekulinė etiologija vis dar menkai suprantama. Kaupiami ikiklinikinių modelių, klinikinių tyrimų ir daugiafunkcinių molekulinių duomenų rinkinių duomenys pateikia vis daugiau įrodymų apie mitochondrijų disfunkciją sergant ASD13,14. Anksčiau atlikome viso genomo DNR metilinimo tyrimą pacientų, sergančių ASD, kohortoje ir nustatėme skirtingai metilintus genus, susitelkusius palei mitochondrijų metabolizmo kelius15. Vėliau pranešėme apie diferencinę centrinių mitochondrijų biogenezės ir dinamikos reguliatorių metilinimą, kuris buvo susijęs su padidėjusiu mtDNR kopijų skaičiumi ir pakitusiu šlapimo metabolizmo profiliu sergant ASD16. Mūsų duomenys pateikia vis daugiau įrodymų, kad mitochondrijų dinamika ir homeostazė vaidina pagrindinį vaidmenį ASD patofiziologijoje. Todėl geresnis mitochondrijų dinamikos, morfologijos ir funkcijos ryšio supratimas yra pagrindinis vykdomų neurologinių ligų, kurioms būdinga antrinė mitochondrijų disfunkcija, tyrimų tikslas.
Molekuliniai metodai dažnai naudojami tiriant specifinių genų vaidmenį mitochondrijų streso reakcijose. Tačiau šį metodą gali riboti mitozinės kontrolės mechanizmų daugialypis ir laikinas pobūdis. Be to, skirtinga mitochondrijų genų raiška yra netiesioginis funkcinių pokyčių rodiklis, ypač todėl, kad paprastai analizuojamas tik ribotas skaičius genų. Todėl buvo pasiūlyti tiesioginiai mitochondrijų funkcijos ir bioenergetikos tyrimo metodai17. Mitochondrijų morfologija yra glaudžiai susijusi su mitochondrijų dinamika. Mitochondrijų forma, jungiamumas ir struktūra yra labai svarbūs energijos gamybai ir mitochondrijų bei ląstelių išgyvenimui5,18. Be to, įvairūs mitozės komponentai sutelkia dėmesį į mitochondrijų morfologijos pokyčius, kurie gali būti naudingi mitochondrijų disfunkcijos vertinimo kriterijai ir suteikti pagrindą vėlesniems mechanistiniams tyrimams.
Mitochondrijų morfologiją galima tiesiogiai stebėti naudojant transmisijinę elektroninę mikroskopiją (TEM), kuri leidžia atlikti išsamų ląstelių ultrastruktūros tyrimą. TEM tiesiogiai vizualizuoja mitochondrijų kristalų morfologiją, formą ir struktūrą atskirų mitochondrijų skiriamojoje geboje, o ne vien remiasi genų transkripcija, baltymų raiška ar mitochondrijų funkciniais parametrais ląstelių populiacijose17,19,20. Be to, TEM palengvina mitochondrijų ir kitų organelių, tokių kaip endoplazminis tinklas ir autofagosomos, kurios atlieka svarbų vaidmenį mitochondrijų funkcijoje ir homeostazėje, sąveikos tyrimą21,22. Taigi, TEM yra geras atspirties taškas tiriant mitochondrijų disfunkciją prieš sutelkiant dėmesį į konkrečius kelius ar genus. Kadangi mitochondrijų funkcija tampa vis svarbesnė neuropatologijoje, akivaizdu, kad reikia turėti galimybę tiesiogiai ir kiekybiškai tirti mitochondrijų morfologiją ir dinamiką in vitro neuronų modeliuose.
Šiame straipsnyje nagrinėjame mitochondrijų dinamiką neuroniniame mitochondrijų disfunkcijos modelyje, sergant autizmo spektro sutrikimu. Anksčiau pranešėme apie diferencinę propionil-CoA karboksilazės beta (PCCB) metilinimą ASD15, mitochondrijų propionil-CoA karboksilazės fermento PCC subvienetėje. Yra žinoma, kad PCC disreguliacija sukelia toksinį propionilo darinių, įskaitant propiono rūgštį (PPA), kaupimąsi23,24,25. Nustatyta, kad PPA sutrikdo neuronų metabolizmą ir keičia elgesį in vivo, ir yra nusistovėjęs gyvūnų modelis, skirtas tirti su ASD susijusius neurologinio vystymosi mechanizmus26,27,28. Be to, pranešta, kad PPA in vitro sutrikdo mitochondrijų membranos potencialą, biogenezę ir kvėpavimą, ir buvo plačiai naudojamas neuronų mitochondrijų disfunkcijai modeliuoti29,30. Tačiau PPA sukeltos mitochondrijų disfunkcijos poveikis mitochondrijų morfologijai ir dinamikai vis dar menkai suprantamas.
Šiame tyrime naudojami papildomi vaizdinimo metodai, siekiant kiekybiškai įvertinti PPA poveikį mitochondrijų morfologijai, dinamikai ir funkcijai SH-SY5Y ląstelėse. Pirma, sukūrėme TEM metodą mitochondrijų morfologijos ir ultrastruktūros pokyčiams vizualizuoti17,31,32. Atsižvelgdami į dinamišką mitochondrijų pobūdį33, taip pat panaudojome mitochondrijų įvykių lokalizatoriaus (MEL) analizę, kad kiekybiškai įvertintume dalijimosi ir susiliejimo įvykių pusiausvyros, mitochondrijų skaičiaus ir tūrio pokyčius PPA streso metu. Galiausiai ištyrėme, ar mitochondrijų morfologija ir dinamika yra susijusios su biogenezėje, dalijime ir susiliejime dalyvaujančių genų raiškos pokyčiais. Apibendrinus, mūsų duomenys iliustruoja mitochondrijų dinamiką reguliuojančių mechanizmų sudėtingumo išaiškinimo iššūkį. Pabrėžiame TEM naudingumą tiriant mitochondrijų morfologiją kaip išmatuojamą konvergentinį mitozės SH-SY5Y ląstelėse baigtinį tašką. Be to, pabrėžiame, kad TEM duomenys suteikia išsamiausią informaciją, kai jie derinami su vaizdinimo metodais, kurie taip pat fiksuoja dinaminius įvykius, reaguojant į metabolinį stresą. Tolesnis molekulinių reguliavimo mechanizmų, palaikančių neuroninių ląstelių mitozę, apibūdinimas gali suteikti svarbių įžvalgų apie nervų sistemos ir neurodegeneracinių ligų mitochondrijų komponentą.
Siekiant sukelti mitochondrijų stresą, SH-SY5Y ląstelės buvo apdorotos PPA naudojant 3 mM ir 5 mM natrio propionatą (NaP). Prieš TEM mėginiai buvo kriogeniškai paruošti naudojant aukšto slėgio užšaldymą ir užšaldymą (1a pav.). Sukūrėme automatizuotą mitochondrijų vaizdų analizės sistemą, skirtą aštuoniems mitochondrijų populiacijų morfologiniams parametrams matuoti trijuose biologiniuose pakartojimuose. Nustatėme, kad apdorojimas PPA reikšmingai pakeitė keturis parametrus: 2 plotą, plotą, perimetrą ir Feret skersmenį (1b–e pav.). 2 plotas reikšmingai sumažėjo tiek apdorojant 3 mM, tiek 5 mM PPA (atitinkamai p = 0,0183 ir p = 0,002) (1b pav.), o plotas (p = 0,003), perimetras (p = 0,0106) ir Feret skersmuo reikšmingai sumažėjo. 5 mM apdorojimo grupėje, palyginti su kontroline grupe, buvo reikšmingas sumažėjimas (p = 0,0172) (1c–e pav.). Reikšmingas ploto ir apimties sumažėjimas parodė, kad ląstelės, apdorotos 5 mM PPA, turėjo mažesnes, labiau apvalias mitochondrijas ir kad šios mitochondrijos buvo mažiau pailgos nei kontrolinėse ląstelėse. Tai taip pat atitinka reikšmingą Fereto skersmens sumažėjimą – nepriklausomą parametrą, rodantį didžiausio atstumo tarp dalelių kraštų sumažėjimą. Buvo pastebėti kristų ultrastruktūros pokyčiai: veikiant PPA stresui, kristos tapo mažiau ryškios (1a pav., B panelė). Tačiau ne visi vaizdai aiškiai atspindėjo kristų ultrastruktūrą, todėl kiekybinė šių pokyčių analizė nebuvo atlikta. Šie TEM duomenys gali atspindėti tris galimus scenarijus: (1) PPA sustiprina dalijimąsi arba slopina susiliejimą, todėl esamos mitochondrijos sumažėja; (2) padidėjusi biogenezė sukuria naujas, mažesnes mitochondrijas arba (3) vienu metu sukelia abu mechanizmus. Nors šių sąlygų negalima atskirti TEM, reikšmingi morfologiniai pokyčiai rodo mitochondrijų homeostazės ir dinamikos pokyčius veikiant PPA stresui. Vėliau tyrėme papildomus parametrus, kad galėtume toliau apibūdinti šią dinamiką ir galimus jas pagrindžiančius mechanizmus.
Propiono rūgštis (PPA) pertvarko mitochondrijų morfologiją. (a) Tipiniai transmisijinės elektroninės mikroskopijos (TEM) vaizdai, rodantys, kad didėjant PPA poveikiui, mitochondrijų dydis mažėja, o mitochondrijos tampa mažesnės ir apvalesnės; atitinkamai 0 mM (neapdorota), 3 mM ir 5 mM. Raudonos rodyklės žymi mitochondrijas. (b–e) 24 val. PPA apdorotos SH-SY5Y ląstelės buvo paruoštos TEM, o rezultatai buvo analizuojami naudojant Fiji/ImageJ. Keturi iš aštuonių parametrų parodė reikšmingus skirtumus tarp kontrolinių (neapdorotų, 0 mM PPA) ir apdorotų (3 mM ir 5 mM PPA) ląstelių. (b) 2 regionas, (c) Plotas, (d) Perimetras, (e) Fereto skersmuo. Reikšmingiems skirtumams nustatyti buvo naudojama vienfaktorinė dispersinė analizė (kontrolė ir gydymas) ir Dunnett'o daugybinių palyginimų testas (p < 0,05). Duomenų taškai rodo vidutinę mitochondrijų vertę kiekvienai atskirai ląstelei, o paklaidų juostos rodo vidurkį ± SEM. Pateikti duomenys rodo n = 3, bent 24 ląsteles viename pakartojime; iš viso buvo analizuoti 266 vaizdai; * reiškia p < 0,05, ** reiškia p < 0,01.
Norėdami dar labiau apibūdinti, kaip mitochondrijų dinamika reaguoja į PPA, mitochondrijas dažėme tetrametilrodamino etilo esteriu (TMRE) ir panaudojome laiko intervalo mikroskopiją bei MEL analizę, kad lokalizuotume ir kiekybiškai įvertintume mitochondrijas po 24 valandų esant 3 ir 5 mM PPA. Dalijimosi ir susiliejimo įvykių apdorojimas. (2a pav.). Po MEL analizės mitochondrijos buvo toliau analizuojamos, siekiant kiekybiškai įvertinti mitochondrijų struktūrų skaičių ir jų vidutinį tūrį. Pastebėjome nedidelį, bet reikšmingą dalijimosi įvykių, įvykusių esant 3 mM, skaičiaus padidėjimą [4,9 ± 0,3 (p < 0,05)], palyginti su dalijimosi [5,6 ± 0,3 (p < 0,05)] ir susiliejimo [5,4 ± 0,5 (p < 0,05)] bei susiliejimo [5,4 ± 0,5 (p < 0,05)] (0,05)] (<0,05)] įvykiais, kurie reikšmingai padidėjo esant 5 mM, palyginti su kontroline grupe (3b pav.). Mitochondrijų skaičius reikšmingai padidėjo tiek esant 3 [32,6 ± 2,1 (p < 0,05)], tiek 5 mM [34,1 ± 2,2 (p < 0,05)] koncentracijai (3c pav.), o vidutinis kiekvienos mitochondrijų struktūros tūris nepakito (3c pav.). 3d pav.). Apibendrinus tai, galima teigti, kad mitochondrijų dinamikos pertvarkymas yra kompensacinis atsakas, sėkmingai palaikantis mitochondrijų tinklo vientisumą. Padidėjęs dalijimosi įvykių skaičius esant 3 mM PPA koncentracijai rodo, kad mitochondrijų skaičiaus padidėjimas iš dalies susijęs su mitochondrijų dalijimusi, tačiau atsižvelgiant į tai, kad vidutinis mitochondrijų tūris iš esmės nepakinta, negalima atmesti biogenezės kaip papildomo kompensacinio atsako. Tačiau šie duomenys atitinka mažesnes, apvalias mitochondrijų struktūras, stebėtas TEM, ir taip pat rodo reikšmingus PPA sukeltus mitochondrijų dinamikos pokyčius.
Propiono rūgštis (PPA) sukelia dinaminį mitochondrijų pertvarkymą, kad išlaikytų tinklo vientisumą. SH-SY5Y ląstelės buvo kultivuojamos, 24 valandas apdorotos 3 ir 5 mM PPA ir nudažytos TMRE ir Hoechst 33342, po to atlikta MEL analizė. (a) Tipiniai laiko intervalo mikroskopijos vaizdai, vaizduojantys spalvas ir dvejetaines maksimalaus intensyvumo projekcijas 2 laiko momentu (t2) kiekvienai sąlygai. Kiekviename dvejetainiame vaizde nurodyti pasirinkti regionai yra paryškinti ir rodomi 3D formatu trimis skirtingais laiko intervalais (t1–t3), siekiant iliustruoti dinamiką laikui bėgant; susiliejimo įvykiai paryškinti žalia spalva; dalijimosi įvykiai paryškinti žalia spalva. Rodoma raudona spalva. (b) Vidutinis dinaminių įvykių skaičius kiekvienai sąlygai. (c) Vidutinis mitochondrijų struktūrų skaičius vienoje ląstelėje. (d) Kiekvienos mitochondrijų struktūros vidutinis tūris (µm3) vienoje ląstelėje. Pateikti duomenys reprezentuoja n = 15 ląstelių kiekvienoje apdorojimo grupėje. Pateiktos paklaidos juostos reiškia vidurkį ± SEM, mastelio juosta = 10 μm, * p < 0,05.
Propiono rūgštis (PPA) slopina su mitochondrijų dinamika susijusius genus transkripcijos požiūriu. SH-SY5Y ląstelės 24 val. buvo apdorotos 3 ir 5 mM PPA. Santykinis genų kiekybinis įvertinimas buvo atliktas naudojant RT-kPGR ir normalizuotas pagal B2M. Mitochondrijų biogenezės genai (a) cMYC, (b) TFAM, (c) NRF1 ir (d) NFE2L2. Mitochondrijų susiliejimo ir dalijimosi genai (e) STOML2, (f) OPA1, (g) MFN1, (h) MFN2 ir (i) DRP1. Reikšmingi skirtumai (p < 0,05) buvo patikrinti naudojant vienfaktorinę ANOVA (kontrolė ir gydymas) ir Dunnett'o daugybinių palyginimų testą: * žymi p < 0,05, ** žymi p < 0,01, o **** žymi p < 0,0001. Stulpeliai rodo vidutinę raišką ± SEM. Pateikti duomenys atitinka n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2) ir n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1) biologinius pakartojimus.
TEM ir MEL analizių duomenys kartu rodo, kad PPA keičia mitochondrijų morfologiją ir dinamiką. Tačiau šie vaizdinimo metodai nesuteikia įžvalgų apie šiuos procesus lemiančius mechanizmus. Todėl ištyrėme devynių pagrindinių mitochondrijų dinamikos, biogenezės ir mitozės reguliatorių mRNR raišką reaguojant į gydymą PPA. Po 24 valandų gydymo 3 mM ir 5 mM PPA kiekybiškai įvertinome ląstelių mielomos onkogeną (cMYC), branduolio kvėpavimo faktorių (NRF1), mitochondrijų transkripcijos faktorių 1 (TFAM), NFE2 tipo transkripcijos faktorių BZIP (NFE2L2), gastrino tipo baltymą 2 (STOML2), regos nervo atrofiją 1 (OPA1), mitofuziną 1 (MFN1), mitofuziną 2 (MFN2) ir su dinaminu susijusį baltymą 1 (DRP1). Stebėjome 3 mM (atitinkamai p = 0,0053, p = 0,0415 ir p < 0,0001) ir 5 mM (atitinkamai p = 0,0031, p = 0,0233, p < 0,0001) PPA poveikį. (3a–c pav.) mRNR raiškos sumažėjimas priklausė nuo dozės: cMYC, NRF1 ir TFAM raiška sumažėjo atitinkamai 5,7, 2,6 ir 1,9 karto esant 3 mM koncentracijai ir 11,2, 3 ir 2,2 karto esant 5 mM koncentracijai. Priešingai, centrinis redokso biogenezės genas NFE2L2 nepakito esant jokiai PPA koncentracijai, nors buvo pastebėta panaši nuo dozės priklausoma raiškos sumažėjimo tendencija (3d pav.).
Taip pat ištyrėme klasikinių genų, dalyvaujančių dalijimosi ir sintezės reguliavime, raišką. Manoma, kad STOML2 dalyvauja sintezėje, mitofagijoje ir biogenezėje, o jo raiška reikšmingai sumažėjo (p < 0,0001) esant 3 mM (2,4 karto pokytis) ir 5 mM (2,8 karto pokytis) PPA (1 pav.). Panašiai OPA1 sintezės geno raiška sumažėjo esant 3 mM (1,6 karto pokytis) ir 5 mM (1,9 karto pokytis) PPA (atitinkamai p = 0,006 ir p = 0,0024) (3f pav.). Tačiau reikšmingų skirtumų sintezės genų MFN1, MFN2 ar dalijimosi geno DRP1 raiškoje esant 24 val. PPA stresui neradome (3g–i pav.). Be to, nustatėme, kad keturių susiliejimo ir dalijimosi baltymų (OPA1, MFN1, MFN2 ir DRP1) lygiai nepakito tomis pačiomis sąlygomis (4a–d pav.). Svarbu pažymėti, kad šie duomenys atspindi vieną laiko momentą ir gali neatspindėti baltymų raiškos ar aktyvumo lygių pokyčių ankstyvosiose PPA streso stadijose. Tačiau reikšmingas cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 ir OPA1 raiškos sumažėjimas rodo reikšmingą mitochondrijų metabolizmo, biogenezės ir dinamikos transkripcijos disreguliaciją. Be to, šie duomenys pabrėžia vaizdavimo metodų naudingumą tiesiogiai tiriant mitochondrijų funkcijos galutinės būsenos pokyčius.
Susiliejimo ir dalijimosi faktorių baltymų kiekis nepakito po apdorojimo propiono rūgštimi (PPA). SH-SY5Y ląstelės 24 val. buvo apdorotos 3 ir 5 mM PPA. Baltymų kiekis buvo kiekybiškai įvertintas Western blot analize, o raiškos lygiai normalizuoti pagal bendrą baltymų kiekį. Pateikiami vidutinė baltymų raiška ir reprezentatyvūs tikslinio ir bendro baltymo Western blotai. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. Stulpeliai rodo vidurkį ± SEM, o pateikti duomenys reprezentuoja n = 3 biologinius pakartojimus. Daugkartiniai palyginimai (p < 0,05) buvo atlikti naudojant vienfaktorinę dispersinę analizę ir Dunnett'o testą. Originalus gelis ir blotas parodyti S1 paveiksle.
Mitochondrijų disfunkcija siejama su daugiasisteminėmis ligomis – nuo ​​medžiagų apykaitos, širdies ir kraujagyslių bei raumenų ligų iki neurologinių ligų1,10. Daugelis neurodegeneracinių ir neurodegeneracinių ligų yra susijusios su mitochondrijų disfunkcija, o tai pabrėžia šių organelių svarbą visą smegenų gyvavimo laiką. Šios ligos apima Parkinsono ligą, Alzheimerio ligą ir ASD3,4,18. Tačiau prieiga prie smegenų audinio šioms ligoms tirti yra sudėtinga, ypač mechanistiniu lygmeniu, todėl ląstelinių modelių sistemos yra būtina alternatyva. Šiame tyrime naudojame ląstelinių modelių sistemą, kurioje naudojamos PPA apdorotos SH-SY5Y ląstelės, siekdami pakartoti mitochondrijų disfunkciją, pastebėtą sergant neuronų ligomis, ypač autizmo spektro sutrikimais. Šio PPA modelio naudojimas mitochondrijų dinamikai neuronuose tirti gali suteikti įžvalgų apie ASD etiologiją.
Mes tyrėme TEM naudojimo galimybę mitochondrijų morfologijos pokyčiams stebėti. Svarbu pažymėti, kad TEM turi būti naudojamas teisingai, siekiant maksimalaus jo efektyvumo. Kriogeninių mėginių paruošimas leidžia geriau išsaugoti neuronų struktūras, vienu metu fiksuojant ląstelių komponentus ir sumažinant artefaktų susidarymą34. Atsižvelgdami į tai, pastebėjome, kad neuronų tipo SH-SY5Y ląstelės turėjo nepažeistas subląstelines organeles ir pailgas mitochondrijas (1a pav.). Tai pabrėžia kriogeninio paruošimo metodų naudingumą tiriant mitochondrijų morfologiją neuroninių ląstelių modeliuose. Nors kiekybiniai matavimai yra labai svarbūs objektyviai TEM duomenų analizei, vis dar nėra sutarimo dėl to, kokius konkrečius parametrus reikėtų matuoti, norint patvirtinti mitochondrijų morfologinius pokyčius. Remdamiesi daugybe tyrimų, kuriuose kiekybiškai buvo nagrinėjama mitochondrijų morfologija17,31,32, sukūrėme automatizuotą mitochondrijų vaizdų analizės kanalą, kuris matuoja aštuonis morfologinius parametrus, būtent: plotą, plotą2, kraštinių santykį, perimetrą, apskritumą, laipsnį, Feret skersmenį ir apvalumą.
Iš jų PPA reikšmingai sumažino 2-ąjį plotą, plotą, perimetrą ir Fereto skersmenį (1b–e pav.). Tai parodė, kad mitochondrijos tapo mažesnės ir apvalesnės, o tai atitinka ankstesnius tyrimus, rodančius mitochondrijų ploto sumažėjimą po 72 valandų PPA30 sukelto mitochondrijų streso. Šie morfologiniai požymiai gali rodyti mitochondrijų dalijimąsi – būtiną procesą, skirtą pažeistiems komponentams atskirti nuo mitochondrijų tinklo ir skatinti jų skaidymąsi mitofagijos būdu35,36,37. Kita vertus, vidutinio mitochondrijų dydžio sumažėjimas gali būti susijęs su padidėjusia biogeneze, dėl kurios susidaro mažos besiformuojančios mitochondrijos. Padidėjusi dalijimasis arba biogenezė yra kompensacinis atsakas siekiant palaikyti mitozę nuo mitochondrijų streso. Tačiau negalima atmesti sumažėjusio mitochondrijų augimo, sutrikusios susiliejimo ar kitų būklių.
Nors TEM sukurti didelės skiriamosios gebos vaizdai leidžia nustatyti morfologines charakteristikas atskirų mitochondrijų lygmenyje, šis metodas sukuria dvimačius momentinius vaizdus vienu laiko momentu. Norėdami ištirti dinaminius atsakus į metabolinį stresą, mitochondrijas dažėme TMRE ir naudojome laiko intervalo mikroskopiją su MEL analize, kuri leidžia didelio našumo 3D mitochondrijų tinklo pokyčių vizualizaciją laikui bėgant33,38. Stebėjome subtilius, bet reikšmingus mitochondrijų dinamikos pokyčius esant PPA stresui (2 pav.). Esant 3 mM koncentracijai, dalijimosi įvykių skaičius reikšmingai padidėjo, o susiliejimo įvykių skaičius išliko toks pat kaip ir kontrolinėje grupėje. Esant 5 mM PPA koncentracijai, pastebėtas tiek dalijimosi, tiek susiliejimo įvykių skaičiaus padidėjimas, tačiau šie pokyčiai buvo maždaug proporcingi, o tai rodo, kad dalijimosi ir susiliejimo kinetika pasiekia pusiausvyrą esant didesnėms koncentracijoms (2b pav.). Vidutinis mitochondrijų tūris nepakito tiek esant 3, tiek 5 mM PPA, o tai rodo, kad mitochondrijų tinklo vientisumas buvo išsaugotas (2d pav.). Tai atspindi dinaminių mitochondrijų tinklų gebėjimą reaguoti į nedidelį metabolinį stresą, kad būtų galima efektyviai palaikyti homeostazę nesukeliant tinklo fragmentacijos. Esant 3 mM PPA, dalijimosi padidėjimas yra pakankamas, kad būtų skatinamas perėjimas prie naujos pusiausvyros, tačiau reaguojant į didesnės PPA koncentracijos sukeltą stresą, reikalingas gilesnis kinetinis pertvarkymas.
Mitochondrijų skaičius padidėjo esant abiem PPA streso koncentracijoms, tačiau vidutinis mitochondrijų tūris reikšmingai nepakito (2c pav.). Tai gali būti dėl padidėjusios biogenezės arba padidėjusio dalijimosi; tačiau nesant reikšmingo vidutinio mitochondrijų tūrio sumažėjimo, labiau tikėtina, kad padidėja biosintezė. Tačiau 2 paveiksle pateikti duomenys patvirtina dviejų kompensacinių mechanizmų egzistavimą: padidėjusį dalijimosi įvykių skaičių, atitinkantį mitochondrijų dalijimosi reguliavimą, ir padidėjusį įvykių skaičių, atitinkantį mitochondrijų biogenezę. Galiausiai, dinaminė lengvo streso kompensacija gali būti sudaryta iš vienalaikių procesų, apimančių dalijimąsi, susiliejimą, biogenezę ir mitofagiją. Nors ankstesni autoriai parodė, kad PPA sustiprina mitozę30,39 ir mitofagiją29, mes pateikiame įrodymų apie mitochondrijų dalijimosi ir susiliejimo dinamikos pertvarkymą reaguojant į PPA. Šie duomenys patvirtina TEM pastebėtus morfologinius pokyčius ir suteikia daugiau įžvalgų apie mechanizmus, susijusius su PPA sukelta mitochondrijų disfunkcija.
Kadangi nei TEM, nei MEL analizė nepateikė tiesioginių įrodymų apie genų reguliavimo mechanizmus, lemiančius stebimus morfologinius pokyčius, ištyrėme genų, dalyvaujančių mitochondrijų metabolizme, biogenezėje ir dinamikoje, RNR raišką. cMYC protoonkogenas yra transkripcijos faktorius, dalyvaujantis mitochondrijų, glikolizės, aminorūgščių ir riebalų rūgščių metabolizmo reguliavime40. Be to, žinoma, kad cMYC reguliuoja beveik 600 mitochondrijų genų, dalyvaujančių mitochondrijų transkripcijoje, transliacijoje ir kompleksų surinkime, įskaitant NRF1 ir TFAM41, raišką. NRF1 ir TFAM yra du centriniai mitozės reguliatoriai, veikiantys pasroviui nuo PGC-1α, kad aktyvuotų mtDNR replikaciją. Šį kelią aktyvuoja cAMP ir AMPK signalizacija, ir jis yra jautrus energijos sąnaudoms ir metaboliniam stresui. Taip pat ištyrėme NFE2L2, mitochondrijų biogenezės redokso reguliatorių, kad nustatytume, ar PPA poveikį gali sukelti oksidacinis stresas.
Nors NFE2L2 raiška nepakito, po 24 val. gydymo 3 mM ir 5 mM PPA nustatėme nuoseklų, nuo dozės priklausomą cMYC, NRF1 ir TFAM raiškos sumažėjimą (3a–c pav.). Anksčiau buvo pranešta, kad cMYC raiškos sumažėjusi reguliacija yra atsakas į mitochondrijų stresą42, ir atvirkščiai, cMYC raiškos sumažėjusi reguliacija gali sukelti mitochondrijų disfunkciją, pertvarkant mitochondrijų metabolizmą, tinklo ryšį ir membranų poliarizaciją43. Įdomu tai, kad cMYC taip pat dalyvauja mitochondrijų dalijimosi ir susiliejimo reguliavime42,43 ir yra žinoma, kad padidina DRP1 fosforilinimą ir mitochondrijų lokalizaciją ląstelių dalijimosi metu44, taip pat tarpininkauja mitochondrijų morfologiniam pertvarkymui neuronų kamieninėse ląstelėse45. Iš tiesų, cMYC neturintys fibroblastai pasižymi sumažėjusiu mitochondrijų dydžiu, atitinkančiu PPA43 streso sukeltus pokyčius. Šie duomenys iliustruoja įdomų, bet kol kas neaiškų cMYC ir mitochondrijų dinamikos ryšį, todėl tai gali būti įdomus taikinys būsimiems PPA streso sukeltos pertvarkymo tyrimams.
NRF1 ir TFAM sumažėjimas atitinka cMYC, kaip svarbaus transkripcijos aktyvatoriaus, vaidmenį. Šie duomenys taip pat atitinka ankstesnius tyrimus su žmogaus gaubtinės ir tiesiosios žarnos vėžio ląstelėmis, rodančius, kad PPA sumažino NRF1 mRNR raišką po 22 valandų, o tai buvo susiję su ATP išeikvojimu ir ROS46 padidėjimu. Šie autoriai taip pat pranešė, kad TFAM raiška padidėjo po 8,5 valandos, bet grįžo į pradinį lygį po 22 valandų. Priešingai, Kim ir kt. (2019) parodė, kad TFAM mRNR raiška reikšmingai sumažėjo po 4 valandų PPA streso SH-SY5Y ląstelėse; tačiau po 72 valandų TFAM baltymo raiška reikšmingai padidėjo, o mtDNR kopijų skaičius reikšmingai padidėjo. Taigi, mitochondrijų biogenezės genų skaičiaus sumažėjimas, kurį stebėjome po 24 valandų, neatmeta galimybės, kad mitochondrijų skaičiaus padidėjimas yra susijęs su biogenezės aktyvacija ankstesniais laiko momentais. Ankstesni tyrimai parodė, kad PPA reikšmingai padidina PGC-1α mRNR ir baltymo kiekį SH-SY5Y ląstelėse po 4 valandų 30 minučių, o propiono rūgštis sustiprina mitochondrijų biogenezę veršelių hepatocituose per PGC-1α po 12 valandų 39 minučių. Įdomu tai, kad PGC-1α yra ne tik tiesioginis NRF1 ir TFAM transkripcijos reguliatorius, bet ir įrodyta, kad reguliuoja MFN2 ir DRP1 aktyvumą, reguliuodamas dalijimąsi ir susiliejimą47. Apibendrinus, tai pabrėžia glaudų mechanizmų, reguliuojančių PPA sukeltus mitochondrijų kompensacinius atsakus, ryšį. Be to, mūsų duomenys atspindi reikšmingą biogenezės ir metabolizmo transkripcijos reguliavimo disreguliaciją PPA streso metu.
STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 ir DRP1 genai yra vieni iš centrinių mitochondrijų dalijimosi, susiliejimo ir dinamikos reguliatorių37,48,49. Yra daug kitų genų, dalyvaujančių mitochondrijų dinamikoje, tačiau anksčiau buvo nustatyta, kad STOML2, OPA1 ir MFN2 yra skirtingai metilinti ASD kohortose,16 ir keli nepriklausomi tyrimai pranešė apie šių transkripcijos faktorių pokyčius reaguojant į mitochondrijų stresą50,51.52. Tiek OPA1, tiek STOML2 raiška buvo reikšmingai sumažinta 3 mM ir 5 mM PPA apdorojimu (3e, f pav.). OPA1 yra vienas iš klasikinių mitochondrijų susiliejimo reguliatorių, tiesiogiai sąveikaudamas su MFN1 ir 2, ir atlieka svarbų vaidmenį kristų pertvarkyme ir mitochondrijų morfologijoje53. Tikslus STOML2 vaidmuo mitochondrijų dinamikoje lieka neaiškus, tačiau įrodymai rodo, kad jis atlieka svarbų vaidmenį mitochondrijų susiliejime, biogenezėje ir mitofagijoje.
STOML2 dalyvauja mitochondrijų kvėpavimo sąveikos palaikyme ir kvėpavimo grandinės kompleksų formavime54,55, ir įrodyta, kad jis iš esmės keičia vėžio ląstelių metabolines savybes56. Tyrimai parodė, kad STOML2 skatina mitochondrijų membranų potencialą ir biogenezę sąveikaudamas su BAN ir kardiolipinu55, 57, 58. Be to, nepriklausomi tyrimai parodė, kad STOML2 ir PINK1 sąveika reguliuoja mitofagiją59,60. Pažymėtina, kad pranešta, jog STOML2 tiesiogiai sąveikauja su MFN2 ir jį stabilizuoja, taip pat atlieka svarbų vaidmenį stabilizuojant ilgas OPA1 izoformas, slopindamas proteazę, atsakingą už OPA1 skaidymą53,61,62. STOML2 ekspresijos sumažėjimas, pastebėtas PPA reakcijose, gali padaryti šiuos susiliejusius baltymus jautresnius skaidymui per ubikvitino ir proteasomų priklausomus kelius48. Nors tikslus STOML2 ir OPA1 vaidmuo dinaminiame atsake į PPA nėra aiškus, sumažėjusi šių susiliejusių genų ekspresija (3 pav.) gali sutrikdyti dalijimosi ir susiliejimo pusiausvyrą ir sumažinti mitochondrijų dydį (3 pav.). 1).
Kita vertus, OPA1 baltymo raiška po 24 val. išliko nepakitusi, o MFN1, MFN2 ar DRP1 mRNR ir baltymo lygiai po PPA apdorojimo reikšmingai nepakito (3g-i pav., 4 pav.). Tai gali rodyti, kad šių mitochondrijų susiliejime ir dalijime dalyvaujančių faktorių reguliacijoje pokyčių nėra. Tačiau verta paminėti, kad kiekvieną iš šių keturių genų taip pat reguliuoja potranskripcinės modifikacijos (PTM), kurios kontroliuoja baltymo aktyvumą. OPA1 turi aštuonis alternatyvius splaisingo variantus, kurie mitochondrijose proteolizės būdu suskaidomi, kad susidarytų dvi skirtingos izoformos63. Ilgųjų ir trumpųjų izoformų pusiausvyra galiausiai lemia OPA1 vaidmenį mitochondrijų susiliejime ir mitochondrijų tinklo palaikyme64. DRP1 aktyvumą reguliuoja kalcio/kalmodulino priklausoma baltymų kinazės II (CaMKII) fosforilinimas, o DRP1 skaidymą reguliuoja ubikvitinacija ir SUMOilinimas65. Galiausiai, tiek DRP1, tiek MFN1/2 yra GTPazės, todėl aktyvumui gali turėti įtakos GTP gamybos greitis mitochondrijose 66. Todėl, nors šių baltymų raiška išlieka pastovi, tai gali neatspindėti nepakitusio baltymų aktyvumo ar lokalizacijos 67,68. Iš tiesų, esami PTM baltymų repertuarai dažnai tarnauja kaip pirmoji gynybos linija, atsakinga už ūmaus streso atsakų tarpininkavimą. Esant vidutinio stiprumo metaboliniam stresui mūsų modelyje, tikėtina, kad PTM skatina padidėjusį susiliejimo ir dalijimosi baltymų aktyvumą, kad pakankamai atkurtų mitochondrijų vientisumą, nereikalaujant papildomo šių genų aktyvavimo mRNR ar baltymų lygmeniu.
Apibendrinus, aukščiau pateikti duomenys pabrėžia sudėtingą ir nuo laiko priklausomą mitochondrijų morfologijos reguliavimą bei šių mechanizmų išaiškinimo iššūkius. Norint tirti genų raišką, pirmiausia būtina nustatyti konkrečius taikinius genus tame pačiame signalo kelyje. Tačiau mūsų duomenys rodo, kad to paties signalo kelio genai į tą patį stresą nereaguoja vienodai. Iš tiesų, ankstesni tyrimai parodė, kad skirtingi to paties signalo kelio genai gali turėti skirtingus laiko atsako profilius30,46. Be to, yra sudėtingų potranskripcinių mechanizmų, kurie sutrikdo ryšį tarp transkripcijos ir genų funkcijos. Proteominiai tyrimai gali suteikti įžvalgų apie PTM ir baltymų funkcijos poveikį, tačiau jie taip pat kelia iššūkių, įskaitant mažo našumo metodus, didelį signalo ir triukšmo santykį bei prastą skiriamąją gebą.
Šiame kontekste mitochondrijų morfologijos tyrimas naudojant TEM ir MEL turi didelį potencialą atsakyti į esminius klausimus apie mitochondrijų dinamikos ir funkcijos ryšį ir kaip tai veikia ligas. Svarbiausia, kad TEM suteikia tiesioginį metodą mitochondrijų morfologijai matuoti kaip konvergentiniam mitochondrijų disfunkcijos ir dinamikos vertinamajam taškui51. MEL taip pat suteikia tiesioginį metodą dalijimosi ir susiliejimo įvykių vizualizavimui trimatėje ląstelinėje aplinkoje, leidžiantį kiekybiškai įvertinti dinaminį mitochondrijų remodeliavimą net ir nesant genų raiškos pokyčių33. Čia pabrėžiame mitochondrijų vaizdavimo metodų naudingumą gydant antrines mitochondrijų ligas. Šioms ligoms paprastai būdingas lėtinis lengvas metabolinis stresas, kuriam būdingas subtilus mitochondrijų tinklų remodeliavimas, o ne ūminis mitochondrijų pažeidimas. Tačiau mitochondrijų kompensacija, reikalinga mitozei palaikyti esant lėtiniam stresui, turi didelių funkcinių pasekmių. Neurologijos kontekste geresnis šių kompensacinių mechanizmų supratimas gali suteikti svarbios informacijos apie pleiotropinę neuropatologiją, susijusią su mitochondrijų disfunkcija.
Galiausiai, mūsų duomenys pabrėžia vaizdavimo metodų naudingumą suprantant sudėtingų genų ekspresijos, baltymų modifikacijų ir baltymų aktyvumo, kontroliuojančių neuronų mitochondrijų dinamiką, sąveikų funkcines pasekmes. Mes panaudojome PPA, kad modeliuotume mitochondrijų disfunkciją neuroninių ląstelių modelyje, kad gautume įžvalgų apie ASD mitochondrijų komponentą. PPA paveiktos SH-SY5Y ląstelės parodė mitochondrijų morfologijos pokyčius: mitochondrijos tapo mažos ir apvalios, o kristos buvo prastai apibrėžtos, stebint TEM. MEL analizė rodo, kad šie pokyčiai vyksta kartu su padidėjusiais dalijimosi ir susiliejimo įvykiais, siekiant palaikyti mitochondrijų tinklą reaguojant į lengvą metabolinį stresą. Be to, PPA reikšmingai sutrikdo mitochondrijų metabolizmo ir homeostazės transkripcijos reguliavimą. Mes nustatėme, kad cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 ir OPA1 yra pagrindiniai mitochondrijų reguliatoriai, kuriuos sutrikdo PPA stresas, ir kurie gali atlikti vaidmenį tarpininkaujant PPA sukeltiems mitochondrijų morfologijos ir funkcijos pokyčiams. Reikalingi būsimi tyrimai, siekiant geriau apibūdinti PPA sukeltus laiko genų ekspresijos ir baltymų aktyvumo, lokalizacijos ir potransliacinių modifikacijų pokyčius. Mūsų duomenys pabrėžia mitochondrijų streso atsaką reguliuojančių mechanizmų sudėtingumą ir tarpusavio priklausomybę bei parodo TEM ir kitų vaizdavimo metodų naudingumą tikslingesniems mechanistiniams tyrimams.
SH-SY5Y ląstelių linija (ECACC, 94030304-1VL) buvo įsigyta iš „Sigma-Aldrich“. SH-SY5Y ląstelės buvo auginamos Dulbecco modifikuotoje Eagle terpėje/F-12 maistinių medžiagų mišinyje (DMEM/F-12) ir L-glutaminu (SC09411, „ScienCell“) 25 cm2 talpos kolbose, papildytose 20 % vaisiaus galvijų serumu (FBS) (10493106, „ThermoFisher Scientific“) ir 1 % penicilino-streptomicino (P4333-20ML, „Sigma-Aldrich“), 37 °C temperatūroje, 5 % CO2 atmosferoje. Ląstelės buvo subkultivuojamos iki 80 % susiliejimo naudojant 0,05 % tripsino-EDTA (15400054, „ThermoFisher Scientific“), centrifuguojamos 300 g greičiu ir pasėjamos maždaug 7 × 105 ląstelių/ml tankiu. Visi eksperimentai buvo atlikti su nediferencijuotomis SH-SY5Y ląstelėmis tarp 19–22 pasažų. PPA įvedamas kaip NaP. NaP miltelius (CAS Nr. 137-40-6, cheminė formulė C3H5NaO2, P5436-100G, „Sigma-Aldrich“) ištirpinkite šiltame MilliQ vandenyje iki 1 M koncentracijos ir laikykite 4 °C temperatūroje. Gydymo dieną šį tirpalą praskieskite 1 M PPA iki 3 mM ir 5 mM PPA serumo neturinčioje terpėje (DMEM/F-12 su L-glutaminu). Visų eksperimentų apdorojimo koncentracijos buvo be PPA (0 mM, kontrolė), 3 mM ir 5 mM PPA. Eksperimentai buvo atlikti bent trijuose biologiniuose pakartojimuose.
SH-SY5Y ląstelės buvo pasėtos į 25 cm5 talpos kolbas 5,5 × 105 ląstelių/ml greičiu ir auginamos 24 valandas. PPA apdorojimas buvo atliktas į kolbą prieš 24 valandų inkubaciją. Ląstelių granulės buvo surenkamos laikantis įprastų žinduolių audinių subkultūros protokolų (aprašytų aukščiau). Ląstelių granulės buvo resuspenduojamos 100 µl 2,5 % glutaraldehido, 1 × PBS tirpale ir laikomos 4 °C temperatūroje iki apdorojimo. SH-SY5Y ląstelės buvo trumpai centrifuguotos, kad susidarytų ląstelių granulės ir būtų pašalintas 2,5 % glutaraldehido, 1 × PBS tirpalas. Nuosėdos buvo resuspenduojamos 4 % agarozės gelyje, paruoštame distiliuotame vandenyje (agarozės ir nuosėdų tūrio santykis yra 1:1). Agarozės gabalėliai buvo sudėti ant grotelių plokščiose plokštelėse ir padengti 1-heksadecenu prieš užšaldymą aukštame slėgyje. Mėginiai buvo užšaldyti 100 % sausame acetone -90 °C temperatūroje 24 valandas. Tada temperatūra buvo pakelta iki -80 °C ir pridėta 1 % osmio tetroksido ir 0,1 % glutaraldehido tirpalo. Mėginiai buvo laikomi -80 °C temperatūroje 24 valandas. Po to temperatūra per kelias dienas buvo palaipsniui didinama iki kambario temperatūros: nuo –80 °C iki –50 °C 24 valandoms, iki –30 °C 24 valandoms, iki –10 °C 24 valandoms ir galiausiai iki kambario temperatūros.
Po kriogeninio paruošimo mėginiai buvo impregnuoti derva ir naudojant „Leica Reichert UltracutS“ ultramikrotomą („Leica Microsystems“) pagaminti itin ploni pjūviai (∼100 nm). Pjūviai buvo dažomi 2 % uranilo acetatu ir švino citratu. Mėginiai buvo stebimi naudojant FEI Tecnai 20 transmisinį elektroninį mikroskopą („ThermoFisher“ (anksčiau „FEI“), Eindhovenas, Nyderlandai), veikiantį 200 kV įtampa (Lab6 siųstuvas), ir „Gatan“ CCD kamerą („Gatan“, JK) su „Tridiem“ energijos filtru.
Kiekviename techniniame pakartojime buvo gauti bent 24 vienos ląstelės vaizdai, iš viso 266 vaizdai. Visi vaizdai buvo analizuojami naudojant dominančios srities (ROI) makrokomandą ir mitochondrijų makrokomandą. Mitochondrijų makrokomanda pagrįsta paskelbtais metodais17,31,32 ir leidžia pusiau automatizuoti TEM vaizdų paketinį apdorojimą programoje „Fiji/ImageJ69“. Trumpai tariant: vaizdas invertuojamas ir apverčiamas naudojant riedančio rutulio fono atimtį (60 pikselių spindulys) ir FFT juostinį filtrą (naudojant atitinkamai 60 ir 8 pikselių viršutinę ir apatinę ribas) bei vertikalių linijų slopinimą su 5 % orientacijos tolerancija. Apdorotas vaizdas automatiškai slenkamas naudojant maksimalios entropijos algoritmą ir generuojama dvejetainė kaukė. Buvo išskirti vaizdo regionai, susieti su rankiniu būdu pasirinktomis ROI neapdorotuose TEM vaizduose, apibūdinant mitochondrijas ir neįtraukiant plazminės membranos bei kitų didelio kontrasto regionų. Kiekvienai išskirtai IG buvo analizuojamos didesnės nei 600 pikselių dvejetainės dalelės, o dalelių plotas, perimetras, pagrindinė ir šalutinė ašys, Fereto skersmuo, apvalumas ir apskritumas buvo išmatuoti naudojant integruotas „Fiji/ImageJ“ matavimo funkcijas. Remiantis Merrill, Flippo ir Strack (2017), iš šių duomenų buvo apskaičiuotas 2 plotas, dalelių kraštinių santykis (pagrindinės ir šalutinės ašių santykis) ir formos koeficientas (FF), kur FF = perimetras 2/4π x plotas. Parametrinės formulės apibrėžimą galima rasti Merrill, Flippo ir Strack (2017). Minėtos makrokomandos yra prieinamos „GitHub“ (žr. Duomenų prieinamumo pareiškimą). Vidutiniškai po kiekvieno PPA apdorojimo buvo išanalizuota maždaug 5600 dalelių, iš viso maždaug 17 000 dalelių (duomenys nepateikti).
SH-SH5Y ląstelės buvo dedamos į 8 kamerų kultūros lėkšteles („ThermoFisher“, #155411), kad ląstelės sukibtų per naktį, ir po to inkubuojamos su TMRE 1:1000 („ThermoFisher“, #T669) ir Hoechst 33342 1:200 („Sigma-Aldrich“, H6024). Dažymas. Vaizdai buvo gauti naudojant 405 nm ir 561 nm lazerius 10 min. aplinkoje, o neapdoroti vaizdai buvo gauti kaip z formos rinkiniai, kuriuose buvo 10 vaizdų mikrografijų su 0,2 μm az žingsniu tarp vaizdo kadrų 12 iš eilės einančių laiko taškų. Vaizdai buvo surinkti naudojant „Carl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1“ itin didelės raiškos platformą („Carl Zeiss“, Oberkochenas, Vokietija) su LCI Plan Apochromate 100x/1.4 Oil DIC M27 lęšiu. Vaizdai buvo analizuojami „ImageJ“ programoje, naudojant anksčiau aprašytą srautą ir „ImageJ“ papildinį, siekiant išmatuoti susiliejimo ir dalijimosi įvykius, vidutinį mitochondrijų struktūrų skaičių ir vidutinį mitochondrijų tūrį vienoje ląstelėje33. MEL makrokomandos pasiekiamos „GitHub“ (žr. Duomenų prieinamumo pareiškimą).
SH-SY5Y ląstelės buvo auginamos šešių šulinėlių plokštelėse, kurių tankis buvo 0,3 × 106 ląstelių/ml, 24 valandas prieš apdorojimą. RNR buvo išskirta naudojant „Quick-RNA™ Miniprep“ protokolą (ZR R1055, „Zymo Research“) su nedideliais pakeitimais: prieš išimant į kiekvieną šulinėlį, įpilama 300 μl RNR lizės buferio ir kiekvienas mėginys lizuojamas paskutiniame etape 30 μl DNazės/RNazės eliucijos vandens. Visų mėginių kiekis ir kokybė buvo patikrinti naudojant „NanoDrop ND-1000 UV-Vis“ spektrofotometrą. Bendras baltymų kiekis iš ląstelių lizatų buvo gautas naudojant 200 μl RIPA lizės buferio, o baltymų koncentracija buvo kiekybiškai įvertinta naudojant Bradfordo baltymų tyrimą70.
kDNR sintezė buvo atlikta naudojant „Tetro™ cDNA Synthesis Kit“ (BIO-65043, „Meridian Bioscience“) pagal gamintojo instrukcijas su tam tikrais pakeitimais. kDNR buvo susintetinta 20 μl reakcijose, naudojant 0,7–1 μg bendros RNR. Pradmenys buvo parinkti iš anksčiau paskelbtų straipsnių 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 (S1 lentelė), o pridedami zondai buvo sukurti naudojant „Integrated DNA Technologies“ įrankį „PrimerQuest“. Visi dominantys genai buvo normalizuoti pagal branduolinį B2M geną. STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC ir OPA1 genų raiška buvo matuojama RT-kPGR. Į pagrindinį mišinį buvo įtraukta LUNA Taq polimerazė (M3003L, „New England Biolabs“), 10 μM tiesioginiai ir atvirkštiniai pradmenys, kDNR ir PGR klasės vanduo, kad kiekvienos reakcijos galutinis tūris būtų 10 μL. Dalijimosi ir dalijimosi genų (DRP1, MFN1/2) raiška buvo matuojama naudojant TaqMan multipleksinius tyrimus. „Luna Universal Probe qPCR Master Mix“ (M3004S, „New England Biolabs“) buvo naudojamas pagal gamintojo instrukcijas su nedideliais pakeitimais. Multipleksinį RT-qPCR pagrindinį mišinį sudaro 1X LUNA Taq polimerazė, 10 μM tiesioginiai ir atvirkštiniai pradmenys, 10 μM zondas, kDNR ir PGR klasės vanduo, todėl kiekvienos reakcijos galutinis tūris yra 20 μL. RT-kDNR buvo atlikta naudojant „Rotor-Gene Q 6-plex“ (QIAGEN RG – serijos numeris: R0618110). Ciklo sąlygos pateiktos S1 lentelėje. Visi kDNR mėginiai buvo amplifikuoti trimis egzemplioriais, o standartinė kreivė buvo sudaryta naudojant dešimteriopų skiedimų seriją. Trijų mėginių išskirtys, kurių ciklo slenksčio standartinis nuokrypis (Ct) >0,5, buvo pašalintos iš analizės, siekiant užtikrinti duomenų atkuriamumą30,72. Santykinė genų raiška buvo apskaičiuota naudojant 2-ΔΔCt79 metodą.
Baltymų mėginiai (60 μg) buvo sumaišyti su Laemmli įkrovimo buferiu santykiu 2:1 ir analizuoti 12 % bespalviame baltymų gelyje („Bio-Rad“ #1610184). Baltymai buvo perkelti ant PVDF (polivinilidenfluorido) membranos (#170-84156, „Bio-Rad“) naudojant „Trans-Blot Turbo“ sistemą (#170-4155, „Bio-Rad“). Membrana buvo blokuojama ir 48 valandas inkubuojama su atitinkamais pirminiais antikūnais (OPA1, MFN1, MFN2 ir DRP1) (praskiedimais santykiu 1:1000), po to 1 valandą inkubuojama su antriniais antikūnais (1:10 000). Tada membranos buvo vaizduojamos naudojant „Clarity Western ECL Substrate“ (#170-5061, „Bio-Rad“) ir registruojamos naudojant „Bio-Rad ChemiDoc MP“ sistemą. Western blot analizei buvo naudojama „ImageLab 6.1“ versija. Originalus gelis ir blotas parodyti S1 paveiksle. Informacija apie antikūnus pateikta S2 lentelėje.
Duomenų rinkiniai pateikiami kaip bent trijų nepriklausomų imčių vidurkis ir vidurkio standartinė paklaida (SEM). Duomenų rinkinių normalumas buvo patikrintas naudojant Shapiro-Wilks testą (jei nenurodyta kitaip), prieš darant prielaidą apie Gauso skirstinį ir vienodus standartinius nuokrypius bei tęsiant analizę. Be to, duomenų rinkinio analizė buvo atlikta naudojant Fisher'o MEL LSD (p < 0,05), vienfaktorinę ANOVA (gydymo ir kontrolės vidurkis) ir Dunnett'o daugybinių palyginimų testą reikšmingumui nustatyti (p < 0,05). Grafike reikšmingos p reikšmės parodytos kaip *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Visos statistinės analizės ir grafikai buvo atlikti ir sugeneruoti naudojant GraphPad Prism 9.4.0.
„Fiji/ImageJ“ makrokomandos TEM vaizdų analizei yra viešai prieinamos „GitHub“: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. Mitochondrijų įvykių lokatoriaus (MEL) makrokomanda yra viešai prieinama „GitHub“: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
Meiliana A., Devi NM ir Vijaya A. Mitochondrijos: pagrindiniai metabolizmo, homeostazės, streso, senėjimo ir epigenetikos reguliatoriai. Indoneziečių kalba. Biomedical Science. J. 13, 221–241 (2021).
Ben-Shachar, D. Daugiaplanė mitochondrijų disfunkcija sergant šizofrenija, I kompleksas kaip galimas patologinis taikinys. Šizofrenija. šaltinis. 187, 3–10 (2017).
Bose, A. ir Beal, MF. Mitochondrijų disfunkcija sergant Parkinsono liga. J. Neurochemistry. 139, 216–231 (2016).
Sharma VK, Singh TG ir Mehta V. Stresinės mitochondrijos: invazijos taikiniai Alzheimerio ligos atveju. Mitochondria 59, 48–57 (2021).
Belenguer P., Duarte JMN, Shook PF ir Ferreira GK Mitochondrijos ir smegenys: bioenergetika ir kita. Neurotoksinai. šaltinis. 36, 219–238 (2019).
Rangaraju, V. ir kt. Pleiotropinės mitochondrijos: mitochondrijų poveikis neuronų vystymuisi ir ligoms. J. Neuroscience. 39, 8200–8208 (2019).
Cardaño-Ramos, C. ir Morais, VA. Mitochondrijų biogenezė neuronuose: kaip ir kur. Tarptautiniškumas. J. Mohr. The science. 22, 13059 (2021).
Yu, R., Lendahl, U., Nister, M. ir Zhao, J. Žinduolių mitochondrijų dinamikos reguliavimas: galimybės ir iššūkiai. front. endokrininė sistema. (Lausanne) 11, 374 (2020).
Khacho, M. ir Slack, RS. Mitochondrijų dinamika neurogenezės reguliavime: nuo besivystančių iki suaugusių smegenų. development. dynamic. 247, 47–53 (2018).