Straipsnis yra tyrimų temos „Pažangios bioremediacijos technologijos ir sintetinių organinių junginių (SOC) perdirbimo procesai“ dalis. Peržiūrėti visus 14 straipsnių.
Mažos molekulinės masės policikliniai aromatiniai angliavandeniliai (PAH), tokie kaip naftalenas ir pakeisti naftalinai (metilnaftalenas, naftoinė rūgštis, 1-naftil-N-metilkarbamatas ir kt.), yra plačiai naudojami įvairiose pramonės šakose ir yra genotoksiški, mutageniški ir (arba) kancerogeniški organizmams. Šie sintetiniai organiniai junginiai (SOC) arba ksenobiotikai laikomi prioritetiniais teršalais ir kelia rimtą grėsmę pasaulio aplinkai ir visuomenės sveikatai. Žmogaus veiklos intensyvumas (pvz., anglies dujofikacija, naftos perdirbimas, transporto priemonių išmetamosios dujos ir žemės ūkio taikymas) lemia šių visur esančių ir patvarių junginių koncentraciją, likimą ir pernašą. Be fizinių ir cheminių apdorojimo / šalinimo metodų, kaip saugi, ekonomiška ir perspektyvi alternatyva atsirado ekologiškos ir aplinkai nekenksmingos technologijos, tokios kaip bioremediacija, kuriose naudojami mikroorganizmai, galintys visiškai suskaidyti POC arba paversti juos netoksiškais šalutiniais produktais. Įvairios dirvožemio mikrobiotoje esančių bakterijų rūšys, priklausančios proteobakterijų (Pseudomonas, Pseudomonas, Comamonas, Burkholderia ir Neosphingobacterium), firmikutų (Bacillus ir Paenibacillus) ir aktinobakterijų (Rhodococcus ir Arthrobacter) filoms, parodė gebėjimą skaidyti įvairius organinius junginius. Metabolizmo tyrimai, genomika ir metagenominė analizė padeda suprasti šių paprastų gyvybės formų katabolinį sudėtingumą ir įvairovę, o tai gali būti toliau taikoma efektyviam biologiniam skaidymui. Ilgalaikis PAH egzistavimas lėmė naujų skaidymo fenotipų atsiradimą per horizontalų genų perdavimą, naudojant genetinius elementus, tokius kaip plazmidės, transpozonai, bakteriofagai, genominės salos ir integraciniai konjugaciniai elementai. Sistemų biologija ir specifinių izoliatų ar modelinių bendrijų (konsorciumų) genetinė inžinerija gali sudaryti sąlygas išsamiai, greitai ir efektyviai atlikti šių PAH bioremediaciją per sinergetinį poveikį. Šioje apžvalgoje daugiausia dėmesio skiriame skirtingiems naftaleno ir pakeisto naftalino skaidančių bakterijų metabolizmo keliams ir įvairovei, genetinei sudėčiai ir įvairovei bei ląsteliniams atsakams / adaptacijai. Tai suteiks ekologinės informacijos, skirtos lauko pritaikymui ir padermių optimizavimui, siekiant efektyvios bioremediacijos.
Sparčiai vystantis pramonės šakoms (naftos chemijos, žemės ūkio, farmacijos, tekstilės dažų, kosmetikos ir kt.) prisidėjo prie pasaulinės ekonomikos klestėjimo ir pagerėjusio gyvenimo lygio. Dėl šios eksponentinės plėtros atsirado daug sintetinių organinių junginių (SOC), kurie naudojami įvairiems produktams gaminti. Šie pašaliniai junginiai arba SOC apima policiklinius aromatinius angliavandenilius (PAH), pesticidus, herbicidus, plastifikatorius, dažiklius, vaistus, organofosfatus, antipirenus, lakuosius organinius tirpiklius ir kt. Jie išmetami į atmosferą, vandens ir sausumos ekosistemas, kur daro daugialypį poveikį, darydami žalingą poveikį įvairioms bioformoms, pakeisdami fizikines ir chemines savybes bei bendrijų struktūrą (Petrie ir kt., 2015; Bernhardt ir kt., 2017; Sarkar ir kt., 2020). Daugelis aromatinių teršalų daro stiprų ir destruktyvų poveikį daugeliui nepažeistų ekosistemų / biologinės įvairovės židinių (pvz., koraliniams rifams, Arkties / Antarkties ledynams, aukštikalnių ežerams, giliavandenėms nuosėdoms ir kt.) (Jones 2010; Beyer ir kt. 2020; Nordborg ir kt. 2020). Naujausi geomikrobiologiniai tyrimai parodė, kad sintetinių organinių medžiagų (pvz., aromatinių teršalų) ir jų darinių nusėdimas ant dirbtinių konstrukcijų (statytos aplinkos) paviršių (pvz., kultūros paveldo objektų ir paminklų, pagamintų iš granito, akmens, medžio ir metalo) pagreitina jų degradaciją (Gadd 2017; Liu ir kt. 2018). Žmogaus veikla gali sustiprinti ir pabloginti paminklų ir pastatų biologinį degradavimą dėl oro taršos ir klimato kaitos (Liu ir kt. 2020). Šie organiniai teršalai reaguoja su atmosferoje esančiais vandens garais ir nusėda ant konstrukcijos, sukeldami fizinį ir cheminį medžiagos degradaciją. Biologinis degradavimas yra plačiai pripažįstamas kaip nepageidaujami gyvų organizmų sukelti medžiagų išvaizdos ir savybių pokyčiai, kurie turi įtakos jų išsaugojimui (Pochon ir Jaton, 1967). Tolesnis šių junginių mikrobų poveikis (metabolizmas) gali sumažinti struktūrinį vientisumą, konservavimo efektyvumą ir kultūrinę vertę (Gadd, 2017; Liu ir kt., 2018). Kita vertus, kai kuriais atvejais nustatyta, kad mikrobų prisitaikymas prie šių struktūrų ir reakcija į jas yra naudinga, nes jos sudaro bioplėveles ir kitas apsaugines pluteles, kurios sumažina irimo/skilimo greitį (Martino, 2016). Todėl norint sukurti veiksmingas ilgalaikes ir tvarias akmens, metalo ir medžio paminklų konservavimo strategijas, reikia gerai suprasti pagrindinius šiame procese dalyvaujančius procesus. Palyginti su natūraliais procesais (geologiniais procesais, miškų gaisrais, ugnikalnių išsiveržimais, augalų ir bakterijų reakcijomis), žmogaus veikla lemia didelių policiklinių aromatinių angliavandenilių (PAH) ir kitos organinės anglies (OC) kiekių išleidimą į ekosistemas. Daugelis PAH, naudojamų žemės ūkyje (insekticidai ir pesticidai, tokie kaip DDT, atrazinas, karbarilas, pentachlorfenolis ir kt.), pramonėje (žalioje naftoje, naftos dumbluose/atliekose, iš naftos gautame plastike, PCB, plastifikatoriuose, plovikliuose, dezinfekavimo priemonėse, fumigantuose, kvapiosiose medžiagose ir konservantuose), asmeninės priežiūros priemonėse (apsauginiuose kremuose nuo saulės, dezinfekantuose, vabzdžius atbaidančiuose priemonėse ir policikliniuose muskuso junginiuose) ir šaudmenyse (sprogmenyse, tokiuose kaip 2,4,6-TNT), yra potencialūs ksenobiotikai, galintys paveikti planetos sveikatą (Srogi, 2007; Vamsee-Krishna ir Phale, 2008; Petrie ir kt., 2015). Šį sąrašą galima išplėsti, įtraukiant iš naftos gautus junginius (mazutus, tepalus, asfaltenus), didelės molekulinės masės bioplastikus ir joninius skysčius (Amde ir kt., 2015). 1 lentelėje išvardyti įvairūs aromatiniai teršalai ir jų panaudojimas įvairiose pramonės šakose. Pastaraisiais metais antropogeninės kilmės lakiųjų organinių junginių, taip pat anglies dioksido ir kitų šiltnamio efektą sukeliančių dujų emisijos pradėjo didėti (Dvorak ir kt., 2017). Tačiau antropogeninis poveikis gerokai viršija natūralų. Be to, nustatėme, kad nemažai organinių organinių junginių išlieka daugelyje aplinkos aplinkų ir yra identifikuoti kaip nauji teršalai, darantys neigiamą poveikį biomoms (1 pav.). Aplinkosaugos agentūros, tokios kaip Jungtinių Valstijų aplinkos apsaugos agentūra (USEPA), įtraukė daugelį šių teršalų į savo prioritetinį sąrašą dėl jų citotoksinių, genotoksinių, mutageninių ir kancerogeninių savybių. Todėl reikalingi griežti šalinimo reglamentai ir veiksmingos atliekų apdorojimo / šalinimo iš užterštų ekosistemų strategijos. Įvairūs fizikiniai ir cheminiai apdorojimo metodai, tokie kaip pirolizė, oksidacinis terminis apdorojimas, oro aeravimas, sąvartynų šalinimas, deginimas ir kt., yra neefektyvūs ir brangūs, be to, susidaro ėsdinantys, toksiški ir sunkiai apdorojami šalutiniai produktai. Didėjant pasauliniam aplinkosauginiam sąmoningumui, mikroorganizmai, gebantys skaidyti šiuos teršalus ir jų darinius (pvz., halogenintus, nitro, alkil ir (arba) metil junginius), sulaukia vis daugiau dėmesio (Fennell ir kt., 2004; Haritash ir Kaushik, 2009; Phale ir kt., 2020; Sarkar ir kt., 2020; Schwanemann ir kt., 2020). Šių vietinių mikroorganizmų kandidatų naudojimas atskirai arba mišriose kultūrose (kolonijose) aromatiniams teršalams šalinti turi pranašumų aplinkos saugos, kainos, efektyvumo, veiksmingumo ir tvarumo požiūriu. Tyrėjai taip pat tyrinėja mikrobinių procesų integravimą su elektrocheminiais redokso metodais, būtent bioelektrocheminėmis sistemomis (BES), kaip perspektyvią teršalų valymo / šalinimo technologiją (Huang ir kt., 2011). BES technologija sulaukia vis daugiau dėmesio dėl savo didelio efektyvumo, mažos kainos, saugos aplinkai, veikimo kambario temperatūroje, biologiškai suderinamų medžiagų ir gebėjimo regeneruoti vertingus šalutinius produktus (pvz., elektrą, kurą ir chemines medžiagas) (Pant ir kt., 2012; Nazari ir kt., 2020). Didelio našumo genomo sekoskaitos ir omikos įrankių/metodų atsiradimas suteikė daug naujos informacijos apie įvairių skaidančių mikroorganizmų reakcijų genetinį reguliavimą, proteomiką ir fluksomiką. Šių įrankių derinimas su sistemų biologija dar labiau pagerino mūsų supratimą apie tikslinių katabolinių kelių mikroorganizmuose parinkimą ir tikslų derinimą (t. y. metabolinį dizainą), siekiant efektyvaus ir veiksmingo biologinio skaidymo. Norėdami sukurti veiksmingas bioremediacijos strategijas, naudodami tinkamus kandidatus į mikroorganizmus, turime suprasti mikroorganizmų biocheminį potencialą, metabolinę įvairovę, genetinę sudėtį ir ekologiją (autoekologiją/sinekologiją).
1 pav. Mažos molekulinės masės PAH šaltiniai ir keliai įvairiose aplinkose ir įvairūs veiksniai, darantys įtaką biotai. Punktyrinės linijos žymi ekosistemos elementų sąveiką.
Šioje apžvalgoje bandėme apibendrinti duomenis apie paprastų PAH, tokių kaip naftalenas ir pakeisti naftalinai, skaidymą įvairių bakterijų izoliatų, apimantį metabolinius kelius ir įvairovę, skaidyme dalyvaujančius fermentus, genų sudėtį / turinį ir įvairovę, ląstelių atsakus ir įvairius bioremediacijos aspektus. Biocheminių ir molekulinių lygmenų supratimas padės nustatyti tinkamas šeimininko padermes ir atlikti tolesnę jų genetinę inžineriją, siekiant efektyviai atlikti tokių prioritetinių teršalų bioremediaciją. Tai padės sukurti strategijas, skirtas sukurti konkrečioje vietoje veikiančius bakterijų konsorciumus, skirtus veiksmingai bioremediacijai.
Didelis skaičius toksiškų ir pavojingų aromatinių junginių (atitinkančių Huckelio taisyklę 4n + 2π elektronai, n = 1, 2, 3 ir kt.) kelia rimtą grėsmę įvairioms aplinkos terpėms, tokioms kaip oras, dirvožemis, nuosėdos, paviršiniai ir gruntiniai vandenys (Puglisi ir kt., 2007). Šie junginiai turi vieną benzeno žiedą (monociklinį) arba kelis benzeno žiedus (policiklinį), išdėstytus linijine, kampine arba klasterine forma, ir pasižymi stabilumu (stabilumu / nestabilumu) aplinkoje dėl didelės neigiamos rezonansinės energijos ir inertiškumo (inertiškumo), kurį galima paaiškinti jų hidrofobiškumu ir redukuota būsena. Kai aromatinis žiedas papildomai pakeičiamas metilo (-CH3), karboksilo (-COOH), hidroksilo (-OH) arba sulfonato (-HSO3) grupėmis, jis tampa stabilesnis, turi stipresnį afinitetą makromolekulėms ir yra bioakumuliacinis biologinėse sistemose (Seo ir kt., 2009; Phale ir kt., 2020). Kai kurie mažos molekulinės masės policikliniai aromatiniai angliavandeniliai (MMAR), tokie kaip naftalenas ir jo dariniai [metilnaftalenas, naftoinė rūgštis, naftalensulfonatas ir 1-naftil-N-metilkarbamatas (karbarilas)], buvo įtraukti į JAV Aplinkos apsaugos agentūros prioritetinių organinių teršalų sąrašą kaip genotoksiški, mutageniniai ir (arba) kancerogeniniai (Cerniglia, 1984). Šios klasės NMPAH išleidimas į aplinką gali sukelti šių junginių bioakumuliaciją visuose maisto grandinės lygmenyse, taip paveikdamas ekosistemų sveikatą (Binkova ir kt., 2000; Srogi, 2007; Quinn ir kt., 2009).
PAH šaltiniai ir keliai į biotą daugiausia vyksta per migraciją ir sąveiką tarp skirtingų ekosistemos komponentų, tokių kaip dirvožemis, gruntinis vanduo, paviršinis vanduo, pasėliai ir atmosfera (Arey ir Atkinson, 2003). 1 paveiksle parodyta skirtingų mažos molekulinės masės PAH sąveika ir pasiskirstymas ekosistemose bei jų poveikio biotai / žmonėms keliai. PAH nusėda ant paviršių dėl oro taršos ir per transporto priemonių išmetamųjų teršalų, pramoninių išmetamųjų dujų (anglies dujofikacijos, degimo ir kokso gamybos) migraciją (dreifą) bei jų nusėdimą. Pramoninė veikla, pvz., sintetinių tekstilės gaminių, dažiklių ir dažų gamyba; medienos konservavimas; gumos apdirbimas; cemento gamyba; pesticidų gamyba; ir žemės ūkio taikymas yra pagrindiniai PAH šaltiniai sausumos ir vandens sistemose (Bamforth ir Singleton, 2005; Wick ir kt., 2011). Tyrimai parodė, kad dirvožemis priemiesčių ir miestų teritorijose, šalia greitkelių ir dideliuose miestuose yra jautresnis policikliniams aromatiniams angliavandeniliams (PAH) dėl išmetamų teršalų iš elektrinių, gyvenamųjų namų šildymo, oro ir kelių eismo apkrovų bei statybos veiklos (Suman ir kt., 2016). (2008) tyrimas parodė, kad PAH kiekis dirvožemyje prie kelių Naujajame Orleane, Luizianoje, JAV, siekė net 7189 μg/kg, o atviroje erdvėje – tik 2404 μg/kg. Panašiai, keliuose JAV miestuose netoli anglies dujofikacijos vietų buvo užfiksuotas PAH kiekis, siekiantis net 300 μg/kg (Kanaly ir Harayama, 2000; Bamforth ir Singleton, 2005). Pranešama, kad įvairių Indijos miestų, tokių kaip Delis (Sharma ir kt., 2008), Agros (Dubey ir kt., 2014), Mumbajaus (Kulkarni ir Venkataraman, 2000) ir Visakhapatnamo (Kulkarni ir kt., 2014), dirvožemiuose yra didelė PAH koncentracija. Aromatiniai junginiai lengviau adsorbuojami ant dirvožemio dalelių, organinių medžiagų ir molio mineralų, todėl tampa pagrindiniais anglies kaupikliais ekosistemose (Srogi, 2007; Peng ir kt., 2008). Pagrindiniai PAH šaltiniai vandens ekosistemose yra krituliai (drėgni/sausi krituliai ir vandens garai), miestų nuotekos, nuotekų išleidimas, gruntinio vandens papildymas ir kt. (Srogi, 2007). Apskaičiuota, kad apie 80 % PAH jūrų ekosistemose susidaro dėl kritulių, nuosėdų susidarymo ir atliekų išleidimo (Motelay-Massei ir kt., 2006; Srogi, 2007). Didesnė PAH koncentracija paviršiniame vandenyje arba kietųjų atliekų sąvartynų filtrate galiausiai patenka į gruntinius vandenis, keldama didelę grėsmę visuomenės sveikatai, nes daugiau nei 70 % Pietų ir Pietryčių Azijos gyventojų geria gruntinį vandenį (Duttagupta ir kt., 2019). Neseniai Duttagupta ir kt. (2020) atliktame upių (32) ir gruntinio vandens (235) analizės tyrime iš Vakarų Bengalijos, Indijoje, nustatyta, kad maždaug 53 % miesto gyventojų ir 44 % kaimo gyventojų (iš viso 20 milijonų gyventojų) gali būti paveikti naftaleno (4,9–10,6 μg/l) ir jo darinių. Skirtingi žemės naudojimo modeliai ir padidėjusi gruntinio vandens gavyba laikomi pagrindiniais veiksniais, kontroliuojančiais mažos molekulinės masės PAH vertikalią pernašą (advekciją) požeminiuose sluoksniuose. Nustatyta, kad PAH upių baseinuose ir požeminiuose nuosėdose veikia žemės ūkio nuotekas, komunalinių ir pramoninių nuotekų išleidimą bei kietųjų atliekų / šiukšlių išleidimą. Atmosferos krituliai dar labiau padidina PAH taršą. Didelės PAH ir jų alkilinių darinių koncentracijos (iš viso 51) buvo aptiktos upėse / baseinuose visame pasaulyje, tokiuose kaip Fraserio upė, Louano upė, Denso upė, Misūrio upė, Anacostijos upė, Ebro upė ir Delavero upė (Yunker ir kt., 2002; Motelay-Massei ir kt., 2006; Li ir kt., 2010; Amoako ir kt., 2011; Kim ir kt., 2018). Gango upės baseino nuosėdose nustatyta, kad reikšmingiausios yra naftalenas ir fenantrenas (aptikti 70 % mėginių) (Duttagupta ir kt., 2019). Be to, tyrimai parodė, kad geriamojo vandens chloravimas gali sukelti toksiškesnių deguonimi prisotintų ir chlorintų PAH susidarymą (Manoli ir Samara, 1999). PAH kaupiasi grūduose, vaisiuose ir daržovėse dėl to, kad augalai juos pasisavina iš užteršto dirvožemio, gruntinio vandens ir kritulių (Fismes ir kt., 2002). Daugelis vandens organizmų, tokių kaip žuvys, midijos, moliuskai ir krevetės, yra užteršti PAH vartodami užterštą maistą ir jūros vandenį, taip pat per audinius ir odą (Mackay ir Fraser, 2000). Tokie virimo / apdorojimo metodai kaip kepimas ant grotelių, skrudinimas, rūkymas, kepimas orkaitėje, džiovinimas, kepimas orkaitėje ir kepimas ant žarijų taip pat gali lemti didelį PAH kiekį maiste. Tai labai priklauso nuo rūkymo medžiagos pasirinkimo, fenolių / aromatinių angliavandenilių kiekio, virimo proceso, šildytuvo tipo, drėgmės kiekio, deguonies tiekimo ir degimo temperatūros (Guillén ir kt., 2000; Gomes ir kt., 2013). Piene taip pat buvo aptikta įvairių koncentracijų (0,75–2,1 mg/l) policiklinių aromatinių angliavandenilių (Girelli ir kt., 2014). Šių PAH kaupimasis maiste taip pat priklauso nuo maisto fizikinių ir cheminių savybių, o jų toksinis poveikis yra susijęs su fiziologinėmis funkcijomis, metaboliniu aktyvumu, absorbcija, pasiskirstymu ir pasiskirstymu organizme (Mechini ir kt., 2011).
Policiklinių aromatinių angliavandenilių (PAH) toksiškumas ir žalingas poveikis žinomas jau seniai (Cherniglia, 1984). Mažos molekulinės masės policikliniai aromatiniai angliavandeniliai (MMW-PAH) (su dviem ar trim žiedais) gali kovalentiškai jungtis prie įvairių makromolekulių, tokių kaip DNR, RNR ir baltymai, ir yra kancerogeniški (Santarelli ir kt., 2008). Dėl savo hidrofobinio pobūdžio juos skiria lipidinės membranos. Žmonių organizme citochromo P450 monooksigenazės oksiduoja PAH iki epoksidų, iš kurių kai kurie yra labai reaktyvūs (pvz., baediolio epoksidas) ir gali sukelti normalių ląstelių transformaciją į piktybines (Marston ir kt., 2001). Be to, PAH transformacijos produktai, tokie kaip chinonai, fenoliai, epoksidai, dioliai ir kt., yra toksiškesni nei pirminiai junginiai. Kai kurie PAH ir jų metaboliniai tarpiniai produktai gali paveikti hormonus ir įvairius metabolizmo fermentus, taip neigiamai paveikdami augimą, centrinę nervų sistemą, reprodukcinę ir imuninę sistemas (Swetha ir Phale, 2005; Vamsee-Krishna ir kt., 2006; Oostingh ir kt., 2008). Pranešama, kad trumpalaikis mažos molekulinės masės PAH poveikis sutrikdo plaučių funkciją ir trombozę astma sergantiems asmenims bei padidina odos, plaučių, šlapimo pūslės ir virškinimo trakto vėžio riziką (Olsson ir kt., 2010; Diggs ir kt., 2011). Tyrimai su gyvūnais taip pat parodė, kad PAH poveikis gali neigiamai paveikti reprodukcinę funkciją ir vystymąsi bei sukelti kataraktą, inkstų ir kepenų pažeidimus bei geltą. Įvairūs PAH biotransformacijos produktai, tokie kaip dioliai, epoksidai, chinonai ir laisvieji radikalai (katijonai), sudaro DNR aduktus. Nustatyta, kad stabilūs aduktai keičia DNR replikacijos mechanizmą, o nestabilūs aduktai gali depurinuoti DNR (daugiausia iki adenino, o kartais iki guanino); abu gali sukelti klaidas, dėl kurių atsiranda mutacijos (Schweigert ir kt., 2001). Be to, chinonai (benzo-/pan-) gali generuoti reaktyviąsias deguonies formas (ROS), kurios gali mirtinai pažeisti DNR ir kitas makromolekules ir taip paveikti audinių funkciją/gyvybingumą (Ewa ir Danuta, 2017). Pranešta, kad lėtinis mažų pireno, bifenilo ir naftaleno koncentracijų poveikis eksperimentiniams gyvūnams sukelia vėžį (Diggs ir kt., 2012). Dėl jų mirtino toksiškumo šių PAH valymas/pašalinimas iš paveiktų/užterštų vietų yra prioritetas.
PAH šalinimui iš užterštų vietų / aplinkos buvo naudojami įvairūs fizikiniai ir cheminiai metodai. Tokie procesai kaip deginimas, dechlorinimas, UV oksidacija, fiksacija ir tirpiklių ekstrakcija turi daug trūkumų, įskaitant toksiškų šalutinių produktų susidarymą, proceso sudėtingumą, saugos ir reguliavimo problemas, mažą efektyvumą ir dideles sąnaudas. Tačiau mikrobų biologinis skaidymas (vadinamas bioremediacija) yra perspektyvus alternatyvus metodas, apimantis mikroorganizmų naudojimą grynų kultūrų arba kolonijų pavidalu. Palyginti su fizikiniais ir cheminiais metodais, šis procesas yra ekologiškas, neinvazinis, ekonomiškas ir tvarus. Bioremediacija gali būti atliekama paveiktoje vietoje (in situ) arba specialiai paruoštoje vietoje (ex situ), todėl laikoma tvaresniu valymo metodu nei tradiciniai fizikiniai ir cheminiai metodai (Juhasz ir Naidu, 2000; Andreoni ir Gianfreda, 2007; Megharaj ir kt., 2011; Phale ir kt., 2020; Sarkar ir kt., 2020).
Mikrobinių medžiagų apykaitos etapų, susijusių su aromatinių teršalų skaidymu, supratimas turi milžinišką mokslinę ir ekonominę reikšmę ekologiniam ir aplinkos tvarumui. Apskaičiuota, kad visame pasaulyje nuosėdose ir organiniuose junginiuose (t. y. naftoje, gamtinėse dujose ir anglyse, t. y. iškastiniame kure) yra sukaupta 2,1 × 1018 gramo anglies (C), o tai reikšmingai prisideda prie pasaulinio anglies ciklo. Tačiau sparti industrializacija, iškastinio kuro gavyba ir žmogaus veikla eikvoja šiuos litosferos anglies rezervuarus, kasmet į atmosferą išleisdama apie 5,5 × 1015 g organinės anglies (kaip teršalų) (Gonzalez-Gaya ir kt., 2019). Didžioji dalis šios organinės anglies patenka į sausumos ir jūrų ekosistemas per sedimentaciją, pernašą ir nuotėkį. Be to, nauji sintetiniai teršalai, gauti iš iškastinio kuro, pvz., plastikai, plastifikatoriai ir plastiko stabilizatoriai (ftalatai ir jų izomerai), smarkiai teršia jūrų, dirvožemio ir vandens ekosistemas bei jų biotą, taip padidindami pasaulinę klimato riziką. Įvairūs mikroplastiko, nanoplastiko, plastiko fragmentų ir jų toksiškų monomerų produktų, gautų iš polietileno tereftalato (PET), tipai susikaupė Ramiajame vandenyne tarp Šiaurės Amerikos ir Pietryčių Azijos, sudarydami „Didžiąją Ramiojo vandenyno šiukšlių dėmę“, kenkiančią jūros gyvūnijai (Newell ir kt., 2020). Moksliniai tyrimai įrodė, kad tokių teršalų / atliekų neįmanoma pašalinti jokiais fiziniais ar cheminiais metodais. Šiame kontekste naudingiausi mikroorganizmai yra tie, kurie geba oksidaciniu būdu metabolizuoti teršalus į anglies dioksidą, cheminę energiją ir kitus netoksiškus šalutinius produktus, kurie galiausiai patenka į kitus maistinių medžiagų ciklo procesus (H, O, N, S, P, Fe ir kt.). Todėl, norint įvertinti mikrobų anglies ciklą, grynąjį anglies biudžetą ir būsimą klimato riziką, labai svarbu suprasti aromatinių teršalų mineralizacijos mikrobinę ekofiziologiją ir jos aplinkos kontrolę. Atsižvelgiant į neatidėliotiną poreikį pašalinti tokius junginius iš aplinkos, atsirado įvairios ekologinės pramonės šakos, orientuotos į švarias technologijas. Arba pramoninių atliekų / cheminių atliekų, sukauptų ekosistemose, vertės didinimas (t. y. „iš atliekų į turtą“ metodas) laikomas vienu iš žiedinės ekonomikos ir darnaus vystymosi tikslų ramsčių (Close ir kt., 2012). Todėl šių potencialių skaidymo kandidatų metabolinių, fermentinių ir genetinių aspektų supratimas yra nepaprastai svarbus norint veiksmingai pašalinti ir bioremediatuoti tokius aromatinius teršalus.
Tarp daugelio aromatinių teršalų ypatingą dėmesį skiriame mažos molekulinės masės PAH, tokiems kaip naftalenas ir pakeistieji naftalinai. Šie junginiai yra pagrindiniai iš naftos gaunamo kuro, tekstilės dažų, vartojimo prekių, pesticidų (naftalenų ir vabzdžius atbaidančių priemonių), plastifikatorių ir taninų komponentai, todėl yra plačiai paplitę daugelyje ekosistemų (Preuss ir kt., 2003). Naujausiose ataskaitose pabrėžiama naftaleno koncentracijų kaupimasis vandeningojo sluoksnio nuosėdose, gruntiniame vandenyje ir požeminiame dirvožemyje, vadozių zonose ir upių vagose, o tai rodo jo bioakumuliaciją aplinkoje (Duttagupta ir kt., 2019, 2020). 2 lentelėje apibendrintos naftaleno ir jo darinių fizikinės ir cheminės savybės, panaudojimas ir poveikis sveikatai. Palyginti su kitais didelės molekulinės masės PAH, naftalenas ir jo dariniai yra mažiau hidrofobiniai, geriau tirpsta vandenyje ir plačiai paplitę ekosistemose, todėl jie dažnai naudojami kaip modeliniai substratai PAH metabolizmui, genetikai ir metabolinei įvairovei tirti. Daugybė mikroorganizmų geba metabolizuoti naftaliną ir jo darinius, ir yra išsamios informacijos apie jų metabolizmo kelius, fermentus ir reguliavimo ypatybes (Mallick ir kt., 2011; Phale ir kt., 2019, 2020). Be to, naftalinas ir jo dariniai yra laikomi prototipiniais junginiais aplinkos taršos vertinimui dėl jų didelio gausumo ir biologinio prieinamumo. JAV Aplinkos apsaugos agentūra apskaičiavo, kad vidutinis naftaleno kiekis cigarečių dūmuose, daugiausia dėl nepilno sudegimo, yra 5,19 μg kubiniame metre, ir nuo 7,8 iki 46 μg iš šalutinių dūmų srauto, o kreozoto ir naftaleno poveikis yra 100–10 000 kartų didesnis (Preuss ir kt., 2003). Nustatyta, kad naftalinas pasižymi rūšiai, regionui ir lyčiai būdingu kvėpavimo takų toksiškumu ir kancerogeniškumu. Remdamasi tyrimais su gyvūnais, Tarptautinė vėžio tyrimų agentūra (IARC) naftaliną priskyrė „galimų žmogaus kancerogenų“ kategorijai (2B grupė)1. Pakeistų naftalinų poveikis, daugiausia įkvėpus arba parenteraliai (per burną), sukelia plaučių audinių pažeidimą ir padidina plaučių navikų dažnį žiurkėms ir pelėms (Nacionalinė toksikologijos programa 2). Ūminis poveikis yra pykinimas, vėmimas, pilvo skausmas, viduriavimas, galvos skausmas, sumišimas, gausus prakaitavimas, karščiavimas, tachikardija ir kt. Kita vertus, pranešama, kad plataus spektro karbamato insekticidas karbarilas (1-naftil-N-metilkarbamatas) yra toksiškas vandens bestuburiams, varliagyviams, bitėms ir žmonėms, ir įrodyta, kad jis slopina acetilcholinesterazę, sukeldamas paralyžių (Smulders ir kt., 2003; Bulen ir Distel, 2011). Todėl mikrobų skaidymo, genetinio reguliavimo, fermentinių ir ląstelinių reakcijų mechanizmų supratimas yra labai svarbus kuriant bioremediacijos strategijas užterštoje aplinkoje.
2 lentelė. Išsami informacija apie naftaleno ir jo darinių fizikines ir chemines savybes, panaudojimą, identifikavimo metodus ir susijusias ligas.
Užterštose nišose hidrofobiniai ir lipofiliniai aromatiniai teršalai gali sukelti įvairų ląstelių poveikį aplinkos mikrobiomui (bendruomenei), pavyzdžiui, membranos takumo, membranos pralaidumo pokyčius, lipidų dvigubo sluoksnio patinimą, energijos perdavimo sutrikimus (elektronų pernašos grandinė / protonų varomoji jėga) ir su membrana susijusių baltymų aktyvumą (Sikkema ir kt., 1995). Be to, kai kurie tirpūs tarpiniai produktai, tokie kaip katecholiai ir chinonai, generuoja reaktyviąsias deguonies rūšis (ROS) ir sudaro aduktus su DNR ir baltymais (Penning ir kt., 1999). Taigi, tokių junginių gausa ekosistemose daro selektyvų spaudimą mikrobų bendrijoms tapti efektyviais skaidytojais įvairiais fiziologiniais lygmenimis, įskaitant įsisavinimą / transportavimą, tarpląstelinę transformaciją, asimiliaciją / panaudojimą ir susiskaldymą į kompartmentus.
Ribosomų duomenų bazės projekto II (RDP-II) paieška parodė, kad iš terpių arba sodrinimo kultūrų, užterštų naftalenu arba jo dariniais, buvo išskirtos iš viso 926 bakterijų rūšys. Proteobakterijų grupėje buvo daugiausia atstovų (n = 755), po jų sekė Firmicutes (52), Bacteroidetes (43), Actinobacteria (39), Tenericutes (10) ir neklasifikuotos bakterijos (8) (2 pav.). γ-proteobakterijų (Pseudomonadales ir Xanthomonadales) atstovai dominavo visose gramneigiamų bakterijų grupėse, pasižymėdami dideliu G+C kiekiu (54 %), o Clostridiales ir Bacillales (30 %) buvo gramteigiamos grupės, pasižymėdamos mažu G+C kiekiu. Pranešta, kad Pseudomonas (didžiausias skaičius – 338 rūšys) gali skaidyti naftaliną ir jo metilo darinius įvairiose užterštose ekosistemose (akmens anglių degute, naftoje, žalioje naftoje, dumble, naftos išsiliejimuose, nuotekose, organinėse atliekose ir sąvartynuose), taip pat nepažeistose ekosistemose (dirvožemyje, upėse, nuosėdose ir gruntiniame vandenyje) (2 pav.). Be to, kai kurių iš šių regionų praturtėjimo tyrimai ir metagenominė analizė parodė, kad nekultivuojamos Legionella ir Clostridium rūšys gali turėti skaidymo gebėjimą, o tai rodo, kad reikia kultivuoti šias bakterijas, siekiant ištirti naujus metabolinius kelius ir įvairovę.
2 pav. Bakterijų atstovų taksonominė įvairovė ir ekologinis pasiskirstymas naftalinu ir naftaleno dariniais užterštoje aplinkoje.
Iš įvairių aromatinius angliavandenilius skaidančių mikroorganizmų dauguma geba skaidyti naftaliną kaip vienintelį anglies ir energijos šaltinį. Naftaleno metabolizme dalyvaujančių įvykių seka buvo aprašyta Pseudomonas sp. (padermės: NCIB 9816-4, G7, AK-5, PMD-1 ir CSV86), Pseudomonas stutzeri AN10, Pseudomonas fluorescens PC20 ir kitos padermės (ND6 ir AS1) (Mahajan ir kt., 1994; Resnick ir kt., 1996; Annweiler ir kt., 2000; Basu ir kt., 2003; Dennis ir Zylstra, 2004; Sota ir kt., 2006; Metabolizmą inicijuoja daugiakomponentė dioksigenazė [naftaleno dioksigenazė (NDO), žiedą hidroksilinanti dioksigenazė], kuri katalizuoja vieno iš naftaleno aromatinių žiedų oksidaciją, naudodama molekulinį deguonį kaip kitą substratą, ir naftaleną paverčia cis-naftalendioliu (3 pav.). Cis-dihidrodiolis dehidrogenazės paverčiamas 1,2-dihidroksinaftalenu. A Žiedą skaidanti dioksigenazė, 1,2-dihidroksinaftaleno dioksigenazė (12DHNDO), paverčia 1,2-dihidroksinaftaleną į 2-hidroksichromen-2-karboksirūgštį. Fermentinės cis-trans izomerizacija gamina trans-o-hidroksibenzilidenpiruvatą, kurį hidratazės aldolazė skaido į salicilo aldehidą ir piruvatą. Organinės rūgšties piruvatas buvo pirmasis C3 junginys, gautas iš naftaleno anglies skeleto ir nukreiptas į centrinį anglies kelią. Be to, NAD+ priklausoma salicilaldehido dehidrogenazė paverčia salicilaldehidą į salicilo rūgštį. Metabolizmas šiame etape vadinamas naftaleno skaidymo „viršutiniu keliu“. Šis kelias yra labai dažnas daugumoje naftaleną skaidančių bakterijų. Tačiau yra keletas išimčių; pavyzdžiui, termofilinėje Bacillus hamburgii 2 naftaleno skaidymą inicijuoja naftaleno 2,3-dioksigenazė, susidarant 2,3-dihidroksinaftalenui (Annweiler ir kt., 2000 m.).
3 pav. Naftaleno, metilnaftaleno, naftoinės rūgšties ir karbarilo skaidymo keliai. Apskritimais pažymėti skaičiai žymi fermentus, atsakingus už nuoseklų naftaleno ir jo darinių virsmą į vėlesnius produktus. 1 – naftaleno dioksigenazė (NDO); 2 – cis-dihidrodiolio dehidrogenazė; 3 – 1,2-dihidroksinaftaleno dioksigenazė; 4 – 2-hidroksichromen-2-karboksirūgšties izomerazė; 5 – trans-O-hidroksibenzilidenpiruvato hidratazės aldolazė; 6 – salicilaldehido dehidrogenazė; 7 – salicilato 1-hidroksilazė; 8 – katecholio 2,3-dioksigenazė (C23DO); 9 – 2-hidroksimukonato semialdehido dehidrogenazė; 10 – 2-oksopent-4-enoato hidratazė; 11 – 4-hidroksi-2-oksopentanoato aldolazė; 12 – acetaldehido dehidrogenazė; 13, katechol-1,2-dioksigenazė (C12DO); 14, mukonato cikloizomerazė; 15, mukonolaktono delta-izomerazė; 16, β-ketoadipatenollaktono hidrolazė; 17, β-ketoadipato sukcinil-CoA transferazė; 18, β-ketoadipato-CoA tiolazė; 19, sukcinil-CoA: acetil-CoA sukciniltransferazė; 20, salicilato 5-hidroksilazė; 21 – gentisato 1,2-dioksigenazė (GDO); 22, maleilpiruvato izomerazė; 23, fumarilpiruvato hidrolazė; 24, metilnaftaleno hidroksilazė (NDO); 25, hidroksimetilnaftaleno dehidrogenazė; 26, naftaldehido dehidrogenazė; 27, 3-formilsalicilo rūgšties oksidazė; 28, hidroksiizoftalato dekarboksilazė; 29, karbarilhidrolazė (CH); 30, 1-naftol-2-hidroksilazė.
Priklausomai nuo organizmo ir jo genetinės sandaros, gauta salicilo rūgštis toliau metabolizuojama arba katecholio būdu, naudojant salicilato 1-hidroksilazę (S1H), arba gentisato būdu, naudojant salicilato 5-hidroksilazę (S5H) (3 pav.). Kadangi salicilo rūgštis yra pagrindinis naftaleno metabolizmo tarpinis produktas (viršutinis kelias), etapai nuo salicilo rūgšties iki TCA tarpinio produkto dažnai vadinami apatiniu keliu, o genai yra suskirstyti į vieną operoną. Įprasta pastebėti, kad viršutinio kelio operono (nah) ir apatinio kelio operono (sal) genus reguliuoja bendri reguliavimo veiksniai; pavyzdžiui, NahR ir salicilo rūgštis veikia kaip induktoriai, leisdami abiem operonams visiškai metabolizuoti naftaleną (Phale ir kt., 2019, 2020).
Be to, katecholis cikliškai skaidomas į 2-hidroksimukonato semialdehidą meta keliu, veikiant katecholio 2,3-dioksigenazei (C23DO) (Yen ir kt., 1988), ir toliau hidrolizuojamas 2-hidroksimukonato semialdehido hidrolazės, kad susidarytų 2-hidroksipent-2,4-dieno rūgštis. Tada 2-hidroksipent-2,4-dienoatas hidratazės (2-oksopent-4-enoato hidratazės) ir aldolazės (4-hidroksi-2-oksopentanoato aldolazės) veikiamas paverčiamas piruvatu ir acetaldehidu, o tada patenka į centrinį anglies kelią (3 pav.). Arba katecholis cikliškai skaidomas į cis,cis-mukonatą orto keliu, veikiant katecholio 1,2-oksigenazei (C12DO). Mukonato cikloizomerazė, mukonolaktono izomerazė ir β-ketoadipato-nollaktono hidrolazė paverčia cis,cis-mukonatą į 3-oksoadipatą, kuris patenka į centrinį anglies kelią per sukcinil-CoA ir acetil-CoA (Nozaki ir kt., 1968) (3 pav.).
Gentisato (2,5-dihidroksibenzoato) metaboliniame kelyje aromatinis žiedas skaldomas gentisato 1,2-dioksigenazės (GDO) ir susidaro maleilpiruvatas. Šis produktas gali būti tiesiogiai hidrolizuojamas į piruvatą ir malatą arba izomerizuojamas į fumarilpiruvatą, kuris vėliau gali būti hidrolizuojamas į piruvatą ir fumaratą (Larkin ir Day, 1986). Alternatyvaus metabolinio kelio pasirinkimas pastebėtas tiek gramneigiamose, tiek gramteigiamose bakterijose biocheminiu ir genetiniu lygmenimis (Morawski ir kt., 1997; Whyte ir kt., 1997). Gramneigiamos bakterijos (Pseudomonas) renkasi salicilo rūgštį, kuri yra naftaleno metabolizmo induktorius, dekarboksilinant ją į katecholį, naudojant salicilato 1-hidroksilazę (Gibson ir Subramanian, 1984). Kita vertus, gramteigiamose bakterijose (Rhodococcus) salicilato 5-hidroksilazė paverčia salicilo rūgštį gentizo rūgštimi, o salicilo rūgštis neturi indukcinio poveikio naftaleno genų transkripcijai (Grund ir kt., 1992) (3 pav.).
Pranešta, kad tokios rūšys kaip Pseudomonas CSV86, Oceanobacterium NCE312, Marinhomonas naphthotrophicus, Sphingomonas paucimobilis 2322, Vibrio cyclotrophus, Pseudomonas fluorescens LP6a, Pseudomonas ir Mycobacterium rūšys gali skaidyti monometilnaftaleną arba dimetilnaftaleną (Dean-Raymond ir Bartha, 1975; Cane ir Williams, 1982; Mahajan ir kt., 1994; Dutta ir kt., 1998; Hedlund ir kt., 1999). Iš jų Pseudomonas sp. CSV86 1-metilnaftaleno ir 2-metilnaftaleno skaidymo kelias buvo aiškiai ištirtas biocheminiu ir fermentiniu lygmenimis (Mahajan ir kt., 1994). 1-metilnaftalenas metabolizuojamas dviem keliais. Pirma, aromatinis žiedas (nepakeistas metilnaftaleno žiedas) yra hidroksilinamas, kad susidarytų cis-1,2-dihidroksi-1,2-dihidro-8-metilnaftalenas, kuris toliau oksiduojamas į metilsalicilatą ir metilkatecholį, o po žiedo skilimo patenka į centrinį anglies kelią (3 pav.). Šis kelias vadinamas „anglies šaltinio keliu“. Antrajame „detoksikacijos kelyje“ metilo grupė gali būti hidroksilinama NDO, kad susidarytų 1-hidroksimetilnaftalenas, kuris toliau oksiduojamas į 1-naftoinę rūgštį ir išskiriamas į kultūros terpę kaip aklavietės produktas. Tyrimai parodė, kad CSV86 padermė negali augti su 1- ir 2-naftoine rūgštimi kaip vieninteliu anglies ir energijos šaltiniu, o tai patvirtina jos detoksikacijos kelią (Mahajan ir kt., 1994; Basu ir kt., 2003). 2-metilnaftalene metilo grupė yra hidroksilinama hidroksilazės, kad susidarytų 2-hidroksimetilnaftalenas. Be to, nepakeistas naftaleno žiedo žiedas yra hidroksilinamas ir sudaro dihidrodiolį, kuris fermentų katalizuojamų reakcijų serijoje oksiduojamas į 4-hidroksimetilkatecholį ir per meta-žiedo skilimo kelią patenka į centrinį anglies atomų kelią. Panašiai buvo pranešta, kad S. paucimobilis 2322 naudoja NDO 2-metilnaftaleno hidroksilinimui, kuris toliau oksiduojamas ir sudaro metilsalicilatą bei metilkatecholį (Dutta ir kt., 1998).
Naftoinės rūgštys (pakeistos/nepakeistos) yra detoksikacijos/biotransformacijos šalutiniai produktai, susidarantys metilnaftaleno, fenantreno ir antraceno skaidymo metu ir išsiskiriantys į panaudotą kultūros terpę. Pranešta, kad dirvožemio izoliatas Stenotrophomonas maltophilia CSV89 gali metabolizuoti 1-naftoinę rūgštį kaip anglies šaltinį (Phale ir kt., 1995). Metabolizmas prasideda aromatinio žiedo dihidroksilinimu, susidarant 1,2-dihidroksi-8-karboksinaftalenui. Gautas diolis oksiduojamas į katecholį per 2-hidroksi-3-karboksibenzilidenpiruvatą, 3-formilsalicilo rūgštį, 2-hidroksiizoftalo rūgštį ir salicilo rūgštį ir patenka į centrinį anglies kelią per meta-žiedo skilimo kelią (3 pav.).
Karbarilas yra naftilkarbamato pesticidas. Nuo Žaliosios revoliucijos Indijoje aštuntajame dešimtmetyje dėl cheminių trąšų ir pesticidų naudojimo padidėjo policiklinių aromatinių angliavandenilių (PAH) išmetimas iš žemės ūkio pasklidųjų šaltinių (Pingali, 2012; Duttagupta ir kt., 2020). Apskaičiuota, kad 55 % (85 722 000 hektarų) visos dirbamos žemės Indijoje yra apdorojama cheminiais pesticidais. Per pastaruosius penkerius metus (2015–2020 m.) Indijos žemės ūkio sektorius kasmet vidutiniškai sunaudojo nuo 55 000 iki 60 000 tonų pesticidų (Kooperatyvų ir ūkininkų gerovės departamentas, Žemės ūkio ministerija, Indijos vyriausybė, 2020 m. rugpjūčio mėn.). Šiaurinėje ir centrinėje Gango lygumose (valstijose, kuriose yra didžiausias gyventojų skaičius ir tankumas) pesticidų naudojimas pasėliams yra plačiai paplitęs, vyrauja insekticidai. Karbarilas (1-naftil-N-metilkarbamatas) yra plataus spektro, vidutinio arba labai toksiškas karbamato insekticidas, naudojamas Indijos žemės ūkyje vidutiniškai 100–110 tonų. Jis dažniausiai parduodamas prekiniu pavadinimu „Sevin“ ir naudojamas vabzdžiams (amarams, ugninėms skruzdėlėms, blusoms, erkėms, vorams ir daugeliui kitų lauko kenkėjų), kenkiančių įvairiems pasėliams (kukurūzams, sojų pupelėms, medvilnei, vaisiams ir daržovėms), kontroliuoti. Kai kurie mikroorganizmai, tokie kaip Pseudomonas (NCIB 12042, 12043, C4, C5, C6, C7, Pseudomonas putida XWY-1), Rhodococcus (NCIB 12038), Sphingobacterium spp. (CF06), Burkholderia (C3), Micrococcus ir Arthrobacter, taip pat gali būti naudojami kitiems kenkėjams kontroliuoti. Pranešta, kad RC100 gali skaidyti karbarilą (Larkin ir Day, 1986; Chapalamadugu ir Chaudhry, 1991; Hayatsu ir kt., 1999; Swetha ir Phale, 2005; Trivedi ir kt., 2017). Karbarilo skaidymo kelias buvo plačiai tirtas biocheminiu, fermentiniu ir genetiniu lygmenimis dirvožemio izolatuose iš Pseudomonas sp. C4, C5 ir C6 padermių (Swetha ir Phale, 2005; Trivedi ir kt., 2016) (3 pav.). Metabolizmo kelias prasideda nuo esterio jungties hidrolizės, kurią atlieka karbarilo hidrolazė (CH), ir susidaro 1-naftolas, metilaminas ir anglies dioksidas. Tada 1-naftolis 1-naftolio hidroksilazės (1-NH2) veikiamas paverčiamas 1,2-dihidroksinaftalenu, kuris toliau metabolizuojamas centriniu anglies keliu per salicilatą ir gentisatą. Pranešama, kad kai kurios karbarilą skaidančios bakterijos jį metabolizuoja į salicilo rūgštį skaidydamos katecholio orto žiedą (Larkin ir Day, 1986; Chapalamadugu ir Chaudhry, 1991). Pažymėtina, kad naftaliną skaidančios bakterijos salicilo rūgštį daugiausia metabolizuoja per katecholį, o karbarilą skaidančios bakterijos pirmenybę teikia salicilo rūgšties metabolizmui gentisato būdu.
Naftalensulfonrūgšties/disulfonrūgšties ir naftilaminsulfonrūgšties dariniai gali būti naudojami kaip tarpiniai produktai gaminant azodažus, drėkiklius, dispergentus ir kt. Nors šie junginiai yra mažai toksiški žmonėms, citotoksiškumo vertinimai parodė, kad jie yra mirtini žuvims, dafnijoms ir dumbliams (Greim ir kt., 1994). Pranešama, kad Pseudomonas genties atstovai (A3, C22 padermės) metabolizmą inicijuoja dvigubai hidroksilindami aromatinį žiedą, kuriame yra sulfonrūgšties grupė, ir sudaro dihidrodiolį, kuris toliau savaime skaidydamasis sulfito grupei paverčiamas 1,2-dihidroksinaftalenu (Brilon ir kt., 1981). Gautas 1,2-dihidroksinaftalenas katabolizuojamas klasikiniu naftaleno keliu, t. y. katecholio arba gentisato keliu (4 pav.). Įrodyta, kad aminonaftalensulfonrūgštį ir hidroksinaftalensulfonrūgštį gali visiškai suskaidyti mišrūs bakterijų konsorciumai, turintys vienas kitą papildančius katabolinius kelius (Nortemann ir kt., 1986). Įrodyta, kad vienas konsorciumo narys desulfuruoja aminonaftalensulfonrūgštį arba hidroksinaftalensulfonrūgštį 1,2-dioksigeninimo būdu, o aminosalicilatas arba hidroksisalicilatas išsiskiria į kultūros terpę kaip galutinis metabolitas, kurį vėliau pasisavina kiti konsorciumo nariai. Naftalendisulfonrūgštis yra santykinai polinė, bet mažai biologiškai skaidoma, todėl gali būti metabolizuojama skirtingais keliais. Pirmoji desulfurizacija vyksta regioselektyvaus aromatinio žiedo ir sulfonrūgšties grupės dihidroksilinimo metu; antroji desulfurizacija vyksta 5-sulfosalicilo rūgšties hidroksilinimo metu salicilo rūgšties 5-hidroksilaze, susidarant gentizo rūgštiai, kuri patenka į centrinį anglies kelią (Brilon ir kt., 1981) (4 pav.). Už naftaleno skaidymą atsakingi fermentai taip pat yra atsakingi už naftaleno sulfonato metabolizmą (Brilon ir kt., 1981; Keck ir kt., 2006).
4 pav. Naftaleno sulfonato skaidymo metaboliniai keliai. Skaičiai apskritimuose žymi fermentus, atsakingus už naftilsulfonato metabolizmą, panašius / identiškus 3 pav. aprašytiems fermentams.
Mažos molekulinės masės PAH (MMMA-PAH) yra redukuojami, hidrofobiniai ir mažai tirpūs, todėl nėra jautrūs natūraliam skaidymuisi / degradacijai. Tačiau aerobiniai mikroorganizmai gali juos oksiduoti absorbuodami molekulinį deguonį (O2). Šie fermentai daugiausia priklauso oksidoreduktazių klasei ir gali atlikti įvairias reakcijas, tokias kaip aromatinio žiedo hidroksilinimas (mono- arba dihidroksilinimas), dehidrogeninimas ir aromatinio žiedo skaidymas. Šių reakcijų metu gauti produktai yra aukštesnėje oksidacijos būsenoje ir lengviau metabolizuojami per centrinį anglies kelią (Phale ir kt., 2020). Pranešta, kad skaidymo kelio fermentai yra indukuojami. Šių fermentų aktyvumas yra labai mažas arba nereikšmingas, kai ląstelės auginamos paprastuose anglies šaltiniuose, tokiuose kaip gliukozė arba organinės rūgštys. 3 lentelėje apibendrinti įvairūs fermentai (oksigenazės, hidrolazės, dehidrogenazės, oksidazės ir kt.), dalyvaujantys naftaleno ir jo darinių metabolizme.
3 lentelė. Naftaleno ir jo darinių skaidymą lemiančių fermentų biocheminės charakteristikos.
Radioizotopų tyrimai (18O2) parodė, kad molekulinio O2 įterpimas į aromatinius žiedus oksigenazių pagalba yra svarbiausias žingsnis aktyvuojant tolesnį junginio biologinį skaidymą (Hayaishi ir kt., 1955; Mason ir kt., 1955). Vieno deguonies atomo (O) įterpimą iš molekulinio deguonies (O2) į substratą inicijuoja endogeninės arba egzogeninės monooksigenazės (dar vadinamos hidroksilazėmis). Kitas deguonies atomas redukuojamas iki vandens. Egzogeninės monooksigenazės redukuoja flaviną NADH arba NADPH, o endomonooksigenazėse flaviną redukuoja substratas. Hidroksilinimo padėtis lemia produktų susidarymo įvairovę. Pavyzdžiui, salicilato 1-hidroksilazė hidroksilina salicilo rūgštį C1 padėtyje, sudarydama katecholį. Kita vertus, daugiakomponentė salicilato 5-hidroksilazė (turinti reduktazės, ferredoksino ir oksigenazės subvienetus) hidroksilina salicilo rūgštį C5 padėtyje ir sudaro gentisino rūgštį (Yamamoto ir kt., 1965).
Dioksigenazės į substratą įterpia du O2 atomus. Priklausomai nuo susidariusių produktų, jos skirstomos į žiedą hidroksilinančias dioksigenazes ir žiedą skaidančias dioksigenazes. Žiedą hidroksilinančios dioksigenazės aromatinius substratus paverčia cis-dihidrodioliais (pvz., naftalenu) ir yra plačiai paplitusios tarp bakterijų. Iki šiol įrodyta, kad organizmai, turintys žiedą hidroksilinančias dioksigenazes, gali augti ant įvairių aromatinių anglies šaltinių, o šie fermentai klasifikuojami kaip NDO (naftalenas), tolueno dioksigenazė (TDO, toluenas) ir bifenilo dioksigenazė (BPDO, bifenilas). Ir NDO, ir BPDO gali katalizuoti įvairių policiklinių aromatinių angliavandenilių (tolueno, nitrotolueno, ksileno, etilbenzeno, naftaleno, bifenilo, fluoreno, indolo, metilnaftaleno, naftalensulfonato, fenantreno, antraceno, acetofenono ir kt.) dvigubą oksidaciją ir šoninės grandinės hidroksilinimą (Boyd ir Sheldrake, 1998; Phale ir kt., 2020). NDO yra daugiakomponentė sistema, susidedanti iš oksidoreduktazės, ferredoksino ir aktyviąją vietą turinčio oksigenazės komponento (Gibson ir Subramanian, 1984; Resnick ir kt., 1996). NDO katalizinį vienetą sudaro didelis α subvienetas ir mažas β subvienetas, išdėstyti α3β3 konfigūracijoje. NDO priklauso didelei oksigenazių šeimai, o jo α subvienetas turi Rieske vietą [2Fe-2S] ir mononuklearinę neheminę geležį, kuri lemia NDO substrato specifiškumą (Parales ir kt., 1998). Paprastai vieno katalizinio ciklo metu du piridino nukleotido redukcijos elektronai pernešami į Fe(II) joną aktyviojoje vietoje per reduktazę, ferredoksiną ir Rieske vietą. Redukuojantys ekvivalentai aktyvuoja molekulinį deguonį, kuris yra būtina substrato dihidroksilinimo sąlyga (Ferraro ir kt., 2005). Iki šiol tik keli NDO buvo išgryninti ir išsamiai apibūdinti iš skirtingų padermių, o naftaleno skaidymo procesų genetinė kontrolė buvo išsamiai ištirta (Resnick ir kt., 1996; Parales ir kt., 1998; Karlsson ir kt., 2003). Žiedą skaidančios dioksigenazės (endo- arba orto-žiedą skaidantys fermentai ir eksodiolį- arba meta-žiedą skaidantys fermentai) veikia hidroksilintus aromatinius junginius. Pavyzdžiui, orto-žiedą skaidanti dioksigenazė yra katechol-1,2-dioksigenazė, o meta-žiedą skaidanti dioksigenazė yra katechol-2,3-dioksigenazė (Kojima ir kt., 1961; Nozaki ir kt., 1968). Be įvairių oksigenazių, taip pat yra įvairių dehidrogenazių, atsakingų už aromatinių dihidrodiolių, alkoholių ir aldehidų dehidrogeninimą ir naudojančių NAD+/NADP+ kaip elektronų akceptorius, kurie yra vieni iš svarbių metabolizme dalyvaujančių fermentų (Gibson ir Subramanian, 1984; Shaw ir Harayama, 1990; Fahle ir kt., 2020).
Tokie fermentai kaip hidrolazės (esterazės, amidazės) yra antra svarbi fermentų klasė, kuri naudoja vandenį kovalentiniams ryšiams skaidyti ir pasižymi plačiu substrato specifiškumu. Karbarilo hidrolazė ir kitos hidrolazės laikomos gramneigiamų bakterijų periplazmos (transmembraninės) komponentais (Kamini ir kt., 2018). Karbarilas turi ir amido, ir esterio jungtį; todėl jį gali hidrolizuoti esterazė arba amidazė ir sudaryti 1-naftolą. Pranešta, kad karbarilas Rhizobium rhizobium padermėje AC10023 ir Arthrobacter padermėje RC100 veikia atitinkamai kaip esterazė ir amidazė. Karbarilas Arthrobacter padermėje RC100 taip pat veikia kaip amidazė. Įrodyta, kad RC100 hidrolizuoja keturis N-metilkarbamato klasės insekticidus, tokius kaip karbarilas, metomilas, mefenamo rūgštis ir XMC (Hayaatsu ir kt., 2001). Pranešta, kad CH Pseudomonas sp. C5pp gali veikti karbarilą (100 % aktyvumas) ir 1-naftilacetatą (36 % aktyvumas), bet ne 1-naftilacetamidą, o tai rodo, kad tai yra esterazė (Trivedi ir kt., 2016).
Biocheminiai tyrimai, fermentų reguliavimo modeliai ir genetinė analizė parodė, kad naftaleno skaidymo genai susideda iš dviejų indukuojamų reguliavimo vienetų arba „operonų“: nah („aukštyn nukreiptas kelias“, naftaliną paverčiantis salicilo rūgštimi) ir sal („žemyn nukreiptas kelias“, salicilo rūgštį paverčiantis centriniu anglies keliu per katecholį). Salicilo rūgštis ir jos analogai gali veikti kaip induktoriai (Shamsuzzaman ir Barnsley, 1974). Esant gliukozei arba organinėms rūgštims, operonas yra represuojamas. 5 paveiksle parodyta visa naftaleno skaidymo genetinė organizacija (operono pavidalu). Aprašyti keli įvardyti nah geno variantai/formos (ndo/pah/dox), kurie turi didelę sekos homologiją (90 %) tarp visų Pseudomonas rūšių (Abbasian ir kt., 2016). Naftaleno aukštupio kelio genai paprastai buvo išdėstyti konsensuso tvarka, kaip parodyta 5A paveiksle. Taip pat pranešta, kad kitas genas, nahQ, dalyvauja naftaleno metabolizme ir paprastai yra tarp nahC ir nahE, tačiau tikroji jo funkcija dar nėra išaiškinta. Panašiai nahY genas, atsakingas už naftalinui jautrią chemotaksį, kai kuriuose nariuose buvo rastas nah operono distaliniame gale. Ralstonia sp. atveju U2 genas, koduojantis glutationo S-transferazę (gsh), buvo rastas tarp nahAa ir nahAb, tačiau neturėjo įtakos naftaleno panaudojimo charakteristikoms (Zylstra ir kt., 1997).
5 pav. Naftaleno skaidymo metu stebima genetinė organizacija ir įvairovė tarp bakterijų rūšių; (A) Viršutinis naftaleno kelias, naftaleno metabolizmas į salicilo rūgštį; (B) Apatinis naftaleno kelias, salicilo rūgštis per katecholį į centrinį anglies kelią; (C) salicilo rūgštis per gentisatą į centrinį anglies kelią.
„Apatinis kelias“ (sal operonas) paprastai susideda iš nahGTHINLMOKJ ir per katecholio metaringo skilimo kelią paverčia salicilatą piruvatu ir acetaldehidu. Nustatyta, kad nahG genas (koduojantis salicilato hidroksilazę) yra konservuotas proksimaliniame operono gale (5B pav.). Palyginti su kitomis naftaliną skaidančiomis padermėmis, P. putida CSV86 nah ir sal operonai yra tandeminiai ir labai glaudžiai susiję (apie 7,5 kb). Kai kuriose gramneigiamose bakterijose, tokiose kaip Ralstonia sp. U2, Polaromonas naphthalenivorans CJ2 ir P. putida AK5, naftalenas metabolizuojamas kaip centrinis anglies metabolitas per gentisato kelią (sgp/nag operono pavidalu). Geno kasetė paprastai pateikiama forma nagAaGHAbAcAdBFCQEDJI, kur nagR (koduojantis LysR tipo reguliatorių) yra viršutiniame gale (5C pav.).
Karbarilas patenka į centrinį anglies ciklą metabolizuodamas 1-naftolio, 1,2-dihidroksinaftaleno, salicilo rūgšties ir gentizo rūgšties (3 pav.). Remiantis genetiniais ir metaboliniais tyrimais, buvo pasiūlyta šį kelią suskirstyti į „aukštyn“ (karbarilo pavertimas salicilo rūgštimi), „vidurį“ (salicilo rūgšties pavertimas gentizo rūgštimi) ir „žemyn“ (gentiso rūgšties pavertimas centrinio anglies kelio tarpiniais produktais) (Singh ir kt., 2013). C5pp (superkontigas A, 76,3 kb) genominė analizė parodė, kad mcbACBDEF genas dalyvauja karbarilo pavertime salicilo rūgštimi, po to seka mcbIJKL genas salicilo rūgšties pavertime gentizo rūgštimi, o mcbOQP gentizo rūgšties pavertime centriniais anglies tarpiniais produktais (fumaratu ir piruvatu, Trivedi ir kt., 2016) (6 pav.).
Pranešta, kad fermentus, dalyvaujančius aromatinių angliavandenilių (įskaitant naftaliną ir salicilo rūgštį) skaidyme, gali indukuoti atitinkami junginiai ir slopinti paprasti anglies šaltiniai, tokie kaip gliukozė arba organinės rūgštys (Shingler, 2003; Phale ir kt., 2019, 2020). Tarp įvairių naftaleno ir jo darinių metabolizmo kelių, tam tikru mastu buvo tirtos naftaleno ir karbarilo reguliavimo ypatybės. Naftaleno atveju, tiek priešsrovinio, tiek pasrovinio kelių genus reguliuoja NahR – LysR tipo transaktyvus teigiamas reguliatorius. Jis būtinas nah geno indukcijai salicilo rūgštimi ir jo vėlesnei aukšto lygio ekspresijai (Yen ir Gunsalus, 1982). Be to, tyrimai parodė, kad integracinis šeimininko faktorius (IHF) ir XylR (nuo sigma 54 priklausomas transkripcijos reguliatorius) taip pat yra labai svarbūs genų transkripcijos aktyvacijai naftaleno metabolizme (Ramos ir kt., 1997). Tyrimai parodė, kad katecholio meta-žiedo atidarymo kelio fermentai, būtent katecholio 2,3-dioksigenazė, yra indukuojami esant naftalenui ir (arba) salicilo rūgščiai (Basu ir kt., 2006). Tyrimai parodė, kad katecholio orto-žiedo atidarymo kelio fermentai, būtent katecholio 1,2-dioksigenazė, yra indukuojami esant benzenkarboksirūgštiai ir cis,cis-mukonatui (Parsek ir kt., 1994; Tover ir kt., 2001).
C5pp padermėje penki genai – mcbG, mcbH, mcbN, mcbR ir mcbS – koduoja reguliatorius, priklausančius LysR/TetR transkripcijos reguliatorių šeimai, atsakingai už karbarilo skaidymo kontrolę. Nustatyta, kad homologiškas genas mcbG yra labiausiai susijęs su LysR tipo reguliatoriumi PhnS (58 % aminorūgščių identiškumas), dalyvaujančiu fenantreno metabolizme Burkholderia RP00725 (Trivedi ir kt., 2016). Nustatyta, kad mcbH genas dalyvauja tarpiniame kelyje (salicilo rūgšties pavertimas gentizo rūgštimi) ir priklauso LysR tipo transkripcijos reguliatoriui NagR/DntR/NahR Pseudomonas ir Burkholderia bakterijose. Pranešta, kad šios šeimos nariai atpažįsta salicilo rūgštį kaip specifinę efektorinę molekulę skaidymo genų indukcijai. Kita vertus, pasroviui esančiame kelyje (gentisato-centrinio anglies kelio metabolitai) buvo identifikuoti trys genai – mcbN, mcbR ir mcbS, priklausantys LysR ir TetR tipo transkripcijos reguliatoriams.
Prokariotuose horizontalūs genų perdavimo procesai (gavimas, mainai arba perdavimas) per plazmides, transpozonus, profagus, genomo salas ir integracinius konjugacinius elementus (ICE) yra pagrindinės bakterijų genomų plastiškumo priežastys, lemiančios specifinių funkcijų / požymių įgijimą arba praradimą. Tai leidžia bakterijoms greitai prisitaikyti prie skirtingų aplinkos sąlygų, suteikiant šeimininkui potencialių adaptacinių metabolinių pranašumų, tokių kaip aromatinių junginių skaidymas. Metaboliniai pokyčiai dažnai pasiekiami tiksliai derinant skaidymo operonus, jų reguliavimo mechanizmus ir fermentų specifiškumą, o tai palengvina platesnio aromatinių junginių spektro skaidymą (Nojiri ir kt., 2004; Phale ir kt., 2019, 2020). Nustatyta, kad naftaleno skaidymo genų kasetės yra įvairiuose mobiliuose elementuose, tokiuose kaip plazmidės (konjugacinės ir nekonjugacinės), transpozonai, genomai, ICE ir skirtingų bakterijų rūšių deriniai (5 pav.). Pseudomonas G7 padermėje plazmidės NAH7 nah ir sal operonai transkribuojami ta pačia orientacija ir yra defektyvaus transpozono, kuriam mobilizacijai reikalinga transpozazė Tn4653, dalis (Sota ir kt., 2006). Pseudomonas padermėje NCIB9816-4 genas buvo rastas konjugacinėje plazmidėje pDTG1 kaip du operonai (maždaug 15 kb atstumu vienas nuo kito), kurie buvo transkribuoti priešingomis kryptimis (Dennis ir Zylstra, 2004). Pseudomonas putida padermėje AK5 nekonjugacinė plazmidė pAK5 koduoja fermentą, atsakingą už naftaleno skaidymą per gentisato kelią (Izmalkova ir kt., 2013). Pseudomonas PMD-1 padermėje nah operonas yra chromosomoje, o sal operonas – konjugacinėje plazmidėje pMWD-1 (Zuniga ir kt., 1981). Tačiau Pseudomonas stutzeri AN10 visi naftaleno skaidymo genai (nah ir sal operonai) yra chromosomoje ir, tikėtina, yra pritraukiami transpozicijos, rekombinacijos ir pertvarkymo būdu (Bosch ir kt., 2000). Pseudomonas sp. CSV86 padermėje nah ir sal operonai genome yra ICE (ICECSV86) pavidalu. Struktūrą apsaugo tRNAGly, po kurios seka tiesioginiai pasikartojimai, nurodantys rekombinacijos / prisijungimo vietas (attR ir attL), ir fago tipo integrazė, esanti abiejuose tRNAGly galuose, todėl struktūriškai panaši į ICEclc elementą (ICEclcB13 Pseudomonas knackmusii chlorokatecholiui skaidyti). Pranešta, kad ICE esantys genai gali būti perkelti konjugacijos būdu, esant itin mažam perdavimo dažniui (10-8), taip perduodant degradacijos savybes recipientui (Basu ir Phale, 2008; Phale ir kt., 2019).
Dauguma genų, atsakingų už karbarilo skaidymą, yra plazmidėse. Arthrobacter sp. RC100 turi tris plazmides (pRC1, pRC2 ir pRC300), iš kurių dvi konjugacinės plazmidės, pRC1 ir pRC2, koduoja fermentus, kurie karbarilą paverčia gentisatu. Kita vertus, fermentai, dalyvaujantys gentisato pavertime centriniais anglies metabolitais, yra chromosomoje (Hayaatsu ir kt., 1999). Rhizobium genties bakterijos. AC100 padermė, naudojama karbarilui paversti 1-naftoliu, turi plazmidę pAC200, kurioje yra cehA genas, koduojantis CH, kaip Tnceh transpozono dalis, apsupta įterpimo elemento tipo sekų (istA ir istB) (Hashimoto ir kt., 2002). Manoma, kad Sphingomonas CF06 padermėje karbarilo skaidymo genas yra penkiose plazmidėse: pCF01, pCF02, pCF03, pCF04 ir pCF05. Šių plazmidžių DNR homologija yra didelė, o tai rodo genų dubliavimosi įvykio egzistavimą (Feng ir kt., 1997). Karbarilą skaidančiame simbione, sudarytame iš dviejų Pseudomonas rūšių, 50581 padermė turi konjugacinę plazmidę pCD1 (50 kb), koduojančią mcd karbarilo hidrolazės geną, o 50552 padermės konjugacinė plazmidė koduoja 1-naftolį skaidantį fermentą (Chapalamadugu ir Chaudhry, 1991). Achromobacter WM111 padermėje mcd furadano hidrolazės genas yra 100 kb plazmidėje (pPDL11). Nustatyta, kad šis genas yra skirtingose ​​plazmidėse (100, 105, 115 arba 124 kb) skirtingose ​​bakterijose iš skirtingų geografinių regionų (Parekh ir kt., 1995). Pseudomonas sp. C5pp atveju visi už karbarilo skaidymą atsakingi genai yra išsidėstę 76,3 kb sekos genome (Trivedi ir kt., 2016). Genomo analizė (6,15 Mb) atskleidė 42 MGE ir 36 GEI buvimą, iš kurių 17 MGE buvo superkontige A (76,3 kb), o vidutinis asimetrinis G+C kiekis (54–60 mol. %) rodo galimus horizontalius genų perdavimo įvykius (Trivedi ir kt., 2016). P. putida XWY-1 pasižymi panašiu karbarilo skaidymo genų išsidėstymu, tačiau šie genai yra plazmidėje (Zhu ir kt., 2019).
Be metabolinio efektyvumo biocheminiu ir genominiu lygmenimis, mikroorganizmai taip pat pasižymi kitomis savybėmis ar atsakais, tokiais kaip chemotaksė, ląstelių paviršiaus modifikavimo savybės, susiskirstymas į kompartmentus, preferencinis panaudojimas, biosurfaktantų gamyba ir kt., kurios padeda jiems efektyviau metabolizuoti aromatinius teršalus užterštoje aplinkoje (7 pav.).
7 pav. Skirtingos idealių aromatinius angliavandenilius skaidančių bakterijų ląstelinio atsako strategijos, skirtos efektyviam pašalinių teršalų junginių biologiniam skaidymui.
Chemotaksės atsakai laikomi veiksniais, skatinančiais organinių teršalų skaidymąsi nevienalytiškai užterštose ekosistemose. (2002) parodė, kad Pseudomonas sp. G7 chemotaksė naftalinui padidino naftaleno skaidymo greitį vandens sistemose. Laukinio tipo G7 padermė naftaliną skaidė daug greičiau nei chemotaksės stokojanti mutantinė padermė. Nustatyta, kad NahY baltymas (538 aminorūgštys su membranine topologija) yra kotranskribuojamas su metaskilimo kelio genais NAH7 plazmidėje, ir, kaip ir chemotaksės keitikliai, šis baltymas, atrodo, veikia kaip naftaleno skaidymo chemoreceptorius (Grimm ir Harwood 1997). Kitas Hansel ir kt. (2009) tyrimas parodė, kad baltymas yra chemotaktinis, tačiau jo skaidymo greitis yra didelis. (2011) parodė Pseudomonas (P. putida) chemotaksę atsaką į dujinį naftaliną, kai dujų fazės difuzija lėmė nuolatinį naftaleno srautą į ląsteles, kuris kontroliavo ląstelių chemotaksinę reakciją. Tyrėjai pasinaudojo šiuo chemotaksiniu elgesiu, norėdami sukurti mikrobus, kurie padidintų degradacijos greitį. Tyrimai parodė, kad chemosensoriniai keliai taip pat reguliuoja kitas ląstelių funkcijas, tokias kaip ląstelių dalijimasis, ląstelių ciklo reguliavimas ir bioplėvelės formavimasis, taip padėdami kontroliuoti degradacijos greitį. Tačiau šios savybės (chemotaksės) panaudojimas efektyviam degradavimui trukdo dėl kelių kliūčių. Pagrindinės kliūtys yra šios: (a) skirtingi paraloginiai receptoriai atpažįsta tuos pačius junginius / ligandus; (b) alternatyvių receptorių egzistavimas, t. y. energetinis tropizmas; (c) reikšmingi sekos skirtumai tos pačios receptorių šeimos sensorinėse srityse; ir (d) informacijos apie pagrindinius bakterijų sensorinius baltymus trūkumas (Ortega ir kt., 2017; Martin-Mora ir kt., 2018). Kartais aromatinių angliavandenilių biologinis skaidymas gamina daug metabolitų / tarpinių produktų, kurie gali būti chemotaktiniai vienai bakterijų grupei, bet atstumiantys kitas, o tai dar labiau apsunkina procesą. Norėdami nustatyti ligandų (aromatinių angliavandenilių) sąveiką su cheminiais receptoriais, sukūrėme hibridinius jutiklinius baltymus (PcaY, McfR ir NahY), suliedami Pseudomonas putida ir Escherichia coli jutiklinius ir signalizacijos domenus, kurie atitinkamai nukreipti į aromatinių rūgščių, TCA tarpinių produktų ir naftaleno receptorius (Luu ir kt., 2019).
Veikiant naftalinui ir kitiems policikliniams aromatiniams angliavandeniliams (PAH), bakterijų membranos struktūra ir mikroorganizmų vientisumas smarkiai pasikeičia. Tyrimai parodė, kad naftalenas per hidrofobines sąveikas trukdo acilo grandinės sąveikai, taip padidindamas membranos brinkimą ir takumą (Sikkema ir kt., 1995). Siekdamos neutralizuoti šį žalingą poveikį, bakterijos reguliuoja membranos takumą keisdamos izo/anteizo šakotos grandinės riebalų rūgščių santykį ir riebalų rūgščių sudėtį bei izomerizuodamos cis-nesočiąsias riebalų rūgštis į atitinkamus trans-izomerus (Heipieper ir de Bont, 1994). Pseudomonas stutzeri, auginamuose naftalinu apdorotose bakterijose, sočiųjų ir nesočiųjų riebalų rūgščių santykis padidėjo nuo 1,1 iki 2,1, o Pseudomonas JS150 šis santykis padidėjo nuo 7,5 iki 12,0 (Mrozik ir kt., 2004). Auginant naftaleno terpėje, Achromobacter KAs 3–5 ląstelės pasižymėjo ląstelių agregacija aplink naftaleno kristalus ir sumažėjo ląstelės paviršiaus krūvis (nuo -22,5 iki -2,5 mV), kartu su citoplazmos kondensacija ir vakuolizacija, rodančia ląstelės struktūros ir paviršiaus savybių pokyčius (Mohapatra ir kt., 2019). Nors ląstelių/paviršiaus pokyčiai yra tiesiogiai susiję su geresniu aromatinių teršalų įsisavinimu, atitinkamos bioinžinerijos strategijos nebuvo iki galo optimizuotos. Ląstelės formos manipuliavimas retai buvo naudojamas biologiniams procesams optimizuoti (Volke ir Nikel, 2018). Ląstelių dalijimąsi veikiančių genų ištrynimas sukelia ląstelių morfologijos pokyčius. Bacillus subtilis atveju įrodyta, kad ląstelės pertvaros baltymas SepF dalyvauja pertvaros formavime ir yra būtinas vėlesniems ląstelių dalijimosi etapams, tačiau tai nėra esminis genas. Peptidinių glikanų hidrolazes koduojančių genų ištrynimas iš Bacillus subtilis lėmė ląstelių pailgėjimą, padidėjusį specifinį augimo greitį ir pagerintą fermentų gamybos pajėgumą (Cui ir kt., 2018).
Siekiant efektyvaus Pseudomonas padermių C5pp ir C7 skaidymo, buvo pasiūlytas karbarilo skaidymo kelio susiskaldymas (Kamini ir kt., 2018). Siūloma, kad karbarilas į periplazminę erdvę pernešamas per išorinės membranos pertvarą ir (arba) per difuzines porinas. CH yra periplazminis fermentas, kuris katalizuoja karbarilo hidrolizę į 1-naftolį, kuris yra stabilesnis, hidrofobiškesnis ir toksiškesnis. CH yra lokalizuotas periplazmoje ir turi mažą afinitetą karbarilui, tokiu būdu kontroliuodamas 1-naftolio susidarymą, taip užkirsdamas kelią jo kaupimuisi ląstelėse ir sumažindamas jo toksiškumą ląstelėms (Kamini ir kt., 2018). Gautas 1-naftolis pernešamas į citoplazmą per vidinę membraną pasiskirstymo ir (arba) difuzijos būdu, o tada didelio afiniteto fermento 1NH hidroksilinamas į 1,2-dihidroksinaftaleną tolesniam metabolizmui centriniame anglies kelyje.
Nors mikroorganizmai turi genetinių ir metabolinių gebėjimų skaidyti ksenobiotinius anglies šaltinius, jų panaudojimo hierarchinė struktūra (t. y. pirmenybė teikiama paprastiems, o ne sudėtingiems anglies šaltiniams) yra pagrindinė biologinio skaidymo kliūtis. Paprastų anglies šaltinių buvimas ir panaudojimas slopina genus, koduojančius fermentus, kurie skaido sudėtingus/nepageidaujamus anglies šaltinius, tokius kaip PAH. Gerai ištirtas pavyzdys yra tas, kad kai Escherichia coli kartu tiekiama gliukozė ir laktozė, gliukozė panaudojama efektyviau nei laktozė (Jacob ir Monod, 1965). Pranešama, kad Pseudomonas skaido įvairius PAH ir ksenobiotinius junginius kaip anglies šaltinius. Pseudomonas anglies šaltinių panaudojimo hierarchija yra organinės rūgštys > gliukozė > aromatiniai junginiai (Hylemon ir Phibbs, 1972; Collier ir kt., 1996). Tačiau yra išimtis. Įdomu tai, kad Pseudomonas sp. CSV86 pasižymi unikalia hierarchine struktūra, kuri pirmenybę teikia aromatiniams angliavandeniliams (benzenkarboksirūgštiai, naftalinui ir kt.), o ne gliukozei, ir kartu metabolizuoja aromatinius angliavandenilius su organinėmis rūgštimis (Basu ir kt., 2006). Šioje bakterijoje aromatinių angliavandenilių skaidymo ir transportavimo genai nėra sumažinami net ir esant antram anglies šaltiniui, pvz., gliukozei ar organinėms rūgštims. Auginant gliukozės ir aromatinių angliavandenilių terpėje, pastebėta, kad gliukozės transportavimo ir metabolizmo genai buvo sumažinti, aromatiniai angliavandeniliai buvo naudojami pirmoje log fazėje, o gliukozė – antroje log fazėje (Basu ir kt., 2006; Choudhary ir kt., 2017). Kita vertus, organinių rūgščių buvimas neturėjo įtakos aromatinių angliavandenilių metabolizmo raiškai, todėl tikimasi, kad ši bakterija yra kandidatė į biodegradacijos tyrimus (Phale ir kt., 2020).
Gerai žinoma, kad angliavandenilių biotransformacija gali sukelti oksidacinį stresą ir antioksidacinių fermentų padidėjimą mikroorganizmuose. Neefektyvus naftaleno biologinis skaidymas tiek stacionarios fazės ląstelėse, tiek esant toksiškiems junginiams, sukelia reaktyviųjų deguonies formų (ROS) susidarymą (Kang ir kt., 2006). Kadangi naftaleną skaidantys fermentai turi geležies ir sieros sankaupas, oksidacinio streso metu hemo ir geležies bei sieros baltymuose esanti geležis bus oksiduota, todėl baltymai bus inaktyvuoti. Ferredoksino-NADP+ reduktazė (Fpr) kartu su superoksido dismutaze (SOD) tarpininkauja grįžtamojoje redokso reakcijoje tarp NADP+/NADPH ir dviejų ferredoksino arba flavodoksino molekulių, tokiu būdu surišdama ROS ir atkurdama geležies ir sieros centrą oksidacinio streso metu (Li ir kt., 2006). Pranešta, kad oksidacinis stresas gali sukelti ir Fpr, ir SodA (SOD) Pseudomonas bakterijose, o keturiose Pseudomonas padermėse (O1, W1, As1 ir G1) augimo naftaleno pridėjus sąlygomis metu pastebėtas padidėjęs SOD ir katalazės aktyvumas (Kang ir kt., 2006). Tyrimai parodė, kad antioksidantų, tokių kaip askorbo rūgštis arba geležies(II)(II)(II)(II)(II)-1, pridėjimas gali padidinti naftaleno augimo greitį. Kai Rhodococcus erythropolis augo naftaleno terpėje, padidėjo su oksidaciniu stresu susijusių citochromo P450 genų, įskaitant sodA (Fe/Mn superoksido dismutazė), sodC (Cu/Zn superoksido dismutazė) ir recA, transkripcija (Sazykin ir kt., 2019). Lyginamoji kiekybinė Pseudomonas ląstelių, kultivuojamų naftaleno terpėje, proteominė analizė parodė, kad įvairių su oksidaciniu streso atsaku susijusių baltymų reguliavimas yra streso įveikos strategija (Herbst ir kt., 2013).
Pranešama, kad mikroorganizmai, veikdami hidrofobinius anglies šaltinius, gamina biopaviršinio aktyvumo medžiagas. Šios paviršinio aktyvumo medžiagos yra amfifiliniai paviršinio aktyvumo junginiai, kurie gali sudaryti agregatus naftos ir vandens arba oro ir vandens sąlyčio vietose. Tai skatina pseudotirpinimą ir palengvina aromatinių angliavandenilių adsorbciją, todėl vyksta efektyvus biologinis skaidymas (Rahman ir kt., 2002). Dėl šių savybių biopaviršinio aktyvumo medžiagos yra plačiai naudojamos įvairiose pramonės šakose. Cheminių paviršinio aktyvumo medžiagų arba biopaviršinio aktyvumo medžiagų pridėjimas prie bakterijų kultūrų gali padidinti angliavandenilių skaidymo efektyvumą ir greitį. Tarp biopaviršinio aktyvumo medžiagų, Pseudomonas aeruginosa gaminami ramnolipidai buvo plačiai tirti ir apibūdinti (Hisatsuka ir kt., 1971; Rahman ir kt., 2002). Be to, kitų tipų biosurfaktantai yra lipopeptidai (mucinai iš Pseudomonas fluorescens), emulsiklis 378 (iš Pseudomonas fluorescens) (Rosenberg ir Ron, 1999), trehalozės disacharidų lipidai iš Rhodococcus (Ramdahl, 1985), licheninas iš Bacillus (Saraswathy ir Hallberg, 2002) ir paviršinio aktyvumo medžiaga iš Bacillus subtilis (Siegmund ir Wagner, 1991) ir Bacillus amyloliquefaciens (Zhi ir kt., 2017). Įrodyta, kad šios stiprios paviršinio aktyvumo medžiagos sumažina paviršiaus įtempimą nuo 72 dinų/cm iki mažiau nei 30 dinų/cm, todėl angliavandeniliai geriau absorbuojami. Pranešta, kad Pseudomonas, Bacillus, Rhodococcus, Burkholderia ir kitos bakterijų rūšys, auginant naftaleno ir metilnaftaleno terpėse, gali gaminti įvairias ramnolipidų ir glikolipidų pagrindu pagamintas biosurfaktantus (Kanga ir kt., 1997; Puntus ir kt., 2005). Pseudomonas maltophilia CSV89, auginant aromatiniuose junginiuose, tokiuose kaip naftoinė rūgštis, gali gaminti ekstraląstelinius biosurfaktantus Biosur-Pm (Phale ir kt., 1995). Biosur-Pm susidarymo kinetika parodė, kad jo sintezė yra nuo augimo ir pH priklausomas procesas. Nustatyta, kad ląstelių, esant neutraliam pH, pagaminto Biosur-Pm kiekis buvo didesnis nei esant 8,5 pH. Ląstelės, augintos esant 8,5 pH, buvo hidrofobiškesnės ir turėjo didesnį afinitetą aromatiniams ir alifatiniams junginiams nei ląstelės, augintos esant 7,0 pH. Rhodococcus spp. N6, didesnis anglies ir azoto (C:N) santykis ir geležies ribojimas yra optimalios sąlygos ekstraląstelinių biosurfaktantų gamybai (Mutalik ir kt., 2008). Buvo bandoma pagerinti biosurfaktantų (surfaktanų) biosintezę optimizuojant padermes ir fermentaciją. Tačiau paviršinio aktyvumo medžiagos titras kultūros terpėje yra mažas (1,0 g/l), o tai kelia iššūkį didelio masto gamybai (Jiao ir kt., 2017; Wu ir kt., 2019). Todėl siekiant pagerinti jos biosintezę buvo naudojami genetinės inžinerijos metodai. Tačiau jos inžinerinė modifikacija yra sudėtinga dėl didelio operono dydžio (∼25 kb) ir sudėtingo kvorumo jutimo sistemos biosintezės reguliavimo (Jiao ir kt., 2017; Wu ir kt., 2019). Bacillus bakterijose atlikta daug genetinės inžinerijos modifikacijų, daugiausia skirtų padidinti surfaktino gamybą pakeičiant promotorių (srfA operoną), pernelyg ekspresuojant surfaktino eksporto baltymą YerP ir reguliacinius faktorius ComX bei PhrC (Jiao ir kt., 2017). Tačiau šie genetinės inžinerijos metodai pasiekė tik vieną ar kelias genetines modifikacijas ir dar nepasiekė komercinės gamybos. Todėl būtina toliau tirti žiniomis pagrįstus optimizavimo metodus.
PAH biologinio skaidymo tyrimai daugiausia atliekami standartinėmis laboratorinėmis sąlygomis. Tačiau užterštose vietose arba užterštoje aplinkoje daugelis abiotinių ir biotinių veiksnių (temperatūra, pH, deguonis, maistinių medžiagų prieinamumas, substrato biologinis prieinamumas, kiti ksenobiotikai, galutinių produktų slopinimas ir kt.) keičia ir daro įtaką mikroorganizmų skaidymo pajėgumui.
Temperatūra daro didelę įtaką PAH biologiniam skaidymui. Didėjant temperatūrai, mažėja ištirpusio deguonies koncentracija, o tai veikia aerobinių mikroorganizmų metabolizmą, nes jiems molekulinis deguonis yra vienas iš substratų oksigenazėms, kurios vykdo hidroksilinimo arba žiedo skaidymo reakcijas. Dažnai pastebima, kad padidėjusi temperatūra paverčia pirminius PAH toksiškesniais junginiais, taip slopindama biologinį skaidymą (Muller ir kt., 1998).
Pastebėta, kad daugelyje PAH užterštų vietų yra itin didelės pH vertės, pavyzdžiui, rūgštiniu kasyklų drenažu užterštose vietose (pH 1–4) ir gamtinių dujų / anglies dujofikacijos vietose, užterštose šarminiu filtratu (pH 8–12). Šios sąlygos gali rimtai paveikti biodegradacijos procesą. Todėl prieš naudojant mikroorganizmus bioremediacijai, rekomenduojama sureguliuoti pH, pridedant tinkamų cheminių medžiagų (turinčių vidutinį arba labai mažą oksidacijos-redukcijos potencialą), tokių kaip amonio sulfatas arba amonio nitratas šarminiams dirvožemiams arba kalkinimas kalcio karbonatu arba magnio karbonatu rūgščioms vietoms (Bowlen ir kt., 1995; Gupta ir Sar, 2020).
Deguonies tiekimas į paveiktą zoną yra ribojantis PAH biologinio skaidymosi greitis. Dėl aplinkos redokso sąlygų, in situ bioremediacijos procesams paprastai reikalingas deguonies tiekimas iš išorinių šaltinių (žemės dirbimo, oro pralaidumo ir cheminių medžiagų pridėjimo) (Pardieck ir kt., 1992). Odenkranz ir kt. (1996) parodė, kad magnio peroksido (deguonį išskiriančio junginio) pridėjimas į užterštą vandeningąjį sluoksnį gali veiksmingai bioremediatuoti BTEX junginius. Kitame tyrime buvo tiriamas fenolio ir BTEX skaidymas in situ užterštame vandeningajame sluoksnyje, įpurškiant natrio nitratą ir įrengiant ekstrahavimo gręžinius, siekiant efektyvaus bioremediacijos (Bewley ir Webb, 2001).