Dabartinis *Dabartinis adresas: Kelnas 50931, Vokietija, Kelno kompetencijos klasteris „Tyrimai ląstelių streso atsako srityje senėjimo metu“ (CECAD).
Mitochondrijų ligų neurodegeneracija laikoma negrįžtama, nes neuronų metabolinis plastiškumas yra ribotas, tačiau mitochondrijų disfunkcijos poveikis ląstelių autonomijai neuronų metabolizme organizme yra menkai suprantamas. Čia pristatome Purkinje neuronų, kuriems progresuoja OXPHOS trūkumas, kurį sukelia sutrikusi mitochondrijų susiliejimo dinamika, ląstelėms būdingą proteomą. Nustatėme, kad mitochondrijų disfunkcija sukėlė esminius pokyčius proteomikos srityje, kurie galiausiai lėmė tikslių metabolinių programų nuoseklų aktyvavimą prieš ląstelės mirtį. Netikėtai nustatėme akivaizdžią piruvato karboksilazės (PCx) ir kitų senėjimą stabdančių fermentų, kurie papildo TCA ciklo tarpinius produktus, indukciją. PCx slopinimas sustiprino oksidacinį stresą ir neurodegeneraciją, o tai rodo, kad aterosklerozė turi apsauginį poveikį neuronams, kuriems trūksta OXPHOS. Mitochondrijų susiliejimo atkūrimas galutinai degeneravusiuose neuronuose visiškai panaikina šias metabolines savybes, taip užkertant kelią ląstelių mirtims. Mūsų išvados nustato anksčiau nežinomus kelius, kurie suteikia atsparumą mitochondrijų disfunkcijai, ir rodo, kad neurodegeneraciją galima panaikinti net ir vėlyvose ligos stadijose.
Centrinį mitochondrijų vaidmenį palaikant neuronų energijos metabolizmą pabrėžia platūs neurologiniai simptomai, susiję su žmogaus mitochondrijų ligomis. Daugelį šių ligų sukelia genų mutacijos, reguliuojančios mitochondrijų genų ekspresiją (1, 2), arba genų destruktija, susijusi su mitochondrijų dinamika, kuri netiesiogiai veikia mitochondrijų DNR (mtDNR) stabilumą (3, 4). Tyrimai su gyvūnų modeliais parodė, kad reaguojant į mitochondrijų disfunkciją aplinkiniuose audiniuose, gali būti aktyvuojami konservatyvūs metaboliniai keliai (5–7), o tai suteikia svarbios informacijos norint išsamiai suprasti šių sudėtingų ligų patogenezę. Priešingai, mūsų supratimas apie specifinių ląstelių tipų metabolinius pokyčius, kuriuos sukelia bendras smegenų mitochondrijų adenozino trifosfato (ATP) gamybos sutrikimas, yra labai svarbus (8), pabrėžiant poreikį nustatyti terapinius taikinius, kurie gali būti naudojami ligų prevencijai arba prevencijai. Neurodegeneracijos prevencija (9). Informacijos trūkumas yra tas, kad nervinės ląstelės plačiai laikomos turinčiomis labai ribotą metabolinį lankstumą, palyginti su aplinkinių audinių ląstelių tipais (10). Atsižvelgiant į tai, kad šios ląstelės atlieka pagrindinį vaidmenį koordinuojant metabolitų tiekimą neuronams, siekiant skatinti sinapsinį perdavimą ir reaguoti į sužalojimus bei ligas, gebėjimas pritaikyti ląstelių metabolizmą prie sudėtingų smegenų audinio sąlygų yra beveik ribotas – jį geba tik glijos ląstelės (11–14). Be to, įgimtas smegenų audinio ląstelių heterogeniškumas labai trukdo tirti metabolinius pokyčius, vykstančius specifiniuose neuronų pogrupiuose. Todėl mažai žinoma apie tikslias mitochondrijų disfunkcijos ląstelines ir metabolines pasekmes neuronuose.
Siekdami suprasti mitochondrijų disfunkcijos metabolines pasekmes, išskyrėme Purkinje neuronus (PN) skirtingose ​​neurodegeneracijos stadijose, kurias sukelia mitochondrijų išorinės membranos susiliejimo (Mfn2) irimas. Nors Mfn2 mutacijos žmonėms yra susijusios su paveldima motorine sensorine neuropatija, žinoma kaip Charcot-Marie-Tooth 2A tipo (15), sąlyginis Mfn2 sunaikinimas pelėms yra gerai žinomas oksidacijos fosforilinimo (OXPHOS) disfunkcijos indukcijos metodas. Įvairūs neuronų potipiai (16–19) ir dėl to atsiradęs neurodegeneracinis fenotipas lydimi progresuojančių neurologinių simptomų, tokių kaip judėjimo sutrikimai (18, 19) arba smegenėlių ataksija (16). Naudodami kiekybinių be žymėjimo (LFQ) proteomikos, metabolomikos, vaizdinimo ir virusologinių metodų derinį, parodome, kad progresuojanti neurodegeneracija stipriai indukuoja piruvato karboksilazę (PCx) ir kitus veiksnius, susijusius su PN arterioskleroze in vivo, fermentų ekspresiją. Siekdami patikrinti šio atradimo aktualumą, mes specialiai sumažinome PCx ekspresiją Mfn2 stokojančiose PN ir nustatėme, kad ši operacija sustiprino oksidacinį stresą ir pagreitino neurodegeneraciją, taip įrodydama, kad azoospermija suteikia ląstelių mirčiai metabolinį prisitaikymą. Didelė MFN2 ekspresija gali visiškai išgelbėti terminalinę degeneracinę PN, turinčią didelį OXPHOS trūkumą, didžiulį mitochondrijų DNR sunaudojimą ir, matyt, pažeistą mitochondrijų tinklą, o tai dar labiau pabrėžia, kad ši neurodegeneracijos forma gali atsigauti net ir pažengusioje ligos stadijoje prieš ląstelių mirtį.
Siekdami vizualizuoti mitochondrijas Mfn2 išjungimo baltymo (PN) ląstelėse, panaudojome pelių kamieną, kuris leidžia nuo Cre priklausomoms mitochondrijoms nukreipti dėmesį į geltonojo fluorescencinio baltymo (YFP) (mtYFP) (20) Cre raišką, ir patikrinome mitochondrijų morfologiją in vivo. Nustatėme, kad Mfn2 geno sunaikinimas PN ląstelėse lemtų laipsnišką mitochondrijų tinklo dalijimąsi (S1A pav.), o ankstyviausias pokytis buvo nustatytas 3 savaičių amžiaus. Priešingai, reikšmingas PN ląstelių sluoksnio degeneravimas, kurį rodo Kalbindino imunodažymo praradimas, prasidėjo tik 12 savaičių amžiaus (1, A ir B pav.). Laiko neatitikimas tarp ankstyviausių mitochondrijų morfologijos pokyčių ir matomos neuronų mirties pradžios paskatino mus ištirti mitochondrijų disfunkcijos sukeltus metabolinius pokyčius prieš ląstelių mirtį. Sukūrėme fluorescencijos aktyvuoto ląstelių rūšiavimo (FACS) strategiją, skirtą YFP (YFP+) ekspresuojančioms PN (1C pav.) išskirti kontrolinėse pelėse (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP: : L7-cre), toliau vadinamose CTRL (S1B pav.). Optimizavus valdymo strategiją, pagrįstą santykiniu YFP signalo intensyvumu, galime išvalyti PN YFP+ kūną (YFPhigh) iš ne PN (YFPneg) (S1B pav.) arba galimų fluorescencinių aksonų/dendritinių fragmentų (YFPlow; S1D pav., kairėje), patvirtintų konfokaliniu mikroskopu (S1D pav., dešinėje). Siekdami patikrinti klasifikuojamos populiacijos tapatybę, atlikome LFQ proteomiką ir pagrindinių komponentų analizę ir nustatėme, kad yra aiškus skirtumas tarp YFPhigh ir YFPneg ląstelių (S1C pav.). YFPhigh ląstelėse buvo pastebėtas žinomų PN žymenų (pvz., Calb1, Pcp2, Grid2 ir Itpr3) grynasis praturtėjimas (21, 22), tačiau nebuvo pastebėtas baltymų, paprastai ekspresuojamų neuronuose ar kituose ląstelių tipuose, praturtėjimas (1D pav.). Palyginus klasifikuotų YFPhigh ląstelių, surinktų nepriklausomuose eksperimentuose, mėginius, koreliacijos koeficientas buvo > 0,9, o tai rodo gerą biologinių pakartojamumą (S1E pav.). Apibendrinant, šie duomenys patvirtino mūsų planą ūmiai ir specifinei įmanomų PN izoliacijai. Kadangi naudojama L7-cre tvarkyklės sistema sukelia mozaikinę rekombinaciją pirmąją savaitę po gimdymo (23), pradėjome atskirti peles nuo CTRL ir sąlyginai (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) rinkti neuronus. Baigus rekombinaciją, 4 savaičių amžiaus ji vadinama Mfn2cKO. Kaip galutinį tašką pasirinkome 8 savaičių amžių, kai PN sluoksnis buvo nepažeistas, nepaisant akivaizdžios mitochondrijų fragmentacijos (1B pav. ir S1A pav.). Iš viso kiekybiškai įvertinome 3013 baltymų, iš kurių apie 22 % buvo pagrįsti MitoCarta 2.0 anotacijomis, pagrįstomis mitochondrijų proteomu kaip mitochondrijomis (1E pav.) (24). 8 savaitę atlikta diferencinė genų raiškos analizė parodė, kad tik 10,5 % visų baltymų turėjo reikšmingų pokyčių (1F pav. ir S1F pav.), iš kurių 195 baltymų raiška buvo sumažinta, o 120 baltymų – padidinta (1F pav.). Verta paminėti, kad šio duomenų rinkinio „novatoriškos metabolinės raiškos analizė“ rodo, kad skirtingai ekspresuojami genai daugiausia priklauso ribotam specifinių metabolinių jungčių rinkiniui (1G pav.). Įdomu tai, kad nors su OXPHOS ir kalcio signalizacija susijusių jungčių sumažėjusi reguliacija patvirtina mitochondrijų disfunkcijos atsiradimą PN, kitos kategorijos, kurios daugiausia susijusios su aminorūgščių metabolizmu, yra reikšmingai padidintos, o tai atitinka mitochondrijų PN vykstančią metabolizmą. Persijungimas yra nuoseklus.
(A) CTRL ir Mfn2cKO pelių smegenėlių pjūvių reprezentatyvios konfokalinės nuotraukos, rodančios progresuojantį PN nykimą (kalbindinas, pilkas); branduoliai buvo kontrastingai dažyti DAPI. (B) (A) kiekybinis įvertinimas (vienpusė dispersijos analizė, ***P<0,001; n = 4–6 apskritimai iš trijų pelių). (C) Eksperimentinė darbo eiga. (D) Purkinje (viršuje) ir kitų ląstelių tipų (viduryje) specifinių žymenų šilumos žemėlapio pasiskirstymas. (E) Venno diagrama, rodanti klasifikuojamoje PN nustatytų mitochondrijų baltymų skaičių. (F) Diferencijuotai ekspresuotų baltymų ugnikalnio diagrama Mfn2cKO neuronuose po 8 savaičių (reikšmingumo ribinė vertė 1,3). (G) Kūrybiškumo kelio analizė rodo penkis svarbiausius Mfn2cKO PN, klasifikuojamoje kaip 8 savaitės, padidėjusios reguliacijos (raudona) ir mažesnės reguliacijos (mėlyna) kelius. Rodomas kiekvieno aptikto baltymo vidutinis ekspresijos lygis. Pilkos spalvos šilumos žemėlapis: pakoreguota P vertė. ns, nesvarbu.
Proteomikos duomenys parodė, kad I, III ir IV kompleksų baltymų raiška palaipsniui mažėjo. I, III ir IV kompleksuose buvo esminiai mtDNR koduojami subvienetai, o II kompleksas, kuris buvo koduojamas tik branduolyje, iš esmės nepakito (2A ir S2A pav.). . Remiantis proteomikos rezultatais, smegenėlių audinių pjūvių imunohistochemija parodė, kad IV komplekso MTCO1 (mitochondrijų citochromo C oksidazės 1 subvieneto) subvieneto lygis PN palaipsniui mažėjo (2B pav.). MtDNR koduojamas Mtatp8 subvienetas buvo reikšmingai sumažintas (S2A pav.), o branduolyje koduojamo ATP sintazės subvieneto pastovios būsenos lygis išliko nepakitęs, o tai atitinka žinomą stabilų ATP sintazės subvieneto F1 kompleksą, kai mtDNR raiška yra stabili. Formavimasis yra nuoseklus. Pertrauka (7). mtDNR lygio įvertinimas surūšiuotuose Mfn2cKO PN naudojant realaus laiko polimerazės grandininę reakciją (kPGR) patvirtino laipsnišką mtDNR kopijų skaičiaus mažėjimą. Palyginti su kontroline grupe, 8 savaičių amžiaus buvo išsaugota tik apie 20 % mtDNR lygio (2C pav.). Remiantis šiais rezultatais, DNR aptikimui buvo naudojamas Mfn2cKO PN konfokalinės mikroskopijos dažymas, rodantis nuo laiko priklausomą mitochondrijų nukleotidų sunaudojimą (2D pav.). Nustatėme, kad tik kai kurių kandidatų, dalyvaujančių mitochondrijų baltymų skaidyme ir streso atsake, ekspresija buvo padidėjusi, įskaitant Lonp1, Afg3l2 ir Clpx, bei OXPHOS komplekso surinkimo faktorius. Reikšmingų apoptozėje dalyvaujančių baltymų kiekio pokyčių nenustatyta (S2B pav.). Panašiai nustatėme, kad mitochondrijose ir endoplazminio tinklo kanaluose, dalyvaujančiuose kalcio pernašoje, pokyčiai yra tik nedideli (S2C pav.). Be to, vertinant su autofagija susijusius baltymus, reikšmingų pokyčių nerasta, o tai atitinka matomą autofagosomų indukciją, stebėtą in vivo imunohistochemijos ir elektroninės mikroskopijos metodais (S3 pav.). Tačiau progresuojanti OXPHOS disfunkcija PN yra lydima akivaizdžių ultrastruktūrinių mitochondrijų pokyčių. Mitochondrijų sankaupos matomos 5 ir 8 savaičių amžiaus Mfn2cKO PN ląstelių kūnuose ir dendritiniuose medžiuose, o vidinė membranos struktūra smarkiai pasikeitė (S4, A ir B paveikslai). Atsižvelgiant į šiuos ultrastruktūrinius pokyčius ir reikšmingą mtDNR sumažėjimą, ūminių smegenų smegenėlių pjūvių analizė su tetrametilrodamino metilo esteriu (TMRM) parodė, kad Mfn2cKO PN mitochondrijų membranos potencialas buvo reikšmingai sumažėjęs (S4C paveikslas).
(A) OXPHOS komplekso raiškos lygio laiko eigos analizė. Atsižvelkite tik į baltymus, kurių P < 0,05 po 8 savaičių (dvipusė ANOVA). Punktyrinė linija: Be koregavimo, palyginti su CTRL. (B) Kairėje: smegenėlių pjūvio, pažymėto anti-MTCO1 antikūnu, pavyzdys (mastelio juosta, 20 μm). Purkinje ląstelių kūnų užimamas plotas padengtas geltona spalva. Dešinėje: MTCO1 lygių kiekybinis įvertinimas (vienpusė dispersinė analizė; n = 7–20 ląstelių, ištirtų iš trijų pelių). (C) mtDNR kopijų skaičiaus rūšiuotame PN kPGR analizė (vienpusė dispersinė analizė; n = 3–7 pelės). (D) Kairėje: smegenėlių pjūvio, pažymėto anti-DNR antikūnu, pavyzdys (mastelio juosta, 20 μm). Purkinje ląstelių kūnų užimamas plotas padengtas geltona spalva. Dešinėje: mtDNR pažeidimų kiekybinis įvertinimas (vienpusė dispersinė analizė; n = 5–9 ląstelės iš trijų pelių). (E) Ūminio smegenėlių pjūvio pavyzdys, rodantis mitoYFP + Purkinje ląsteles (rodyklė) visos ląstelės lopo spaustuko įraše. (F) IV kreivės kiekybinis įvertinimas. (G) Tipiniai depoliarizuojančios srovės injekcijos įrašai CTRL ir Mfn2cKO Purkinje ląstelėse. Viršutinis kreivė: pirmasis impulsas, sukėlusis AP. Apatinis kreivė: maksimalus AP dažnis. (H) Postsinapsinių spontaninių įėjimų (sPSP) kiekybinis įvertinimas. Tipinis įrašymo kreivė ir jos priartinimo santykis parodyti (I). Vienpusė dispersinė analizė, analizuota n = 5–20 ląstelių iš trijų pelių. Duomenys išreikšti kaip vidurkis ± SEM; *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001. (J) Tipiniai spontaninės AP kreivės, užfiksuotos naudojant perforuoto lopo spaustuko režimą. Viršutinis kreivė: maksimalus AP dažnis. Apatinis kreivė: vienos AP priartinimas. (K) Kiekybiškai įvertinkite vidutinį ir maksimalų AP dažnį pagal (J). Mann-Whitney testas; n = 5 ląstelės buvo analizuojamos iš keturių pelių. Duomenys išreikšti kaip vidurkis ± SEM; nesvarbu.
8 savaičių amžiaus Mfn2cKO PN buvo aptiktas akivaizdus OXPHOS pažeidimas, rodantis, kad neuronų fiziologinė funkcija yra labai sutrikusi. Todėl 4–5 ir 7–8 savaičių amžiaus analizavome OXPHOS stokojančių neuronų pasyvias elektrines charakteristikas, atlikdami viso ląstelių lopo spaustuko įrašus ūminiuose smegenėlių pjūviuose (2E pav.). Netikėtai, vidutinis Mfn2cKO neuronų ramybės būsenos membranos potencialas ir įėjimo varža buvo panašūs į kontrolinės grupės, nors tarp ląstelių buvo nedidelių skirtumų (1 lentelė). Panašiai, 4–5 savaičių amžiaus, reikšmingų srovės ir įtampos santykio (IV kreivės) pokyčių nerasta (2F pav.). Tačiau nė vienas 7–8 savaičių amžiaus Mfn2cKO neuronas neišgyveno IV režimo (hiperpolarizacijos etapo), o tai rodo, kad šiame vėlyvame etape yra aiškus jautrumas hiperpolarizacijos potencialui. Priešingai, Mfn2cKO neuronuose depoliarizuojančios srovės, sukeliančios pasikartojančius veikimo potencialo (VP) iškrovimus, yra gerai toleruojamos, o tai rodo, kad jų bendri iškrovų modeliai reikšmingai nesiskiria nuo 8 savaičių amžiaus kontrolinių neuronų (1 lentelė ir 2G pav.). Panašiai, savaiminių posinapsinių srovių (sPSC) dažnis ir amplitudė buvo panašūs į kontrolinės grupės, o įvykių dažnis padidėjo nuo 4 savaičių iki 5 savaičių, 7 savaičių iki 8 savaičių su panašiu padidėjimu (2 pav., H ir I). Sinapsinio brendimo laikotarpis PN neuronuose (25). Panašūs rezultatai gauti po perforuotų PN lopo. Ši konfigūracija neleidžia kompensuoti ląstelių ATP defektų, kaip gali atsitikti registruojant visos ląstelės lopo spaustuką. Visų pirma, Mfn2cKO neuronų ramybės membranos potencialas ir savaiminio sužadinimo dažnis nebuvo paveikti (2 pav., J ir K). Apibendrinant, šie rezultatai rodo, kad PN, turintys akivaizdžią OXPHOS disfunkciją, gali gerai susidoroti su aukšto dažnio iškrovų modeliais, o tai rodo, kad egzistuoja kompensavimo mechanizmas, leidžiantis jiems palaikyti beveik normalius elektrofiziologinius atsakus.
Duomenys pateikiami kaip vidurkis ± SEM (vienfaktorinė dispersinė analizė, Holmo ir Sidako daugybinių palyginimų testas; *P < 0,05). Vieneto numeris nurodytas skliausteliuose.
Mes siekėme ištirti, ar kuri nors proteomikos duomenų rinkinio kategorija (1G pav.) apima kelius, kurie gali neutralizuoti sunkų OXPHOS trūkumą, taip paaiškindami, kodėl paveikta PN gali išlaikyti beveik normalią elektrofiziologiją (2 pav., E–K). Proteomikos analizė parodė, kad fermentų, dalyvaujančių šakotosios grandinės aminorūgščių (BCAA) katabolizme, aktyvumas buvo reikšmingai padidėjęs (3A pav. ir S5A pav.), o galutinis produktas acetil-CoA (CoA) arba sukcinil-CoA gali papildyti trikarboksilatus arteriosklerozės rūgšties (TCA) cikle. Nustatėme, kad padidėjo BCAA transaminazės 1 (BCAT1) ir BCAT2 kiekis. Jie katalizuoja pirmąjį BCAA katabolizmo etapą, generuodami glutamatą iš α-ketoglutarato (26). Visi subvienetai, sudarantys šakotosios grandinės keto rūgšties dehidrogenazės (BCKD) kompleksą, yra suaktyvinami (kompleksas katalizuoja vėlesnį ir negrįžtamą gauto BCAA anglies skeleto dekarboksilinimą) (3A pav. ir S5A pav.). Vis dėlto išrūšiuotose PN ląstelėse akivaizdžių BCAA pokyčių nerasta, o tai gali būti dėl padidėjusio šių nepakeičiamųjų aminorūgščių pasisavinimo ląstelėse arba kitų šaltinių (gliukozės ar pieno rūgšties) naudojimo TCA ciklui papildyti (S5B pav.). PN ląstelėse, neturinčiose OXPHOS, 8 savaičių amžiuje taip pat buvo padidėjęs glutamino skaidymas ir transaminacijos aktyvumas, ką gali atspindėti mitochondrijų fermentų glutaminazės (GLS) ir glutamino piruvato transaminazės 2 (GPT2) padidėjimas (3 pav., A ir C). Verta paminėti, kad GLS padidėjimas apsiriboja splaisuota izoforma glutaminaze C (GLS-GAC) (Mfn2cKO/CTRL pokytis yra maždaug 4,5 karto, P = 0,05), o jos specifinis padidėjimas vėžio audiniuose gali palaikyti mitochondrijų bioenergiją. (27).
(A) Šilumos žemėlapis rodo baltymų lygio pokytį, padauginus kelis kartus, nurodytu būdu po 8 savaičių. (B) Smegenėlių pjūvio, pažymėto anti-PCx antikūnu, pavyzdys (mastelio juosta, 20 μm). Geltona rodyklė rodo Purkinje ląstelių kūną. (C) Laiko eigos baltymų raiškos analizė, nustatyta kaip svarbus aterosklerozės kandidatas (daugybinis t testas, *FDR <5%; n = 3-5 pelės). (D) Viršuje: schema, rodanti skirtingus [1-13C]piruvato žymeklyje esančios pažymėtos anglies patekimo būdus (t. y. per PDH arba transarterinį kelią). Apačioje: smuiko diagrama rodo vienkartinės pažymėtos anglies (M1), paverstos asparto rūgštimi, citrinų rūgštimi ir obuolių rūgštimi, procentą po ūminių smegenėlių pjūvių pažymėjimo [1-13C]piruvatu (porinis t testas; ** P <0,01). (E) Išsami nurodyto kelio laiko eigos analizė. Atsižvelkite tik į baltymus, kurių P < 0,05 po 8 savaičių. Punktyrinė linija: nėra koregavimo vertės (dvifaktorinė dispersinė analizė; * P < 0,05; *** P < 0,001). Duomenys pateikti kaip vidurkis ± SEM.
Mūsų analizėje nustatyta, kad BCAA katabolizmas tapo vienu iš pagrindinių padidėjusios reguliacijos būdų. Šis faktas rodo, kad ventiliacijos tūris, patenkantis į TCA ciklą, gali būti pakitęs PN, neturinčios OXPHOS. Tai gali būti pagrindinė neuronų metabolinio persitvarkymo forma, kuri gali turėti tiesioginės įtakos neuronų fiziologijai ir išgyvenimui esant sunkiai OXPHOS disfunkcijai. Remdamiesi šia hipoteze, nustatėme, kad pagrindinio antiaterosklerozės fermento PCx ekspresija yra padidėjusi (Mfn2cKO/CTRL pasikeičia maždaug 1,5 karto; 3A pav.), kuris katalizuoja piruvato virsmą oksaloacetatu (28), kuris, kaip manoma, yra smegenų audinyje. Ekspresija apsiriboja astrocitais (29, 30). Remiantis proteomikos rezultatais, konfokalinė mikroskopija parodė, kad PCx ekspresija buvo specifiškai ir reikšmingai padidėjusi OXPHOS neturinčiose PN, o PCx reaktyvumas daugiausia apsiribojo gretimomis Bergmano glijos ląstelėmis kontrolinėje grupėje (3B pav.). Norėdami funkciškai patikrinti pastebėtą PCx reguliacijos padidėjimą, ūminius smegenėlių griežinėlius paveikėme [1-13C]piruvato žymekliu. Kai piruvatas buvo oksiduojamas piruvato dehidrogenazės (PDH), jo izotopo žymuo išnyko, tačiau jis buvo įtrauktas į TCA ciklo tarpinius produktus, kai piruvatas metabolizuojamas kraujagyslių reakcijų būdu (3D pav.). Patvirtindami mūsų proteomikos duomenis, Mfn2cKO griežinėlių asparto rūgštyje pastebėjome daug šio žymeklio žymenų, o citrinų ir obuolių rūgščių kiekis taip pat turėjo vidutinę, nors ir nereikšmingą, tendenciją (3D pav.).
MitoPark pelių, kurių mitochondrijų disfunkciją sukėlė dopamino neuronai, specifiškai sunaikinantys mitochondrijų transkripcijos faktoriaus A geną (Tfam) (S6B pav.), dopamino neuronuose taip pat buvo reikšmingai padidėjusi PCx raiška (31), o tai rodo, kad acetono rūgšties arteriosklerozė. Ligos atsiradimas reguliuojamas esant neuronų OXPHOS disfunkcijai organizme. Verta paminėti, kad nustatyta, jog unikalūs fermentai (32–34), kurie gali būti ekspresuojami neuronuose, kurie gali būti susiję su arterioskleroze, yra reikšmingai padidinti PN, kuriuose trūksta OXPHOS, pavyzdžiui, propionil-CoA karboksilazė (PCC-A), malonil-CoA paverčia propionil-CoA į sukcinil-CoA, ir mitochondrijų obuolių fermentas 3 (ME3), kurio pagrindinis vaidmuo yra išskirti piruvatą iš malato (3, A ir C pav.) (33, 35). Be to, pastebėjome reikšmingą Pdk3 fermento, kuris fosforilina ir tokiu būdu inaktyvuoja PDH, padidėjimą (36), o Pdp1 fermente, kuris aktyvuoja PDH, ar pačiame PDH fermentų komplekse pokyčių aptikta nebuvo (3A pav.). Nuosekliai Mern2cKO PN ląstelėse sustiprėjo PDH komplekso piruvato dehidrogenazės E1 komponento α1 subvieneto α (PDHE1α) subvieneto fosforilinimas Ser293 padėtyje (žinoma, kad jis slopina PDH fermentų aktyvumą) (S6C pav.) (S6C pav.). Piruvatas neturi kraujagyslių prieigos.
Galiausiai, remiantis ataskaitomis, nustatėme, kad aktyvacijos proceso metu reikšmingai padidėja serino ir glicino biosintezės superkelias, susijęs mitochondrijų folatų (1C) ciklas ir prolino biosintezė (1G pav. ir S5C pav.). Aplinkiniai audiniai yra aktyvuojami esant mitochondrijų disfunkcijai (5–7). Šiuos proteomikos duomenis patvirtinanti konfokalinė analizė parodė, kad esant PN be OXPHOS, 8 savaičių amžiaus pelių smegenėlių pjūviams buvo taikoma serino hidroksimetiltransferazė 2 (SHMT2), pagrindinis mitochondrijų folatų ciklo fermentas. Reikšmingas imuninis atsakas (S5D pav.). 13 CU-gliukozės inkubuotų ūminių smegenėlių pjūvių metaboliniai sekimo eksperimentai dar kartą patvirtino serino ir prolino biosintezės padidėjimą, rodantį, kad padidėjo anglies izoformų srautas į seriną ir proliną (S5E pav.). Kadangi GLS ir GPT2 skatinamos reakcijos yra atsakingos už glutamato sintezę iš glutamino ir transamininimą tarp glutamato ir α-ketoglutarato, jų reguliacijos padidėjimas rodo, kad OXPHOS neturintiems neuronams yra padidėjęs glutamato poreikis. Tai gali būti skirta palaikyti padidėjusią prolino biosintezę (S5C pav.). Priešingai nei šie pokyčiai, PN specifinių Mfn2cKO pelių smegenėlių astrocitų proteominė analizė parodė, kad šių takų (įskaitant visas antiperoksidazes) raiška reikšmingai nepakito, o tai rodo, kad šis metabolinis peradresavimas yra selektyvus suskaidytam PN (S6 pav., D–G).
Apibendrinant, šios analizės atskleidė reikšmingai skirtingus specifinių metabolinių kelių aktyvavimo laike modelius PN. Nors nenormali neuronų mitochondrijų funkcija gali sukelti ankstyvą aterosklerozę ir 1C remodeliaciją (3E pav. ir S5C pav.) ir netgi nuspėjamus I ir IV kompleksų raiškos pokyčius, serino de novo sintezės pokyčiai yra tik OXPHOS disfunkcija (3E pav. ir S5C pav.). Šie duomenys apibrėžia nuoseklų procesą, kuriame streso sukeltos mitochondrijos (1C ciklas) ir citoplazma (serino biosintezė) sinergiškai reaguoja su aterosklerozės padidėjimu TCA cikle, kad pakeistų neuronų metabolizmą.
8 savaičių amžiaus OXPHOS neturinčios PN ląstelės gali palaikyti aukšto dažnio sužadinimo aktyvumą ir atlikti reikšmingą metabolinį atsistatymą, kad kompensuotų mitochondrijų disfunkciją. Šis atradimas kelia įdomią galimybę, kad net ir šiuo metu šios ląstelės gali gauti terapinę intervenciją, skirtą neurodegeneracijai atidėti arba užkirsti kelią. Šią galimybę išsprendėme taikydami dvi nepriklausomas intervencijas. Pirmuoju metodu sukūrėme nuo Cre priklausomą adenoviruso (AAV) vektorių, kad MFN2 galėtų būti selektyviai ekspresuojamas OXPHOS neturinčiose PN ląstelėse in vivo (S7A pav.). MFN2 koduojantis AAV ir fluorescencinis reporterinis genas mCherry (Mfn2-AAV) buvo patikrinti pirminėse neuronų kultūrose in vitro, o tai sukėlė MFN2 ekspresiją Cre priklausomu būdu ir atkūrė mitochondrijų morfologiją, taip užkertant kelią neuromutacijai Mfn2cKO neuronuose (S7, B, D ir E pav.). Toliau atlikome in vivo eksperimentus, stereotaksiškai perkeldami 8 savaičių amžiaus Mfn2-AAV į Mfn2cKO ir kontrolinių pelių smegenėlių žievę, ir išanalizavome 12 savaičių amžiaus peles (4A pav.). Gydytos Mfn2cKO pelės nugaišo (1, A ir B pav.) (16). Virusinė transdukcija in vivo lėmė selektyvią PN ekspresiją kai kuriuose smegenėlių žieduose (S7, G ir H pav.). Kontrolinio AAV, ekspresuojančio tik mCherry (Ctrl-AAV), injekcija neturėjo reikšmingo poveikio neurodegeneracijos laipsniui Mfn2cKO gyvūnams. Priešingai, Mfn2cKO, transdukuotų Mfn2-AAV, analizė parodė reikšmingą PN ląstelių sluoksnio apsauginį poveikį (4, B ir C pav.). Visų pirma, neuronų tankis beveik nesiskiria nuo kontrolinių gyvūnų (4, B ir C pav. bei S7, H ir I pav.). MFN1, bet ne MFN2, raiška yra vienodai veiksminga gelbėjant neuronų žūtį (4C pav. ir S7, C ir F pav.), o tai rodo, kad ektopinio MFN1 raiška gali veiksmingai kompensuoti MFN2 trūkumą. Tolesnė analizė vieno PN lygmenyje parodė, kad Mfn2-AAV iš esmės atstatė mitochondrijų ultrastruktūrą, normalizavo mtDNR lygius ir panaikino didelę antiangiogenezės žymens PCx ​​raišką (4 pav., C–E). Vizualiai patikrinus išgelbėtas Mfn2cKO peles ramybės būsenoje, paaiškėjo, kad jų laikysena ir motoriniai simptomai (judesiai S1–S3) pagerėjo. Apibendrinant, šie eksperimentai rodo, kad uždelstas MFN2 pakartotinis įvedimas į PN, kuriems labai trūksta OXPHOS, yra pakankamas, kad būtų panaikintas mtDNR sunaudojimas ir sukeltos aterosklerozės, taip užkertant kelią aksonų degeneracijai ir neuronų žūčiai in vivo.
(A) Schema, rodanti eksperimentinį AAV, koduojančio MFN2, injekcijos grafiką, kai aktyvuotas nurodytas metabolinis kelias. (B) Tipiniai 12 savaičių amžiaus smegenėlių pjūvių, transdukuotų 8 savaitę Mfn2cKO pelėms ir paženklintų anti-Calbindin antikūnu, konfokaliniai vaizdai. Dešinėje: aksonų skaidulų mastelio keitimas. Aksonų priartinimo skalė yra 450 ir 75 μm. (C) Kairėje: Purkinje ląstelių tankio kiekybinis įvertinimas AAV transdukcijos kilpoje (AAV+) (vienpusė dispersinė analizė; n = 3 pelės). Dešinėje: mtDNR fokusavimo analizė transdukuotoje PN 12 savaitę (nesuporuotas t-testas; n = 6 ląstelės iš trijų pelių). * P <0,05; ** P <0,01. (D) Tipinės Mfn2cKO smegenėlių pjūvių PN, transdukuotų nurodytais virusiniais vektoriais, transmisijos elektronų mikrografijos. Rožinė kaukė iliustruoja dendritų užimamą plotą, o geltonas punktyrinis kvadratas iliustruoja dešinėje pateiktą priartinimą; n žymi branduolį. Mastelio juosta, 1 μm. (E) rodo PCx dažymo PN, transdukuotos 12 savaitę, pavyzdį. Mastelio juosta, 20 μm. OE – perteklinė raiška; FC – pokytis kartoje.
Galiausiai, ištyrėme peroksidazės sukelto ląstelių išgyvenamumo svarbą PN, patyrusioms OXPHOS disfunkciją. Sukūrėme mCherry, koduojančią AAV-shRNR (trumpos plaukų segtuko RNR), specialiai nukreiptą į pelių PCx mRNR (AAV-shPCx), ir suleidome virusą arba jo iššifruotą kontrolę (AAV-scr) į Mfn2cKO pelių smegenėles. Injekcija buvo atlikta ketvirtą amžiaus savaitę (5A pav.), siekiant efektyviai numalšinti PCx tuo laikotarpiu, kai PCx raiška padidėjo (3C pav.) ir PN ląstelių sluoksnis vis dar buvo nepažeistas (1A pav.). Verta paminėti, kad PCx numalšinimas (S8A pav.) žymiai pagreitina PN žūtį, kuri apsiriboja užkrėstu žiedu (5, B ir C pav.). Siekdami suprasti PCx reguliacijos padidėjimo sukelto metabolinio poveikio mechanizmą, tyrėme PN redokso būseną po PCx ​​nonsavimo ir vienu metu buvo ekspresuojamas AAV tarpininkaujantis optinis biosensorius Grx1-roGFP2 (S8, B–D paveikslai), kad įvertintume glutationo santykinį peptidų redokso potencialo pokytį (38). Tada atlikome dviejų fotonų fluorescencinę gyvavimo trukmės vaizdavimo mikroskopiją (FLIM) 7 savaičių amžiaus Mfn2cKO arba kontrolinės vados ūminiuose smegenų pjūviuose, kad nustatytume galimus citoplazminio redokso būsenos pokyčius, patikrinus FLIM sąlygas (S8, E–G paveikslai). Analizė parodė reikšmingą vieno Mfn2cKO PN, neturinčio PCx ekspresijos, oksidacijos būsenos padidėjimą, kuris skiriasi nuo kontrolinių neuronų arba Mfn2cKO PN, ekspresuojančių tik iššifruotą shRNR (5, D ir E paveikslai). Kai PCx ekspresija buvo sumažinta, Mfn2cKO PN, rodančių labai oksiduotą būseną, procentinė dalis padidėjo daugiau nei tris kartus (5E pav.), o tai rodo, kad PCx reguliavimas išlaikė degeneruotų neuronų redokso pajėgumą.
(A) Schema, rodanti eksperimentinį AAV, koduojančio shPCx, injekcijos grafiką, kai aktyvuojamas nurodytas metabolinis kelias. (B) Tipinės 8 savaičių amžiaus Mfn2cKO pelių smegenėlių pjūvių konfokalinės nuotraukos, kurioms po 4 savaičių buvo atlikta transdukcija ir žymėta antikalcineurino antikūnu. Skalės juosta, 450 μm. (C) Purkinje ląstelių tankio kiekybinis įvertinimas AAV transdukuotose kilpose (vienpusė dispersinė analizė; n = 3–4 pelės). Duomenys išreikšti kaip vidurkis ± SEM; ***P < 0,001. (D) Tipinis FLIM paveikslėlis rodo vidutinę 7 savaičių amžiaus PN, ekspresuojančių glutationo redokso jutiklį Grx1-roGFP2, gyvenimo trukmę nurodytomis eksperimentinėmis sąlygomis. LUT (peržiūros lentelės) santykis: išgyvenimo laiko intervalas (pikosekundėmis). Skalės juosta, 25 μm. (E) Histograma rodo Grx1-roGFP2 gyvavimo trukmės verčių pasiskirstymą iš (D) (n = 158–368 ląstelės dviejose pelėse kiekvienu atveju). Skritulinė diagrama virš kiekvienos histogramos rodo ląstelių, kurių gyvavimo trukmė yra žymiai ilgesnė (raudona, oksiduota) arba trumpesnė (mėlyna, sumažėjusi), skaičių, viršijančių 1 SD vidutinės gyvavimo trukmės vertės CTRL-AAV-scr. (F) Siūlomas modelis rodo neuronų PCx reguliacijos padidėjimo apsauginį poveikį.
Apibendrinant, čia pateikti duomenys rodo, kad MFN2 pakartotinė raiška gali visiškai išgelbėti iš pažengusios PN, turinčios didelį OXPHOS trūkumą, didelį mtDNR išeikvojimą ir itin nenormalią ista tipo morfologiją, tokiu būdu užtikrinant nuolatinę progresavimą net ir esant pažengusioms ligoms. Neurodegeneracija pateikia grįžtamuosius įrodymus apie stadiją prieš ląstelių žūtį. Šį metabolinio lankstumo laipsnį dar labiau pabrėžia neuronų gebėjimas sukelti aterosklerozę (TCA ciklo pertvarkymą), kuri slopina PCx raišką PN, neturinčiose OXPHOS, ir skatina ląstelių žūtį, taip atlikdama apsauginį vaidmenį (5F pav.).
Šiame tyrime pateikėme įrodymų, kad PN atsakas į OXPHOS disfunkciją yra laipsniškas konvertavimas į TCA ciklo aterosklerozę per diferencinės aktyvacijos kelią, aktyvuojamą metabolinių programų. Proteominę analizę patvirtinome daugeliu papildomų metodų ir atskleidėme, kad, susidūrę su sunkia mitochondrijų disfunkcija, neuronai pasižymi anksčiau nežinoma metabolinio elastingumo forma. Mūsų nuostabai, visas perprogramavimo procesas nebūtinai žymi galutinę metabolinę būseną, kuri palaipsniui ir negrįžtamai lydi neurodegeneraciją, tačiau mūsų duomenys rodo, kad jis gali sudaryti palaikomąjį neuroną net ir prieš ląstelės mirtį vykstančioje stadijoje (funkcinis kompensavimo mechanizmas). Šis atradimas rodo, kad neuronai organizme pasižymi dideliu metaboliniu plastiškumu. Šis faktas įrodo, kad vėlesnis MFN2 pakartotinis įvedimas gali pakeisti pagrindinių metabolinių žymenų raišką ir užkirsti kelią PN degeneracijai. Priešingai, jis slopina aterosklerozę ir pagreitina nervus. transseksualas.
Vienas įdomiausių mūsų tyrimo išvadų yra tai, kad PN, neturinčios OXPHOS, gali modifikuoti TCA ciklo metabolizmą, padidindamos fermentų, kurie specifiškai stimuliuoja arteriosklerozę, aktyvumą. Metabolinis pertvarkymas yra dažnas vėžio ląstelių bruožas, kai kurios iš jų pasikliauja glutaminu, kad papildytų TCA ciklo tarpinius produktus, kad susidarytų redukuojantys ekvivalentai, kurie valdo kvėpavimo grandinę ir palaiko lipidų ir nukleotidų biosintezės pirmtakų gamybą (39, 40). Naujausi tyrimai parodė, kad periferiniuose audiniuose, kuriuose yra OXPHOS disfunkcija, glutamino / glutamato metabolizmo atkūrimas taip pat yra svarbus bruožas (5, 41), kur glutamino patekimo į TCA ciklą kryptis priklauso nuo OXPHOS pažeidimo sunkumo (41). Tačiau trūksta aiškių įrodymų apie neuronų metabolinio plastiškumo panašumą organizme ir jo galimą reikšmę ligos kontekste. Neseniai atliktame in vitro tyrime buvo parodyta, kad pirminiai žievės neuronai mobilizuoja glutamato telkinius neurotransmisijai, tokiu būdu skatindami oksidacinį metabolizmą ir aterosklerozę metabolinio streso sąlygomis (42). Verta paminėti, kad farmakologiškai slopinant TCA ciklo fermentą sukcinato dehidrogenazę, manoma, kad piruvato karboksilinimas palaiko oksaloacetato sintezę kultivuotose smegenėlių granulių neuronuose (34). Tačiau šių mechanizmų fiziologinė reikšmė smegenų audiniui (kur, kaip manoma, aterosklerozė daugiausia apsiriboja astrocitais) vis dar yra svarbi (43). Šiuo atveju mūsų duomenys rodo, kad OXPHOS pažeisti PN organizme gali būti perjungti į BCAA skaidymą ir piruvato karboksilinimą, kurie yra du pagrindiniai TCA telkinio tarpinių produktų papildymo šaltiniai. Nors buvo pasiūlytas tariamas BCAA katabolizmo indėlis į neuronų energijos metabolizmą, be glutamato ir GABA vaidmens neurotransmisijoje (44), vis dar nėra įrodymų apie šiuos mechanizmus in vivo. Todėl lengva spėlioti, kad disfunkciniai PN gali automatiškai kompensuoti asimiliacijos proceso skatinamą TCA tarpinių produktų suvartojimą, didindami aterosklerozę. Visų pirma, PCx reguliacijos padidėjimas gali būti reikalingas norint palaikyti padidėjusį asparto rūgšties poreikį, kas siūloma proliferuojančiose ląstelėse su mitochondrijų disfunkcija (45). Tačiau mūsų metabolomikos analizė neatskleidė jokių reikšmingų asparto rūgšties pusiausvyros lygio pokyčių Mfn2cKO PN (S6A pav.), kurie tikriausiai atspindi skirtingą asparto rūgšties metabolinį panaudojimą tarp proliferuojančių ląstelių ir postmitozinių neuronų. Nors tikslus PCx reguliacijos padidėjimo mechanizmas disfunkciniuose neuronuose in vivo dar nėra apibūdintas, mes parodėme, kad šis priešlaikinis atsakas vaidina svarbų vaidmenį palaikant neuronų redokso būseną, kas buvo įrodyta FLIM eksperimentuose su smegenėlių griežinėliais. Visų pirma, PN PCx reguliacijos padidėjimo prevencija gali sukelti labiau oksiduotą būseną ir pagreitinti ląstelių mirtį. BCAA skaidymo aktyvavimas ir piruvato karboksilinimas nėra būdai apibūdinti mitochondrijų disfunkcijos periferinius audinius (7). Todėl atrodo, kad jie yra prioritetinis OXPHOS stokojančių neuronų požymis, net jei ne vienintelis, svarbus neurodegeneracijai.
Smegenėlių liga yra heterogeninis neurodegeneracinės ligos tipas, kuris paprastai pasireiškia kaip ataksija ir dažnai pažeidžia PN (46). Ši neuronų populiacija yra ypač jautri mitochondrijų disfunkcijai, nes jų selektyvi degeneracija pelėse yra pakankama, kad būtų atkurta daugelis motorinių simptomų, būdingų žmogaus spinocerebelarinei ataksijai (16, 47, 48). Remiantis pranešimais, transgeninis pelės modelis su mutantiniu genu yra susijęs su žmogaus spinocerebelarine ataksija ir turi mitochondrijų disfunkciją (49, 50), pabrėžiant OXPHOS trūkumo pasekmių PNPH tyrimo svarbą. Todėl tai ypač tinkama norint efektyviai išskirti ir ištirti šią unikalią neuronų populiaciją. Tačiau, atsižvelgiant į tai, kad PN yra labai jautrios spaudimui ir sudaro mažą visos smegenėlių ląstelių populiacijos dalį, daugeliui omikos pagrindu atliekamų tyrimų selektyvus jų atskyrimas kaip ištisų ląstelių vis dar yra sudėtingas aspektas. Nors beveik neįmanoma pasiekti absoliutaus kitų ląstelių tipų (ypač suaugusiųjų audinių) užteršimo nebuvimo, mes sujungėme efektyvų disociacijos etapą su FACS, kad gautume pakankamą gyvybingų neuronų skaičių tolesnei proteomikos analizei ir gautume gana didelę baltymų aprėptį (apie 3000 baltymų), palyginti su esamu viso smegenėlių duomenų rinkiniu (51). Išsaugodamas viso ląstelių gyvybingumą, čia pateiktas metodas leidžia mums ne tik patikrinti mitochondrijų metabolinių takų pokyčius, bet ir patikrinti jų citoplazminių atitikmenų pokyčius, o tai papildo mitochondrijų membraninių žymų naudojimą ląstelių tipui praturtinti. Naujas mitochondrijų skaičiaus sudėtinguose audiniuose nustatymo metodas (52, 53). Mūsų aprašytas metodas yra susijęs ne tik su Purkinje ląstelių tyrimu, bet ir gali būti lengvai taikomas bet kokio tipo ląstelėms, siekiant spręsti metabolinius pokyčius sergančiose smegenyse, įskaitant kitus mitochondrijų disfunkcijos modelius.
Galiausiai, šio metabolinio pertvarkymo proceso metu nustatėme terapinį langą, kuris gali visiškai panaikinti pagrindinius ląstelių streso požymius ir užkirsti kelią neuronų degeneracijai. Todėl čia aprašyto pertvarkymo funkcinių pasekmių supratimas gali suteikti esminių įžvalgų apie galimus neuronų gyvybingumo palaikymo mitochondrijų disfunkcijos metu gydymo būdus. Norint visapusiškai atskleisti šio principo pritaikomumą kitoms neurologinėms ligoms, reikalingi būsimi tyrimai, skirti išanalizuoti energijos metabolizmo pokyčius kituose smegenų ląstelių tipuose.
MitoPark pelės jau buvo aprašytos anksčiau (31). C57BL/6N pelės su loxP flankuojančiais Mfn2 genais jau buvo aprašytos anksčiau (18) ir kryžmintos su L7-Cre pelėmis (23). Gauti dvigubai heterozigotiniai palikuonys buvo kryžminami su homozigotinėmis Mfn2loxP/Mfn2loxP pelėmis, siekiant sukurti Purkinje specifinius Mfn2 geno išjungimo variantus (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). Poravimosi pogrupyje Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP alelis (stop-mtYFP) buvo įvestas atliekant papildomus kryžminimus (20). Visos procedūros su gyvūnais buvo atliekamos laikantis Europos, nacionalinių ir institucinių gairių ir patvirtintos LandesamtfürNatur of Umwelt and Verbraucherschutz, Šiaurės Reinas-Vestfalija, Vokietija. Darbas su gyvūnais taip pat atitinka Europos laboratorinių gyvūnų mokslų asociacijų federacijos rekomendacijas.
Anestezavus nėščiosios kaklo išnirimą, pelės embrionas buvo izoliuotas (E13). Žievė buvo išpreparuota Hankso subalansuotame druskos tirpale (HBSS), papildytame 10 mM Hepes, ir perkelta į Dulbecco modifikuotą Eagle terpę, kurioje yra papaino (20 U/ml) ir cisteino (1 μg/ml). Audinys inkubuojamas DMEM terpėje (Ml) ir atskiriamas fermentiniu būdu 37 °C temperatūroje 20 minučių, o po to mechaniškai sumalamas DMEM terpėje, papildytoje 10 % vaisiaus galvijų serumo. Ląstelės buvo pasėtos ant stiklinių dengiamųjų stiklelių, padengtų polilizinu, 2 × 106 tankiu 6 cm kultivavimo lėkštelėje arba 0,5 × 105 ląstelių/cm2 tankiu vaizdinei analizei. Po 4 valandų terpė buvo pakeista Neurobasal terpe be serumo, kurioje yra 1 % vitamino B27 papildo ir 0,5 mM GlutaMax. Neuronai viso eksperimento metu buvo laikomi 37 °C temperatūroje ir 5 % CO2 atmosferoje, o maitinami kartą per savaitę. Siekiant in vitro sukelti rekombinaciją, antrąją dieną in vitro neuronams gydyti buvo panaudota 3 μl (24 šulinėlių kultūros lėkštelė) arba 0,5 μl (24 šulinėlių plokštelė) šių AAV9 viruso vektorių: AAV9.CMV.PI.eGFP.WPRE.bGH (Addgene, katalogo numeris 105530-AAV9) ir AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, katalogo numeris 105545-AAV9).
Pelės Mfn1 ir Mfn2 komplementinės DNR (gautos atitinkamai iš Addgene plazmidžių Nr. 23212 ir Nr. 23213) C gale pažymėtos V5 seka (GKPIPNPLLGLDST) ir sujungtos su mCherry rėmelyje per T2A seką. Grx1-roGFP2 yra Heidelbergo TP Dicko DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum) dovana. Pakeitus tdTomato kasetę įprastiniais klonavimo metodais, kasetė buvo subklonuota į pAAV-CAG-FLEX-tdTomato pagrindą (Addgene referencinis numeris 28306), kad būtų gauti pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 ir pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 vektoriai. Panaši strategija buvo naudojama generuojant kontrolinį vektorių pAAV-CAG-FLEX-mCherry. Norint sukurti AAV-shPCx konstrukciją, reikalingas plazmidės AAV vektorius (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]), kuriame yra DNR seka, koduojanti shRNR, nukreiptą į pelės PCx (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′). Kontroliuojant U6 promotorių, naudojamas mCherry, kontroliuojamas CMV promotoriaus. Pagalbinių AAV vektorių gamyba buvo atlikta pagal gamintojo instrukcijas („Cell Biolabs“). Trumpai tariant, naudokite perkėlimo plazmidę, turinčią mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry). 293AAV ląstelių-T2A-MFN1-V5), mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) arba Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) koduojantį geną, taip pat koduojančią AAV1 kapsidės baltymą ir pagalbinį baltymą. Pakavimo plazmidės, naudojant kalcio fosfato metodą, trumpalaikiam transfekavimui. Neapdorotas viruso supernatantas buvo gautas užšaldymo-atšildymo ciklais sauso ledo/etanolio vonioje ir lizuotas ląsteles fosfatiniu buferiniu tirpalu (PBS). AAV vektorius buvo išgrynintas nenuolatinės jodiksanolio gradiento ultracentrifugacijos būdu (24 val. 32 000 aps./min. greičiu ir 4 °C temperatūroje) ir sukoncentruotas naudojant „Amicon ultra-15“ centrifuginį filtrą. AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2,9 × 1013 genomo kopijos (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6,1 × 1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX genomo titras buvo toks, kaip aprašyta anksčiau (54), išmatuotas realaus laiko kiekybine PGR (kPGR) -MFN1-V5 (1,9 × 1013 GC/ml) ir AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8,9 × 1012 GC/ml).
Pirminiai neuronai buvo nugramdyti lediniame 1x PBS tirpale, sugrandyti ir homogenizuoti 0,5 % Triton X-100 / 0,5 % natrio deoksicholato / PBS lizės buferyje, kuriame yra fosfatazės ir proteazės inhibitoriaus („Roche“). Baltymų kiekybinis įvertinimas atliktas naudojant bicinchonino rūgšties tyrimą („Thermo Fisher Scientific“). Baltymai buvo atskirti SDS-poliakrilamido gelio elektroforezės būdu ir pernešti ant polivinilidenfluorido membranos („GE Healthcare“). Užblokuokite nespecifines vietas ir inkubuokite su pirminiu antikūnu (išsamesnė informacija pateikiama S1 lentelėje) 5 % piene TBST (Tris buferiniame tirpale su Tween), atlikite plovimo veiksmus ir antrinį antikūną TBST inkubuokite. Inkubuokite su pirminiu antikūnu per naktį +4 °C temperatūroje. Po plovimo 2 valandas kambario temperatūroje užtepkite antrinį antikūną. Vėliau, inkubuojant tą patį blotą su anti-β-aktino antikūnu, buvo patvirtintas tas pats kiekis. Aptikimas konvertuojant į chemiluminescenciją ir sustiprinant chemiluminescenciją („GE Healthcare“).
Ant stiklinių dengiamųjų stiklelių anksčiau pasėti neuronai buvo fiksuoti 4 % paraformaldehidu (PFA) / PBS nurodytu laiku kambario temperatūroje 10 minučių. Dengiamosios stiklelės pirmiausia 5 minutes kambario temperatūroje permirkomos 0,1 % Triton X-100 / PBS, o po to blokuojamajame buferyje [3 % galvijų serumo albumino (BSA) / PBS]. Antrą dieną dengiamosios stiklelės buvo plaunamos blokuojamuoju buferiu ir 2 valandas inkubuojamos su atitinkamu fluoroforu konjuguotu antriniu antikūnu kambario temperatūroje; galiausiai mėginiai buvo kruopščiai nuplauti PBS su 4',6-diamidino-2-fenilindoliu (DAPI), kontrastingai nudažyti ir tada fiksuoti ant mikroskopo stiklelio naudojant Aqua-Poly / Mount.
Pelėms (patinams ir patelėms) buvo atlikta anestezija į pilvaplėvės ertmę suleidžiant ketamino (130 mg/kg) ir ksilazino (10 mg/kg), o po oda suleidžiant karprofeno analgetiko (5 mg/kg). Pelėms buvo atlikta anestezija į stereotaksinį instrumentą (Kopf) su šiltu įklotu. Kaukolė buvo atidengta ir dantų grąžtu suploninta smegenėlių žievės dalis, atitinkanti diskaulą (iš lambda: uodega 1,8, šoninė 1, atitinkanti IV ir V skilteles). Lenkta švirkšto adata atsargiai išgręžta maža skylutė kaukolėje, kad nebūtų pažeista apačioje esanti kraujagyslių sistema. Tada plonas ištrauktas stiklinis kapiliaras lėtai įkišamas į mikroskylutę (nuo -1,3 iki -1 kietojo smegenų dangalo ventralinėje pusėje) ir rankiniu švirkštu (Narishige) kelis kartus žemu slėgiu per 10–20 minučių laikotarpį į mikroinjektorių (Narishige) suleidžiama 200–300 nl AAV. Po infuzijos kapiliaras dar 10 minučių uždedamas, kad virusas visiškai išplistų. Ištraukus kapiliarus, oda kruopščiai susiuvama, kad sumažėtų žaizdos uždegimas ir gyvūnas galėtų pasveikti. Gyvūnams kelias dienas po operacijos buvo duodama analgezinių vaistų (kaspofenas), per tą laiką atidžiai stebima jų fizinė būklė, o vėliau nustatytu laiku jie buvo užmigdyti. Visos procedūros buvo atliekamos laikantis Europos, nacionalinių ir institucinių gairių ir jas patvirtino „LandesamtfürNatur of Umwelt and Verbraucherschutz“, Šiaurės Reino-Vestfalijos žemė, Vokietija.
Gyvūnams buvo atlikta anestezija ketaminu (100 mg/kg) ir ksilazinu (10 mg/kg), o širdis pirmiausia perfuzuota 0,1 M PBS, o po to 4 % PFA PBS tirpale. Audinys buvo išpreparuotas ir fiksuotas 4 % PFA/PBS tirpale per naktį 4 °C temperatūroje. Vibruojančiu peiliu („Leica Microsystems GmbH“, Viena, Austrija) buvo paruošti sagitiniai pjūviai (50 μm storio) iš fiksuotų smegenų PBS tirpale. Jei nenurodyta kitaip, laisvai plūduriuojančių pjūvių dažymas buvo atliktas, kaip aprašyta aukščiau (13), kambario temperatūroje ir maišant. Trumpai tariant, gauti griežinėliai pirmiausia buvo permeabilizuojami 0,5 % Triton X-100/PBS tirpalu 15 minučių kambario temperatūroje; kai kuriems epitopams (Pcx ir Shmt2) – tris-EDTA buferyje 80 °C temperatūroje (pH 9), o vietoj šio žingsnio griežinėlius kaitinti 25 minutes. Toliau pjūviai buvo inkubuojami su pirminiu antikūnu (žr. S1 lentelę) blokuojančiame buferyje (3 % BSA/PBS) 4 °C temperatūroje per naktį maišant. Kitą dieną pjūviai buvo plaunami blokuojančiu buferiu ir inkubuojami su atitinkamu fluoroforu konjuguotu antriniu antikūnu 2 valandas kambario temperatūroje; galiausiai pjūviai buvo kruopščiai plaunami PBS tirpale, kontrastiniu dažymu naudojant DAPI ir fiksuojami naudojant „AquaPolymount“ ant mikroskopo stiklelio.
Mėginio vaizdavimui buvo naudojamas lazerinis skenuojantis konfokalinis mikroskopas (TCS SP8-X arba TCS Digital Light Sheet, „Leica Microsystems“) su baltos šviesos lazeriu ir 405 diodiniu ultravioletiniu lazeriu. Sužadinant fluoroforą ir surenkant signalą hibridiniu detektoriumi (HyDs), LAS-X programinė įranga buvo naudojama sukauptiems vaizdams, atitinkantiems Nyquist atrankos metodą nuosekliuoju režimu, surinkti: nekyminėms panelėms tai labai dinamiški signalai (pavyzdžiui, somatinėse ląstelėse ir dendrituose (mtYFP). HyD naudojamas PN skaičiui aptikti BrightR režimu. Fonui sumažinti taikomas 0,3–6 ns sinchronizacijos laikas.
Rūšiuotų ląstelių vaizdavimas realiuoju laiku. Po rūšiavimo „Neurobasal-A“ terpėje, kurioje yra 1 % vitamino B27 papildo ir 0,5 mM „GlutaMax“, ląstelės buvo nedelsiant pasėtos ant poli-L-lizinu padengtų stiklelių („μ-Slide8 Well“, Ibidi, katalogo numeris 80826). Po to 1 valandą laikomos 37 °C temperatūroje ir 5 % CO2 atmosferoje, kad ląstelės nusėstų. Realiojo laiko vaizdavimas buvo atliktas naudojant „Leica SP8“ lazerinį skenuojantį konfokalinį mikroskopą su baltu lazeriu, HyD, 63×[1,4 skaitmeninės apertūros (NA)] aliejiniu objektyvu ir kaitinimo stalu.
Pelė buvo greitai anestezuota anglies dioksidu ir dekapituota, smegenys buvo greitai išimtos iš kaukolės ir supjaustytos į 200 μm storio (13C žymėjimo eksperimentui) arba 275 μm storio (dviem fotonų eksperimentams) sagitalinį pjūvį, užpildytą šiomis medžiagomis. Ledai (HM-650 V, „Thermo Fisher Scientific“, Valdorfas, Vokietija) užpildyti šiomis medžiagomis: 125 mM ledinio, anglimi prisotinto (95 % O2 ir 5 % CO2) mažai Ca2 + dirbtinio smegenų skysčio (ASF) NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM natrio fosfato buferis, 25 mM NaHCO3, 25 mM gliukozė, 0,5 mM CaCl2 ir 3,5 mM MgCl2 (osmosinis slėgis 310–330 mmol). Gautus smegenų griežinėlius perkelkite į išankstinio inkubavimo kamerą, kurioje yra didesnės Ca2 koncentracijos + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM natrio fosfato buferis, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-gliukozė, 1,0 mM CaCl2 ir 2,0 mM MgCl2) terpė, pH 7,4 ir 310–320 mmol.
Vaizdavimo proceso metu pjūviai buvo perkelti į specialią vaizdavimo patalpą, o eksperimentas buvo atliekamas nuolatinės ACSF perfuzijos sąlygomis, esant pastoviai 32–33 °C temperatūrai. Pjūvių vaizdavimui buvo naudojamas daugiafotonis lazerinis skenuojantis mikroskopas (TCS SP8 MP-OPO, „Leica Microsystems“) su „Leica“ 25x objektyvu (NA 0,95, vanduo) ir Ti:Safyro lazeriu („Chameleon Vision II“, „Coherent“). FLIM modulis („PicoHarp300“, „PicoQuant“).
Grx1-roGFP2 FLIM. PN citoplazminės redokso būsenos pokyčiai buvo matuojami dviejų fotonų FLIM metodu sagitaliniuose smegenų pjūviuose, kur Grx1-roGFP2 biosensorius buvo nukreiptas į PN. PN sluoksnyje duomenų rinkimo laukas parenkamas maždaug 50–80 μm žemiau pjūvio paviršiaus, siekiant užtikrinti gyvybingą PN (t. y., nėra granuliuotos struktūros ar neuronų morfologinių pokyčių išilgai dendritų), ir dvigubai teigiamą roGFP2 jutiklį bei AAV, koduojantį shRNR PCx arba jos kontrolinę seką (kiekvienas kartu ekspresuoja mCherry). Surinkite vieno stekelio vaizdus naudodami 2x skaitmeninį priartinimą [sužadinimo bangos ilgis: 890 nm; 512 nm 512 pikselių]. Aptikimas: vidinis HyD, fluoresceino izotiocianato (FITC) filtrų grupė] ir vaizdo vidurkinimas per 2–3 minutes, siekiant užtikrinti, kad būtų surinkta pakankamai fotonų (iš viso 1000 fotonų) kreivės pritaikymui. Grx1-roGFP2 zondo jautrumas ir FLIM sąlygų patikrinimas buvo atlikti stebint roGFP2 gyvavimo trukmę, kai į perfuzinį ACSF buvo pridėta egzogeninio 10 mM H2O2 (siekiant maksimaliai padidinti oksidaciją, dėl to pailgėja gyvavimo trukmė), o po to pridėjus 2 mM ditiotreitolio (sumažintas redukcijos laipsnis, dėl to sutrumpėja gyvavimo trukmė) (S8 pav., D–G). Naudojant FLIMfit 5.1.1 programinę įrangą, išanalizuoti gauti rezultatai, pritaikyti viso vaizdo eksponentinę mažėjimo kreivę prie išmatuotos IRF (prietaiso atsako funkcijos), ir χ2 yra maždaug 1. Norint apskaičiuoti vieno PN gyvavimo trukmę, rankiniu būdu buvo nubrėžta kaukė aplink nervo kūną, o kiekybiniam įvertinimui buvo naudojamas vidutinis gyvavimo laikas kiekvienoje kaukėje.
Mitochondrijų potencialo analizė. Po to, kai ūminis pjūvis 30 minučių buvo inkubuojamas su 100 nM TMRM, tiesiogiai įpiltu į perfuzuotą ACSF, PN mitochondrijų potencialo pokyčiai buvo išmatuoti dviejų fotonų mikroskopu. TMRM vaizdavimas buvo atliktas sužadinant zondą esant 920 nm bangos ilgiui ir naudojant vidinį HyD (tetrametilrodamino izotiocianatas: 585/40 nm) signalams rinkti; naudojant tą patį sužadinimo bangos ilgį, bet naudojant kitą vidinį HyD (FITC: 525/50) mtYFP vaizdavimui. Naudokite „ImageJ“ vaizdo skaičiuoklės papildinį, kad įvertintumėte mitochondrijų potencialą vienos ląstelės lygmenyje. Trumpai tariant, papildinio lygtis: signalas = min (mtYFP, TMRM) naudojama mitochondrijų regionui, kuris rodo TMRM signalą Purkinje somaliečių kalboje atitinkamo kanalo vieno stekelio konfokaliniame vaizde, identifikuoti. Tada gautos kaukės pikselių plotas yra kiekybiškai įvertinamas ir normalizuojamas atitinkamame mtYFP kanalo vieno stekelio vaizde, kad būtų gauta mitochondrijų frakcija, rodanti mitochondrijų potencialą.
Vaizdas buvo dekonvoliuotas naudojant „Huygens Pro“ („Scientific Volume Imaging“) programinę įrangą. Nuskenuotų plytelių nuotraukų montažas atliekamas naudojant LAS-X programinės įrangos automatinio susiuvimo algoritmą. Po vaizdo kalibravimo naudojamas „ImageJ“ ir „Adobe Photoshop“, kad būtų galima toliau apdoroti vaizdą ir tolygiai sureguliuoti ryškumą bei kontrastą. Grafiniam paruošimui naudojama „Adobe Illustrator“.
mtDNR židinio analizė. mtDNR pažeidimų skaičius buvo kiekybiškai įvertintas smegenėlių pjūviuose, paženklintuose antikūnais prieš DNR, konfokaliniu mikroskopu. Kiekviena taikinio sritis buvo sukurta ląstelės kūnui ir branduoliui, o atitinkamas plotas buvo apskaičiuotas naudojant „Multi Measure“ papildinį („ImageJ“ programinė įranga). Iš ląstelės kūno ploto atimkite branduolio plotą, kad gautumėte citoplazmos plotą. Galiausiai, „Analyze Particles“ papildinys („ImageJ“ programinė įranga) buvo naudojamas automatiškai kiekybiškai įvertinti citoplazminės DNR taškus, rodančius mtDNR slenksčio vaizde, o gauti rezultatai buvo normalizuoti pagal CTRL pelių PN vidurkį. Rezultatai išreikšti kaip vidutinis nukleozidų skaičius vienoje ląstelėje.
Baltymų raiškos analizė. Norėdami įvertinti baltymų raišką PN ląstelėse, naudokite „ImageJ“ įskiepį „Image Calculator“. Trumpai tariant, atitinkamo kanalo vieno sluoksnio konfokaliniame vaizde, naudojant lygtį: signalas = min (mtYFP, antikūnas), identifikuojamas mitochondrijų regionas, kuris pasižymi imunoreaktyvumu tam tikram Purkina antikūnui. Tada gautos kaukės pikselių plotas kiekybiškai įvertinamas ir normalizuojamas pagal atitinkamą mtYFP kanalo vieno sluoksnio slenksčio vaizdą, kad būtų gauta rodomo baltymo mitochondrijų frakcija.
Purkinje ląstelių tankio analizė. Purkinje tankiui įvertinti buvo naudojamas „ImageJ“ įskiepis „Cell Counter“, padalijus suskaičiuotų Purkinje ląstelių skaičių iš smegenėlių žiedo, kurį užima suskaičiuotos ląstelės, ilgio.
Mėginio paruošimas ir surinkimas. Kontrolinės grupės ir Mfn2cKO pelių smegenys buvo fiksuotos 2 % PFA / 2,5 % glutaraldehido tirpale 0,1 M fosfato buferyje (PB), o tada vainikiniai pjūviai buvo paruošti naudojant blakstienotuosius augalus („Leica Mikrosysteme GmbH“, Viena, Austrija) (storis 50–60 μm). Tada pjūviai buvo fiksuojami PB buferyje su 1 % os tetraoksido ir 1,5 % kalio ferocianido tirpalu kambario temperatūroje 1 valandą. Pjūviai buvo tris kartus plaunami distiliuotu vandeniu, o po to 20 minučių dažomi 70 % etanoliu, kuriame yra 1 % uranilo acetato. Tada pjūviai buvo dehidratuoti graduotame alkoholyje ir įterpti į Durcupan ACM (Araldite liejimo derva M) epoksidinę dervą („Electron Microscopy Sciences“, katalogo numeris 14040) tarp silikonu dengtų stiklinių plokštelių ir galiausiai 60 °C temperatūroje polimerizuojami krosnyje 48 valandas. Buvo pasirinkta smegenėlių žievės sritis ir „Leica Ultracut“ (Leica Mikrosysteme GmbH, Viena, Austrija) buvo išpjauti 50 nm ultraploni pjūviai, kurie buvo paimami ant 2 × 1 mm vario plyšinio tinklelio, padengto polistireno plėvele. Pjūviai buvo dažomi 4 % uranilo acetato tirpalu vandenyje 10 minučių, kelis kartus plaunami vandeniu, po to 10 minučių Reynoldso švino citratu vandenyje ir vėl kelis kartus plaunami vandeniu. Mikrografijos buvo padarytos transmisiniu elektroniniu mikroskopu „Philips CM100“ (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, JAV), naudojant TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 skaitmeninę kamerą (TVIPS GmbH, Gauting, JAV, Vokietija).
Pelėms, užkrėstoms AAV, smegenys buvo atskirtos ir supjaustytos į 1 mm storio sagitalinį pjūvį, o smegenėlės buvo ištirtos fluorescenciniu mikroskopu, siekiant nustatyti AAV užkrėstą žiedą (t. y., mCherry ekspresuojantį). Naudojami tik tie eksperimentai, kuriuose AAV injekcija lemia labai didelį Purkinje ląstelių sluoksnio (t. y. beveik viso sluoksnio) transdukcijos efektyvumą bent dviejuose iš eilės einančiuose smegenėlių žieduose. AAV transdukuota kilpa buvo mikrodisekuota ir per naktį palaikoma po fiksacijos (4 % PFA ir 2,5 % glutaraldehido 0,1 M kokoato buferyje) ir toliau apdorojama. EPON įterpimui fiksuotas audinys buvo plaunamas 0,1 M natrio kokoato buferiu („Applichem“) ir 4 valandas inkubuojamas su 2 % OsO4 (os, „Science Services“; „Caco“) 0,1 M natrio kokoato buferyje („Applichem“), po to plaunamas 2 valandas. Pakartokite 3 kartus su 0,1 M kokamido buferiu. Vėliau, naudojant kylančią etanolio eilę, kiekvienas etanolio tirpalas buvo inkubuojamas 4 °C temperatūroje 15 minučių, kad audinys būtų dehidratuotas. Audinys buvo perkeltas į propileno oksidą ir inkubuojamas per naktį EPON (Sigma-Aldrich) 4 °C temperatūroje. Audinys 2 valandoms įdėtas į šviežią EPON kambario temperatūroje, o po to 72 valandoms įdėtas į 62 °C temperatūrą. Ultramikrotomu (Leica Microsystems, UC6) ir deimantiniu peiliu (Diatome, Biel, Šveicarija) išpjauti 70 nm ultraplonus pjūvius, 15 minučių dažyti 1,5 % uranilo acetatu 37 °C temperatūroje ir 4 minutes dažyti švino citrato tirpalu. Elektroninės mikrografijos buvo padarytos naudojant JEM-2100 Plus transmisinį elektroninį mikroskopą (JEOL) su „Camera OneView 4K 16-bit“ (Gatan) ir „DigitalMicrograph“ programine įranga (Gatan). Analizei elektroninės mikrografijos buvo gautos naudojant 5000× arba 10 000× skaitmeninį priartinimą.
Mitochondrijų morfologinė analizė. Visoms analizėms atskirų mitochondrijų kontūrai buvo rankiniu būdu nubraižyti skaitmeniniuose vaizduose naudojant „ImageJ“ programinę įrangą. Analizuojami skirtingi morfologiniai parametrai. Mitochondrijų tankis išreiškiamas procentais, gautais dalijant bendrą kiekvienos ląstelės mitochondrijų plotą iš citoplazmos ploto (citoplazmos plotas = ląstelės plotas - ląstelės branduolio plotas) × 100. Mitochondrijų apvalumas apskaičiuojamas pagal formulę [4π∙(plotas/perimetras 2)]. Mitochondrijų morfologinė analizė buvo atlikta ir suskirstyta į dvi kategorijas („vamzdelinė“ ir „pūslinė“) pagal jų pagrindines formas.
Autofagosomų/lizosomų skaičiaus ir tankio analizė. Norėdami rankiniu būdu apibrėžti kiekvienos autofagosomos/lizosomos kontūrus skaitmeniniame vaizde, naudokite „ImageJ“ programinę įrangą. Autofagosomų/lizosomų plotas išreiškiamas procentais, apskaičiuojamas bendrą kiekvienos ląstelės autofagosomų/lizosomų struktūros plotą padalijus iš citoplazmos ploto (citoplazmos plotas = ląstelės plotas - branduolio plotas) × 100. Autofagosomų/lizosomų tankis apskaičiuojamas bendrą skaičių padalijus iš autofagosomų/lizosomų struktūrų skaičiaus vienoje ląstelėje (pagal citoplazmos plotą) (citoplazmos plotas = ląstelės plotas - branduolio plotas).
Ūminio pjūvio žymėjimas ir mėginių paruošimas. Eksperimentams, kuriems reikalingas gliukozės žymėjimas, ūminio smegenų pjūviai perkeliami į išankstinio inkubavimo kamerą, kurioje yra sočiosios anglies (95 % O2 ir 5 % CO2), didelio Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM natrio fosfato buferis, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-gliukozė, 1,0 mM CaCl2 ir 2,0 mM MgCl2, pH sureguliuotas iki 7,4 ir 310–320 mOsm), kurioje gliukozė pakeičiama 13C6-gliukozės pakaitalu („Eurisotop“, katalogo numeris CLM-1396). Eksperimentams, kuriems reikalingas piruvato žymėjimas, ūminius smegenų pjūvius perkelkite į didesnės Ca2 koncentracijos ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM natrio fosfato buferis, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-gliukozė, 1,0 mM CaCl2 ir įpilkite 2,0 mM MgCl2, pH sureguliuokite iki 7,4 ir 310–320 mOsm), ir įpilkite 1 mM 1-[1-13C]piruvato (Eurisotop, katalogo numeris CLM-1082). Pjūviai inkubuojami 90 minučių 37 °C temperatūroje. Eksperimento pabaigoje pjūviai buvo greitai nuplauti vandeniniu tirpalu (pH 7,4), kuriame yra 75 mM amonio karbonato, ir homogenizuoti 40:40:20 (v:v:v) acetonitrilo (ACN): metanolio: vandens mišinyje. Po 30 minučių inkubacijos ant ledo mėginiai buvo centrifuguoti 21 000 g greičiu 10 minučių 4 °C temperatūroje, o skaidrus supernatantas buvo džiovinamas „SpeedVac“ koncentratoriuje. Gautos džiovintos metabolitų granulės buvo laikomos -80 °C temperatūroje iki analizės.
13C žymėtų aminorūgščių skysčių chromatografijos ir masių spektrometrijos analizė. Skysčių chromatografijos ir masių spektrometrijos (LC-MS) analizei metabolitų granulės buvo resuspenduotos 75 μl LC-MS klasės vandens („Honeywell“). Po centrifugavimo esant 21 000 g 5 minutes 4 °C temperatūroje, 20 μl išvalyto supernatanto buvo panaudota aminorūgščių srauto analizei, o likusi ekstrakto dalis nedelsiant panaudota anijonų analizei (žr. toliau). Aminorūgščių analizė atlikta naudojant anksčiau aprašytą benzoilo chlorido derivatizacijos protokolą (55, 56). Pirmajame etape į 20 μl metabolitų ekstrakto buvo įpilta 10 μl 100 mM natrio karbonato („Sigma-Aldrich“), o po to į LC klasės ACN buvo įpilta 10 μl 2 % benzoilo chlorido („Sigma-Aldrich“). Mėginys buvo trumpai sumaišomas sūkuriniame maišytuve ir po to centrifuguojamas 21 000 g 5 minutes 20 °C temperatūroje. Išvalytą supernatantą perkelkite į 2 ml automatinio mėginių ėmimo buteliuką su kūginiu stikliniu įdėklu (200 μl tūrio). Mėginiai buvo analizuojami naudojant „Acquity iClass“ itin didelio našumo LC sistemą („Waters“), prijungtą prie didelės skiriamosios gebos Q-Exactive (QE)-HF („Ultra High Field Orbitrap“) didelės skiriamosios gebos precizinio masių spektrometro („Thermo Fisher Scientific“). Analizei 2 μl derivatizuoto mėginio buvo įšvirkšta į 100 × 1,0 mm didelio stiprumo silicio dioksido T3 kolonėlę („Waters“), kurioje yra 1,8 μm dalelių. Srauto greitis yra 100 μl/min., o buferinę sistemą sudaro A buferis (10 mM amonio formiatas ir 0,15 % skruzdžių rūgšties vandenyje) ir B buferis (ACN). Gradientas yra toks: 0 % B po 0 minučių; 0 % B. 0–15 % B po 0–0,1 minutės; 15–17 % B po 0,1–0,5 minutės; B esant 17–55 % po 0,5–14 minučių; B esant 55–70 % po 14–14,5 minučių; B esant 14,5–70–100 % po 18 minučių; 100 % B esant 18–19 minučių; 100–0 % B esant 19–19,1 minutės; 0 % B esant 19,1–28 minutėms (55, 56). QE-HF masių spektrometras veikia teigiamos jonizacijos režimu, o masės diapazonas m/z (masės ir krūvio santykis) yra nuo 50 iki 750. Taikoma skiriamoji geba yra 60 000, o gautas stiprinimo valdymo (AGC) jonų taikinys yra 3 × 106, o maksimalus jonų laikas yra 100 milisekundžių. Šildomo elektros purškimo jonizacijos (ESI) šaltinis veikia esant 3,5 kV purškimo įtampai, 250 °C kapiliarinei temperatūrai, 60 AU (savavališkų vienetų) apvalkalo oro srautui ir 20 AU pagalbiniam oro srautui. 250 °C. S lęšis nustatytas ties 60 AU.
13C žymėtų organinių rūgščių anijonų chromatografijos-MS analizė. Likusios metabolitų nuosėdos (55 μl) buvo analizuojamos naudojant „Dionex“ jonų chromatografijos sistemą („ICS 5000+“, „Thermo Fisher Scientific“), prijungtą prie QE-HF masių spektrometro („Thermo Fisher Scientific“). Trumpai tariant, 5 μl metabolitų ekstrakto buvo įšvirkšta į „Dionex IonPac AS11-HC“ kolonėlę su HPLC (2 mm × 250 mm, dalelių dydis 4 μm, „Thermo Fisher Scientific“) įstumiamo dalinio ciklo režimu, kai užpildymo santykis yra 1. „Dionex IonPac AG11-HC“ apsauginę kolonėlę (2 mm x 50 mm, 4 μm, „Thermo Fisher Scientific“). Kolonėlės temperatūra palaikoma 30 °C, o automatinis mėginių ėmiklis nustatytas į 6 °C. Kalio hidroksido gradientui per eliuento generatorių generuoti naudojama kalio hidroksido kasetė su dejonizuotu vandeniu. Metabolitų atskyrimas 380 μl/min. srauto greičiu, taikant tokį gradientą: 0–3 minutės, 10 mM KOH; 3–12 minučių, 10–50 mM KOH; 12–19 minučių, 50–100 mM KOH; 19–21 minutė, 100 mM KOH; 21–21,5 minutės, 100–10 mM KOH. Kolonėlė buvo pakartotinai balansuojama 10 mM KOH tirpale 8,5 minutės.
Eliuoti metabolitai po kolonėlės sujungiami su 150 μl/min izopropanolio papildo srautu ir nukreipiami į didelės skiriamosios gebos masių spektrometrą, veikiantį neigiamos jonizacijos režimu. MS stebi masių diapazoną nuo m/z 50 iki 750, o skiriamoji geba yra 60 000. AGC nustatytas ties 1×106, o maksimalus jonų laikas palaikomas 100 ms. Šildomas ESI šaltinis veikė esant 3,5 kV purškimo įtampai. Kiti jonų šaltinio nustatymai yra šie: kapiliarų temperatūra 275 °C; apvalkalo dujų srautas – 60 AU; pagalbinių dujų srautas – 20 AU esant 300 °C temperatūrai ir S lęšio nustatymas – 60 AU.
13C žymėtų metabolitų duomenų analizė. Izotopų santykio duomenų analizei naudokite „TraceFinder“ programinę įrangą (4.2 versija, „Thermo Fisher Scientific“). Kiekvieno junginio tapatybė buvo patikrinta patikimu etaloniniu junginiu ir analizuota nepriklausomai. Izotopų sodrinimo analizei atlikti kiekvieno 13C izotopo (Mn) ekstrahuoto jonų chromatogramos (XIC) plotas buvo išskirtas iš [M + H]+, kur n yra tiriamojo junginio anglies atomų skaičius, naudojamo aminorūgštims analizuoti, arba [MH]+, naudojamo anijonams analizuoti. XIC masės tikslumas yra mažesnis nei penkios milijoninės dalys, o RT tikslumas yra 0,05 minutės. Sodrinimo analizė atliekama apskaičiuojant kiekvieno aptikto izotopo santykį su visų atitinkamo junginio izotopų suma. Šie santykiai pateikiami kaip kiekvieno izotopo procentinės vertės, o rezultatai išreiškiami kaip molinis sodrinimo procentas (MPE), kaip aprašyta anksčiau (42).
Užšaldytos neuronų granulės buvo homogenizuotos lediniame 80 % metanolyje (v/v), sumaišytos sūkuriniame maišytuve ir inkubuotos -20 °C temperatūroje 30 minučių. Mėginį vėl sumaišykite sūkuriniame maišytuve ir maišykite +4 °C temperatūroje 30 minučių. Mėginys buvo centrifuguojamas 21 000 g greičiu 5 minutes 4 °C temperatūroje, o tada gautas supernatantas buvo surinktas ir išdžiovintas naudojant SpeedVac koncentratorių 25 °C temperatūroje tolesnei analizei. Kaip aprašyta aukščiau, rūšiuotų ląstelių aminorūgštims buvo atlikta LC-MS analizė. Naudojant „TraceFinder“ (4.2 versija, „Thermo Fisher Scientific“), duomenų analizė buvo atlikta naudojant kiekvieno junginio monoizotopinę masę. Metabolitų duomenų kiekybinis normalizavimas buvo atliktas naudojant „preprocessCore“ programinės įrangos paketą (57).
Pjūvio paruošimas. Pelė buvo greitai anestezuota anglies dioksidu ir dekapituota, smegenys buvo greitai pašalintos nuo kaukolės, o ledu užpildytu vibruojančiu peiliu (HM-650 V, „Thermo Fisher Scientific“, Valdorfas, Vokietija) supjaustytos į 300–375 μm sagitinius pjūvius. Šaltas anglies dujofikavimas (95 % O2 ir 5 % CO2). Mažas Ca2 kiekis + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM natrio fosfato buferis, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-gliukozės, 1,0 mM CaCl2 ir 6,0 mM MgCl2. pH sureguliuotas iki 7,4 ir 310–330 mOsm. Gautus smegenų pjūvius perkelkite į kamerą, kurioje yra didesnės Ca2 koncentracijos + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM natrio fosfato buferis, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-gliukozė, 4,0 mM CaCl2 ir mM 3,5 MgCl2), pH 7,4 ir 310–320 mOsm. Pjūvius laikykite 20–30 minučių, kad juos būtų galima atkurti prieš registravimą.
Įrašymas. Visiems įrašams buvo naudojamas mikroskopo stacionarus stacionarus stacionarus objektas su fiksuota įrašymo kamera ir 20 kartų didinančiu vandens imersijos objektyvu („Scientifica“). Numanomos Purkinje ląstelės buvo identifikuojamos pagal (i) kūno dydį, (ii) smegenėlių anatominę vietą ir (iii) fluorescencinio mtYFP reporterinio geno raišką. Pipetė, kurios galiuko varža yra nuo 5 iki 11 megomų, ištraukiama borosilikatinio stiklo kapiliaru („GB150-10“, 0,86 mm × 1,5 mm × 100 mm, „Science Products“, Hofheimas, Vokietija) ir horizontalios pipetės prietaisu „Instruments“ („P-1000“, „Sutter“, Novato, Kalifornija). Visi įrašai buvo atlikti naudojant ELC-03XS npi lopo spaustuvų stiprintuvą („npi electronic GmbH“, Tam, Vokietija), kurį valdė programinė įranga „Signal“ (6.0 versija, „Cambridge Electronic“, Kembridžas, JK). Eksperimentas buvo registruojamas 12,5 kHz diskretizavimo dažniu. Signalas filtruojamas dviem trumpojo praleidimo Beselio filtrais, kurių ribiniai dažniai yra atitinkamai 1,3 ir 10 kHz. Membranos ir pipetės talpa kompensuojama kompensavimo grandine naudojant stiprintuvą. Visi eksperimentai buvo atlikti valdant „Orca-Flash 4.0“ kamerą („Hamamatsu“, Gerdenas, Vokietija), kuri buvo valdoma „Hokawo“ programine įranga (2.8 versija, „Hamamatsu“, Gerdenas, Vokietija).
Įprastinė visos ląstelės konfigūracija ir analizė. Prieš pat registravimą pipetė pripildoma vidiniu tirpalu, kuriame yra šios medžiagos: 4,0 mM KCl, 2,0 mM NaCl, 0,2 mM EGTA, 135,0 mM kalio gliukonato, 10,0 mM Hepes, 4,0 mM ATP (Mg₂), 0,5 mM guanozino trifosfato (GTP) (Na₂) ir 10,0 mM kreatinino fosfato, pH sureguliuotas iki 7,25, o osmosinis slėgis – 290 mOsm (sacharozės). Iškart po to, kai membranai plyšti buvo pritaikyta 0 pA jėga, buvo išmatuotas ramybės membranos potencialas. Įėjimo varža matuojama taikant -40, -30, -20 ir -10 pA hiperpoliarizuotas sroves. Išmatuojamas įtampos atsako dydis ir, naudojant Omo dėsnį, apskaičiuojama įėjimo varža. Spontaninis aktyvumas 5 minutes buvo registruojamas įtampos replėmis, o sPSC buvo identifikuotas ir matuojamas naudojant „Igor Pro“ (32 7.01 versija, „WaveMetrics“, Lake Oswego, Oregonas, JAV) naudojant pusiau automatinį atpažinimo skriptą. IV kreivė ir pastoviosios būsenos srovė matuojamos užspaudžiant akumuliatorių esant skirtingam potencialui (pradedant nuo -110 mV) ir didinant įtampą 5 mV žingsniais. AP susidarymas buvo tikrinamas taikant depoliarizuojančią srovę. Užfiksuokite elementą ties -70 mV įtampa, taikant depoliarizuojančios srovės impulsą. Kiekvieno įrašymo įrenginio žingsnio dydį reguliuokite atskirai (nuo 10 iki 60 pA). Apskaičiuokite maksimalų AP dažnį rankiniu būdu suskaičiuodami impulsų šuolius, kurie sukelia didžiausią AP dažnį. AP slenkstis analizuojamas naudojant antrąją depoliarizacijos impulso, kuris pirmasis sužadina vieną ar daugiau AP, išvestinę.
Perforuoto lopo konfigūracija ir analizė. Atlikite perforuoto lopo registravimą naudodami standartinius protokolus. Naudokite pipetę be ATP ir GTP, kurioje nėra šių ingredientų: 128 mM gliukonato K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0,1 mM EGTA ir 2 mM MgCl2, ir sureguliuokite pH iki 7,2 (naudodami KOH). ATP ir GTP neįtraukiami į tarpląstelinį tirpalą, siekiant išvengti nekontroliuojamo ląstelės membranos pralaidumo. Lopo pipetė užpildoma amfotericino turinčiu vidiniu tirpalu (maždaug nuo 200 iki 250 μg/ml; G4888, „Sigma-Aldrich“), kad būtų gautas perforuoto lopo įrašas. Amfotericinas buvo ištirpintas dimetilsulfokside (galutinė koncentracija: 0,1–0,3 %; DMSO; D8418, „Sigma-Aldrich“). Naudota DMSO koncentracija neturėjo reikšmingos įtakos tiriamiems neuronams. Perforavimo proceso metu kanalo varža (Ra) buvo nuolat stebima, o eksperimentas buvo pradėtas stabilizavusis Ra ir AP amplitudei (20–40 minučių). Spontaninis aktyvumas matuojamas įtampos ir (arba) srovės replėmis 2–5 minutes. Duomenų analizė atlikta naudojant „Igor Pro“ (7.05.2 versija, „WaveMetrics“, JAV), „Excel“ (2010 m. versija, „Microsoft Corporation“, Redmondas, JAV) ir „GraphPad Prism“ (8.1.2 versija, „GraphPad Software Inc.“, La Choja, Kalifornija. Jungtinės Valstijos). Spontaniniams AP identifikuoti naudojamas „IgorPro“ įskiepis „NeuroMatic v3.0c“. AP identifikuojami automatiškai naudojant nurodytą slenkstį, kuris kiekvienam įrašui koreguojamas individualiai. Naudojant smailės intervalą, nustatomas smailės dažnis su maksimaliu momentiniu smailės dažniu ir vidutiniu smailės dažniu.
PN išskyrimas. Prisitaikius prie anksčiau paskelbto protokolo, PN buvo išgryninti iš pelės smegenėlių tam tikrame etape (58). Trumpai tariant, smegenėlės buvo išpreparuotos ir susmulkintos ledinėje disociacijos terpėje [be HBSS Ca2+ ir Mg2+, papildyta 20 mM gliukozės, penicilino (50 V/ml) ​​ir streptomicino (0,05 mg/ml)], o tada terpė suskaidyta papainu [HBSS, papildyta 1-cisteinu·HCl (1 mg/ml), papainu (16 V/ml) ​​ir deoksiribonukleaze I (DNazė I; 0,1 mg/ml)]. Apdorota 30 minučių 30 °C temperatūroje. Pirmiausia audiniai nuplaunami kambario temperatūroje HBSS terpėje, kurioje yra kiaušinio gleivių (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) ir DNazės (0,1 mg/ml), kad būtų išvengta fermentinio virškinimo, o tada HBSS terpėje, kurioje yra 20 mM gliukozės, švelniai sumalant HBSS, penicilinu (50 V/ml), streptomicinu (0,05 mg/ml) ir DNaze (0,1 mg/ml), kad būtų išskirtos pavienės ląstelės. Gauta ląstelių suspensija filtruojama per 70 μm ląstelių filtrą, tada ląstelės centrifuguojamos (1110 aps./min., 5 minutės, 4 °C) ir resuspenduojamos rūšiavimo terpėje [HBSS, papildyta 20 mM gliukozės, 20 % vaisiaus galvijų serumu, penicilinu (50 V/ml) ​​ir streptomicinu (0,05 mg/ml)]; ląstelių gyvybingumas įvertinamas propidžio jodidu ir ląstelių tankis pakoreguojamas nuo 1 × 106 iki 2 × 106 ląstelių/ml. Prieš srauto citometriją suspensija buvo filtruojama per 50 μm ląstelių filtrą.
Srauto citometras. Ląstelių rūšiavimas atliktas 4 °C temperatūroje naudojant FACSAria III aparatą („BD Biosciences“) ir FACSDiva programinę įrangą („BD Biosciences“, 8.0.1 versija). Ląstelių suspensija rūšiuota naudojant 100 μm antgalį, esant 20 psi slėgiui, maždaug 2800 įvykių per sekundę greičiu. Kadangi tradiciniai rūšiavimo kriterijai (ląstelių dydis, bimodalinė diskriminacija ir sklaidos charakteristikos) negali užtikrinti teisingo PN išskyrimo nuo kitų ląstelių tipų, rūšiavimo strategija nustatyta remiantis tiesioginiu YFP intensyvumo ir autofluorescencijos palyginimu mitoYFP+ ​​​​ir kontrolinėse mitoYFP− pelėse. YFP sužadinamas apšvitinant mėginį 488 nm lazerio linija, o signalas aptinkamas naudojant 530/30 nm juostinį filtrą. MitoYFP+ ​​​​pelėms santykinis Rosa26-mitoYFP reporterinio geno stiprumas taip pat naudojamas neuronų kūnų ir aksonų fragmentams atskirti. 7-AAD sužadinamas 561 nm geltonu lazeriu ir detektuojamas 675/20 nm juostiniu filtru, siekiant pašalinti negyvas ląsteles. Siekiant tuo pačiu metu atskirti astrocitus, ląstelių suspensija buvo nudažyta ACSA-2-APC, tada mėginys buvo apšvitintas 640 nm lazerio linija, o signalui aptikti buvo naudojamas 660/20 nm juostinis filtras.
Surinktos ląstelės buvo centrifuguojamos (1110 aps./min., 5 minutės, 4 °C) ir laikomos -80 °C temperatūroje iki naudojimo. Mfn2cKO pelės ir jų vados jaunikliai klasifikuojami tą pačią dieną, siekiant sumažinti procedūrinį kintamumą. FACS duomenų pateikimas ir analizė atlikta naudojant „FlowJo“ programinę įrangą („FlowJo LLC“, Ašlandas, Oregonas, JAV).
Kaip minėta pirmiau (59), realaus laiko PGR naudojama DNR išskyrimui iš surūšiuotų neuronų, kad būtų galima atlikti tolesnį mtDNR kiekybinį nustatymą. Iš pradžių tiesiškumas ir slenkstinis jautrumas buvo patikrinti naudojant kPGR skirtingam ląstelių skaičiui. Trumpai tariant, surinkite 300 PN į lizės buferį, kurį sudaro 50 mM tris-HCl (pH 8,5), 1 mM EDTA, 0,5 % Tween 20 ir proteinazė K (200 ng/ml), ir inkubuokite 55 °C temperatūroje 120 minučių. Ląstelės buvo toliau inkubuojamos 95 °C temperatūroje 10 minučių, siekiant užtikrinti visišką proteinazės K inaktyvavimą. Naudojant mt-Nd1 specifinį TaqMan zondą („Thermo Fisher“), mtDNR buvo išmatuota pusiau kiekybine PGR 7900HT realaus laiko PGR sistemoje („Thermo Fisher Scientific“). „Science“, katalogo numeris Mm04225274_s1), mt-Nd6 („Thermo Fisher Scientific“, katalogo numeris AIVI3E8) ir 18S („Thermo Fisher Scientific“, katalogo numeris Hs99999901_s1) genai.
Proteomo mėginio paruošimas. Tirpalas 10 minučių kaitinamas 95 °C temperatūroje ir sonikuojamas lizės buferyje [6 M guanidino chloridas, 10 mM tris(2-karboksietil)fosfino hidrochloridas, 10 mM chloracetamidas ir 100 mM tris-Lyze užšaldyti neuronų granulės HCl tirpale]. Bioruptor (Diagenode) aparatu 10 minučių (30 sekundžių impulsas / 30 sekundžių pauzė). Mėginys buvo praskiestas santykiu 1:10 20 mM tris-HCl (pH 8,0), sumaišytas su 300 ng tripsino aukso (Promega) ir inkubuojamas per naktį 37 °C temperatūroje, kad būtų pasiektas visiškas virškinimas. Antrą dieną mėginys buvo centrifuguojamas 20 000 g greičiu 20 minučių. Supernatantas buvo praskiestas 0,1 % skruzdžių rūgštimi, o tirpalas buvo nudruskintas naudojant savarankiškai pagamintus „StageTips“ antgalius. Mėginys buvo džiovinamas „SpeedVac“ prietaisu („Eppendorf“ koncentratorius plius 5305) 45 °C temperatūroje, o tada peptidas buvo suspenduotas 0,1 % skruzdžių rūgštyje. Visus mėginius vienu metu paruošė tas pats asmuo. Astrocitų mėginiams analizuoti 4 μg nudruskintų peptidų buvo paženklinti tandeminiu masės žymekliu („TMT10plex“, katalogo numeris 90110, „Thermo Fisher Scientific“), kurio peptido ir TMT reagento santykis buvo 1:20. TMT žymėjimui 0,8 mg TMT reagento buvo resuspenduota 70 μl bevandenio ACN, o išdžiovintas peptidas buvo ištirpintas 9 μl 0,1 M TEAB (trietilamonio bikarbonato), į kurį buvo įpilta 7 μl TMT reagento ACN. Koncentracija buvo 43,75 %. Po 60 minučių inkubacijos reakcija buvo sustabdyta 2 μl 5 % hidroksilamino. Pažymėti peptidai buvo surinkti, išdžiovinti, resuspenduoti 200 μl 0,1 % skruzdžių rūgšties (FA), padalinti į dvi dalis ir tada nudruskinti naudojant savarankiškai pagamintus „StageTips“. Naudojant „UltiMate 3000“ itin efektyvų skysčių chromatografą (UltiMate 3000 itin efektyvus skysčių chromatografas), viena iš dviejų pusių buvo frakcionuota 1 mm x 150 mm „Acquity“ chromatografinėje kolonėlėje, užpildytoje 130 Å1,7 μm C18 dalelėmis („Waters“, katalogo Nr. SKU: 186006935). „Thermo Fisher Scientific“. Peptidai atskirti 30 μl/min. srauto greičiu, atskirti nuo 1 % iki 50 % buferio B 85 minutes su laipsnišku 96 minučių gradientu, nuo 50 % iki 95 % buferio B 3 minutes, po to 8 minutes 95 % buferiui B; Buferis A yra 5 % ACN ir 10 mM amonio bikarbonato (ABC), o buferis B yra 80 % ACN ir 10 mM ABC. Kas 3 minutes surinkite frakcijas ir sujunkite jas į dvi grupes (1 + 17, 2 + 18 ir t. t.) ir išdžiovinkite vakuuminėje centrifugoje.
LC-MS/MS analizė. Masių spektrometrijai peptidai (numeris r119.aq) buvo atskirti 25 cm, 75 μm vidinio skersmens „PicoFrit“ analitinėje kolonėlėje (naujas objektyvas, dalies numeris PF7508250), kurioje įrengta 1,9 μm „ReproSil-Pur 120 C18-AQ“ terpė („Dr. Maisch“, gaminys), naudojama „EASY-nLC 1200“ („Thermo Fisher Scientific“, Vokietija). Kolonėlė buvo laikoma 50 °C temperatūroje. A ir B buferiai yra atitinkamai 0,1 % skruzdžių rūgšties vandenyje ir 0,1 % skruzdžių rūgšties 80 % ACN. Peptidai buvo atskirti nuo 6 % iki 31 % B buferio 65 minutes ir nuo 31 % iki 50 % B buferio 5 minutes, naudojant 200 nl/min gradientą. Eliuoti peptidai buvo analizuojami „Orbitrap Fusion“ masių spektrometru („Thermo Fisher Scientific“). Peptido pirmtako m/z matavimas atliekamas 120 000 skiriamąja geba 350–1500 m/z diapazone. Naudojant 27 % normalizuotą susidūrimo energiją, didelės energijos C gaudyklės disociacijos (HCD) skilimui parenkamas stipriausias pirmtakas, kurio krūvio būsena yra nuo 2 iki 6. Ciklo laikas nustatytas į 1 s. Peptido fragmento m/z vertė buvo išmatuota jonų gaudyklėje, naudojant mažiausią AGC taikinį – 5 × 104, o maksimalų įpurškimo laiką – 86 ms. Po fragmentacijos pirmtakas 45 s buvo įtrauktas į dinaminį išskyrimo sąrašą. TMT žymėti peptidai buvo atskirti 50 cm, 75 μm „Acclaim PepMap“ kolonėlėje („Thermo Fisher Scientific“, katalogo numeris 164942), o migracijos spektrai analizuoti „Orbitrap Lumos Tribrid“ masių spektrometru („Thermo Fisher Scientific“) su didelės lauko asimetrinių bangų formos jonų (FAIMS) įranga („Thermo Fisher Scientific“), veikiančia esant dviem kompensacinėms įtampoms: −50 ir −70 V. TMT ataskaitos jonų signalui matuoti naudojamas MS3, parinktas pagal sinchronizacijos pirmtaką. Peptidų atskyrimas atliktas naudojant EASY-nLC 1200, naudojant 90 % linijinio gradiento eliuciją, kai buferio koncentracija buvo nuo 6 % iki 31 %; A buferis buvo 0,1 % FA, o B buferis – 0,1 % FA ir 80 % ACN. Analitinė kolonėlė veikia 50 °C temperatūroje. Norėdami padalinti originalų failą pagal FAIMS kompensacinę įtampą, naudokite „FreeStyle“ (1.6 versija, „Thermo Fisher Scientific“).
Baltymų identifikavimas ir kiekybinis įvertinimas. Naudojant integruotą „Andromeda“ paieškos sistemą, originalūs duomenys buvo analizuojami naudojant „MaxQuant“ 1.5.2.8 versiją (https://maxquant.org/). Be Cre rekombinazės ir YFP sekų, gautų iš Aequorea victoria, peptidų fragmentų spektruose buvo ieškoma pelės etaloninio proteomo kanoninės sekos ir izoformų sekos (proteomo ID UP000000589, atsisiųsta iš „UniProt“ 2017 m. gegužės mėn.). Metionino oksidacija ir baltymo N-galo acetilinimas buvo nustatyti kaip kintamos modifikacijos; cisteino karbamoilo metilinimas buvo nustatytas kaip fiksuotos modifikacijos. Virškinimo parametrai nustatyti kaip „specifiškumas“ ir „tripsinas/P“. Mažiausias peptidų ir skustuvo peptidų, naudojamų baltymų identifikavimui, skaičius yra 1; mažiausias unikalių peptidų skaičius yra 0. Peptidų žemėlapio atitikimo sąlygomis baltymų identifikavimo dažnis buvo 0,01. Įjungta parinktis „Antrasis peptidas“. Norėdami perkelti sėkmingus identifikavimus tarp skirtingų originalių failų, naudokite parinktį „suderinti tarp bandymų“. Kiekybiniam įvertinimui be etikečių (LFQ) naudokite LFQ minimalaus santykio skaičių 1 (60). LFQ intensyvumas kiekvienu laiko momentu filtruojamas bent dviem galiojančioms reikšmėms bent vienoje genotipų grupėje ir ekstrapoliuojamas iš normalaus skirstinio, kurio plotis yra 0,3 ir mažėja 1,8. LFQ rezultatams analizuoti naudokite „Perseus“ skaičiavimo platformą (https://maxquant.net/perseus/) ir R (https://r-project.org/). Diferencinės raiškos analizei buvo naudojamas dvipusis vidutinio stiprumo t testas iš „limma“ programinės įrangos paketo (61). Žvalgomoji duomenų analizė atliekama naudojant „ggplot“, „FactoMineR“, „factoextra“, „GGally“ ir „pheatmap“. TMT pagrįsti proteomikos duomenys buvo analizuojami naudojant „MaxQuant“ 1.6.10.43 versiją. Neapdorotų proteomikos duomenų ieškokite „UniProt“ žmogaus proteomikos duomenų bazėje, kuri buvo atsisiųsta 2018 m. rugsėjį. Analizėje įtrauktas gamintojo pateiktas izotopų grynumo korekcijos koeficientas. Diferencinės raiškos analizei R kalboje naudokite „limma“. Pradiniai duomenys, duomenų bazės paieškos rezultatai ir duomenų analizės darbo eiga bei rezultatai saugomi „ProteomeXchange“ aljanse per PRIDE partnerių saugyklą su duomenų rinkinio identifikatoriumi PXD019690.
Funkcinės anotacijos praturtina analizę. Duomenų rinkinio funkcinių anotacijų terminų turtingumui po 8 savaičių nustatyti buvo naudotas „Ingenuity Pathway Analysis“ (QIAGEN) įrankis (1 pav.). Trumpai tariant, kiekybinis baltymų sąrašas, gautas atlikus LC-MS/MS (tandeminės masių spektrometrijos) duomenų analizę, naudojamas su šiais filtravimo kriterijais: kaip rūšis ir fonas pasirinkta Mus musculus, o kategorija rodo P reikšmę, pakoreguotą Benjamini, kad sodrinimas būtų 0,05 ar mažesnis, ir laikomas reikšmingu. Šiame grafike parodytos penkios didžiausios pertekliaus kategorijos kiekviename klasteryje, remiantis pakoreguota P reikšme. Naudojant daugybinį t testą, naudojant Benjamini, Krieger ir Yekutieli dviejų pakopų linijinio stiprinimo programą (Q = 5%), svarbiems kiekvienoje kategorijoje nustatytiems kandidatams atliekama laike vykstanti baltymų raiškos analizė, o kiekviena eilutė analizuojama atskirai. Nereikia taikyti nuoseklaus standartinio nuokrypio.
Norėdami palyginti šio tyrimo rezultatus su paskelbtomis duomenų bazėmis ir sugeneruoti 1 paveiksle pavaizduotą Venno diagramą, kiekybinį baltymų sąrašą sujungėme su „MitoCarta 2.0“ anotacijomis (24). Diagramai sugeneruoti naudojome internetinę priemonę „Draw Venn Diagram“ (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/).
Išsamesnės informacijos apie statistines procedūras, naudojamas proteomikos analizei, rasite atitinkamame „Medžiagos ir metodai“ skyriuje. Visų kitų eksperimentų išsamią informaciją rasite atitinkamoje legendoje. Jei nenurodyta kitaip, visi duomenys pateikti kaip vidurkis ± SEM, o visos statistinės analizės atliktos naudojant „GraphPad Prism 8.1.2“ programinę įrangą.
Papildomos šio straipsnio medžiagos ieškokite adresu http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
Tai yra atviros prieigos straipsnis, platinamas pagal „Creative Commons Attribution-NonCommercial“ licenciją, kuri leidžia naudoti, platinti ir atgaminti bet kokioje terpėje, jei galutinis panaudojimas nėra skirtas komercinei naudai ir jei prielaida yra ta, kad originalus kūrinys yra teisingas. Nuoroda.
Pastaba: prašome jūsų pateikti savo el. pašto adresą tik tam, kad asmuo, kurį rekomenduojate puslapiui, žinotų, jog norite, kad jis matytų el. laišką ir kad tai nėra šlamštas. Mes neužfiksuosime jokių el. pašto adresų.
Šis klausimas naudojamas norint patikrinti, ar esate lankytojas, ir užkirsti kelią automatiniam šlamšto siuntimui.
E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larsonas
Disfunkcinių neuronų proteomikos analizė parodė, kad metabolinės programos yra aktyvuojamos siekiant neutralizuoti neurodegeneraciją.
E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larsonas
Disfunkcinių neuronų proteomikos analizė parodė, kad metabolinės programos yra aktyvuojamos siekiant neutralizuoti neurodegeneraciją.
©2020 Amerikos mokslo pažangos asociacija. visos teisės saugomos. AAAS yra HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ir COUNTER partneris. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.