Dabartinis†Dabartinis adresas: OX11 0DE, JK, Diamond Building, Harwell mokslo ir inovacijų parkas, Dietcote, Oksfordšyras, JK, Diamond Light Source Co., Ltd., Elektroninio biologinio vaizdavimo centras.
Šviesą sugeriantis reakcijos centro kompleksas Nr. 1 (RC-LH1) yra pagrindinis purpurinių fototrofinių bakterijų fotosintezės komponentas. Pateikėme dvi krioelektroninės mikroskopijos struktūras, gautas iš Rhodopseudomonas palustris RC-LH1 komplekso. 2,65 Å skiriamosios gebos RC-LH114-W komplekso struktūrą sudaro 14 LH1 subvienetų kilpų, supančių RC, kurią pertraukia baltymas W, o kompleksas be baltymo-W yra visiškai RC kompozicijos, apsuptas RC. Uždara 16 LH1 subvienetų kilpa. Šių struktūrų palyginimas suteikia įžvalgų apie chinono dinamiką RC-LH1 komplekse, įskaitant anksčiau nenustatytus konformacinius pokyčius, kai chinonas prisijungia prie RC QB vietos, taip pat apie pagalbinių chinono prisijungimo vietų, kurios padeda jas perduoti RC, vietą. Unikali W baltymo struktūra neleidžia LH1 kilpai užsidaryti, taip sukurdama kanalą, kuris pagreitina chinono/chinolono mainus.
Fotosintezės metu gaunama energija gali palaikyti beveik visą gyvybę Žemėje, be to, ji turi didelį potencialą saulės biotechnologijoms. Skatindamos pasaulinę fotosintezę, purpurinės fototrofinės bakterijos taip pat pasižymi įvairiais energijos režimais ir medžiagų apykaitos galimybėmis. Jos gali išvengti fotosintezės ir augti kaip heterotrofinės bakterijos tamsoje, gali fiksuoti azotą ir anglies dioksidą, gaminti vandenilį ir skaidyti aromatinius junginius (1–3). Kad šie procesai vyktų tinkamai, šviesa turi būti greitai ir efektyviai paversta chemine energija. Šis procesas prasideda, kai šviesą gaudantis antenos kompleksas sugeria šviesą ir perduoda sulaikytą energiją į reakcijos centrą (RC), taip pradėdamas krūvio atskyrimą (4–7). Pagrindinis purpurinių fototrofinių bakterijų fotosintezės vienetas yra sudarytas iš 2 tipo RC, apsupto šviesą surenkančio 1 komplekso (LH1), sudarančio RC-LH1 šerdies kompleksą. LH1 sudaro išlenktų αβ heterodimerų masyvas, kurių kiekvienas jungiasi su dviem bakterijų chlorofilo (BChl) α molekulėmis ir vienu ar dviem karotenoidais (8–12). Paprasčiausią LH1 anteną sudaro 16 arba 17 αβ heterodimerų, uždaroje kilpoje supančių RC (9-13), tačiau kituose branduolio kompleksuose transmembraniniai peptidai nutraukia aplinkinio LH1 tęstinumą, taip skatindami chinolio/chinono difuziją tarp RC ir citochromo bc1 komplekso (11, 13-15). Violetinis fototrofinis augalas Rhodopseudomonas (Rps.) yra modelinis organizmas, galintis suprasti energijos ir elektronų perdavimą, palaikantį fotosintezę. Pirmoji Rps kristalinė struktūra. Palustrio RC-LH1 komplekso modelis yra RC, apsuptas 15 heterodimerinių LH1 kilpų, kurias pertraukia nežinomas baltymas, vadinamas „baltymu W“ (14). Vėliau baltymas-W buvo identifikuotas kaip RPA4402 – necharakterizuotas 10,5 kDa baltymas su trimis numatytomis transmembraninėmis spiralėmis (TMH) (16). Siūlome pervadinti rpa4402 geną, koduojantį baltymą W, į pufW, kad tai atitiktų nomenklatūrą, naudojamą genams, koduojantiems RC-L, M (pufL, pufM) ir LH1α, β (pufA, pufB) subvienetus. Įdomu tai, kad baltymas W yra tik apie 10 % RC-LH1, o tai rodo, kad Rps. palustris gamina du skirtingus RC-LH1 kompleksus. Čia pateikiame dviejų pagrindinių kompleksų didelės skiriamosios gebos krio-EM (krio-EM) struktūras: vieną su baltymu W ir 14 αβ heterodimerų, kitą be baltymo W ir uždara 16 heterodimerų LH1 kilpa. Mūsų struktūra rodo žingsnį į priekį suprantant Rps. palustris RC-LH1 kompleksą, nes išanalizavome kiekvieno varianto homogeninę populiaciją ir turime pakankamą skiriamąją gebą, kad galėtume aiškiai priskirti kiekvieną peptidą ir surištus pigmentus bei susijusius lipidus ir chinonus. Šių struktūrų palyginimas rodo, kad trys TMH baltymai-W, kurie iki šiol nebuvo rasti jokiame kitame RC-LH1 komplekse, generuoja chinono kanalą, kuris paspartina chinono/chinolono mainus. Nustatyta daug konservatyvių lipidų ir chinono prisijungimo vietų, ir mes atskleidėme naują konformacinį pokytį po chinono ir RC sujungimo, kuris gali būti tinkamas deguonimi prisotintų fototrofinių organizmų fotosistemos II (PSII) RC. Mūsų išvados suteikia naujų įžvalgų apie chinono/chinolono prisijungimo ir mainų kinetiką purpurinių fototrofinių bakterijų RC-LH1 branduolio komplekse.
Siekdami palengvinti išsamų dviejų Rps. palustris randamų kompleksų tyrimą, kiekvieną RC-LH1 išskyrėme biocheminiais metodais. Kompleksas be baltymo W (toliau – ΔpufW) buvo išgrynintas iš padermės, kurioje trūksta pufW geno (16), ir gali būti pagamintas tik vienas RC-LH1 kompleksas. Kompleksą, kuriame yra baltymas W, gamina padermė. Šios padermės baltymas W yra modifikuotas 10x His žymekliu savo C gale, kad baltymą W turintis kompleksas galėtų būti efektyviai sujungtas su labiausiai trūkstančiu baltymu W, imobilizuojant metalą. Kompleksas efektyviai atskiriamas (16) afininės chromatografijos (IMAC) būdu.
Kaip parodyta 1 paveiksle, abu kompleksai turi tris RC subvienetus (RC-L, RC-M ir RC-H), apsuptus LH1 antenos. Komplekso, kuriame nėra baltymo-W, 2,80-A struktūroje yra 16 αβ heterodimerų, sudarančių uždarą LH1 kilpą, visiškai supančią RC, toliau vadinamą RC-LH116 kompleksu. Komplekso, kuriame yra baltymas-W, 2,65 Å struktūroje yra 14 heterodimerų LH1, pertrauktas baltymu-W, toliau vadinamas RC-LH114-W.
(A ir B) Junginio paviršiaus atvaizdavimas. (C ir D) Surišti pigmentai, išreikšti lazdelėmis. (E ir F) Iš citoplazminio paviršiaus stebimuose kompleksuose peptidai ir LH1 subvienetai pavaizduoti brėžiniais ir sunumeruoti pagal laikrodžio rodyklę nuo baltymo-W tarpo [atitinka Rba numeravimą. sphaeroides kompleksas (13)]. LH1-α baltymo subvieneto spalva yra geltona; LH1-β baltymo subvieneto spalva yra mėlyna; baltymo-W baltymas yra raudonas; RC-H – žydras; RC-L – oranžinis; RC-M – rausvai raudonas. Kofaktoriai pavaizduoti lazdelėmis, žalia spalva žymi BChl ir BPh a molekules, violetinė – karotenoidus, o geltona – UQ10 molekules. (G ir H) Padidintas baltymo-W tarpo vaizdas ekvivalentiškoje RC-LH114-W komplekso (G) ir RC-LH116 komplekso (H) srityje. Kofaktoriai pavaizduoti užpildant erdvę, chelatuotas chinonas pavaizduotas mėlyna spalva. (G) paveikslėlyje baltymo ir W tarpas paryškintas mėlyna punktyrine linija, o (H) paveikslėlyje mažos skylutės, pro kurias chinonas/chinololis difunduoja LH116 žiede, paryškintos juoda punktyrine linija.
1 paveiksle (A ir B) pavaizduotas RC, apsuptas atvirų arba uždarų LH1αβ heterodimerų masyvų, kurių kiekvienas jungiasi su dviem BChl ir vienu karotinoidu (1, C ir D paveikslai). Ankstesni tyrimai parodė, kad Rps yra LH1 kompleksas. Spirulinos ksantino biosintezės kelyje šios rūšys turi mišrias karotinoidų populiacijas (17). Tačiau spiropiroksantinas yra dominuojantis karotinoidas ir jo tankis yra patenkinamas. Todėl pasirinkome modeliuoti spirokantiną visose LH1 prisijungimo vietose. Alfa ir beta polipeptidai yra pavieniai TMH su trumpais išoriniais membranos regionais (1 paveikslai, A, B, E ir F). Nors 17 liekanų tankis C gale nebuvo pastebėtas, abiejuose kompleksuose alfa polipeptidas buvo suskaldytas nuo Met1 iki Ala46. β polipeptidas buvo redukuotas nuo Gly4 iki Tyr52 RC-LH116 komplekse ir nuo Ser5 iki Tyr52 RC-LH114-W komplekse. Nebuvo pastebėtas 3 ar 4 N-galo arba 13 C-galo liekanų tankis (S1 pav.). Iš laukinio tipo padermės paruošto mišraus RC-LH1 komplekso masių spektrometrijos analizė parodė, kad trūkstama sritis atsirado dėl šių peptidų heterologinio skilimo (S1 ir S2 pav.). Taip pat buvo pastebėta α-Met1 N-galo formilinimas (f). Analizė parodė, kad α-peptidą sudaro liekanos nuo fMet1 iki Asp42/Ala46/Ala47/Ala50, o β-peptidą sudaro liekanos nuo Ser2 iki Ala53, kas gerai atitinka žemos temperatūros EM tankio žemėlapį.
α-His29 ir β-His36 koordinacija sukuria BChls akis į akį; kiekvienas αβ heterodimeras jungiasi su savo kaimynais ir sudaro atvirą kilpą (RC-LH114-W) arba uždarą kilpą (RC-LH116) aplink RC. Eksitonais sujungtų pigmentų matrica (1, C ir D paveikslai). Palyginti su RC-LH114-W 877 nm juosta, RC-LH116 absorbcijos raudonasis poslinkis 880 nm juostoje yra 3 nm (2A paveikslas). Tačiau žiedinis dichroizmo spektras yra beveik toks pat (2B paveikslas), o tai rodo, kad nors yra aiškus skirtumas tarp atviros ir uždaros kilpų, vietinė BChls aplinka yra labai panaši. Absorbcijos raudonasis poslinkis gali būti sumažėjusio šiluminio judėjimo ir padidėjusio stabilumo uždaroje kilpoje rezultatas (18, 19), pigmentų sąveikos pokyčio, kurį sukelia uždara kilpa (20, 21), arba šių dviejų efektų derinio rezultatas (11).
(A) Ultravioletinių/matomųjų/artimųjų infraraudonųjų spindulių sugerties spektras, kurio pikai pažymėti atitinkamais pigmentais ir normalizuoti pagal BPh piką ties 775 nm. (B) Apskritiminio dichroizmo spektras, normalizuotas pagal BChl absorbciją ties 805 nm. (C ir D) Pasirinkti ΔA spektrai iš RC-LH114-W komplekso (C) ir RC-LH116 komplekso (D) laiko skiriamosios gebos sugerties spektrų. Siekiant geresnio palyginamumo, visi spektrai normalizuoti pagal ∆A nuo −A ties 0,2 ps. (E) Citochromo c2 oksidacijos greitis po apšvitinimo esant įvairioms UQ2 koncentracijoms (neapdorotus duomenis žr. S8 paveiksle). (F) Ląstelėse, augintose esant silpnam, vidutiniam arba stipriam šviesai (atitinkamai 10, 30 arba 300 μMm-2 s-1), baltymų W ir RC-L subvienetai išgrynintame komplekse ir atskirtų membranų santykis. Baltymų lygis nustatomas SDS-poliakrilamido gelio elektroforeze ir imunologiniu tyrimu (neapdorotus duomenis žr. S9 paveiksle). Nustatykite santykį, palyginti su išgrynintu RC-LH114-W kompleksu. Komplekso stechiometrinis RC-L ir baltymo-W santykis yra 1:1.
Deformuotos RC-LH114-W αβ14 kilpos 1-oje pozicijoje esantys BChl (1 pav., A, C ir E) yra 6,8 Å arčiau RC pirminio donoro (P) nei ekvivalentiški BChl RC-LH116 komplekse (1 pav., B, D ir F bei S3 pav.); tačiau abiejų kompleksų trumpalaikė absorbcijos kinetika rodo, kad RC-LH114-W ir RC-LH116 sužadinimo energijos perdavimo laiko konstantos iš LH1 į RC yra 40 ± 4 ir 44 ± 3 ps (2 pav.). , C ir D, S4 pav. ir S2 lentelė). Taip pat nėra reikšmingo elektronų perdavimo skirtumo RC viduje (S5 pav. ir susijęs papildomas tekstas). Manome, kad glaudus energijos perdavimo laiko tarp LH1 ir RC-P atitikimas atsiranda dėl panašaus daugumos BChl atstumo, kampo ir potencialinės energijos dviejose LH1 kilpose. Atrodo, kad LH1 energijos modelio tyrinėjimas siekiant minimalaus atstumo nėra greitesnis nei tiesioginis energijos perdavimas iš neoptimalių vietų į RC. Atviros kilpos LH1 kilpa RC-LH114-W struktūrinėje analizėje žemos temperatūros sąlygomis taip pat gali patirti nereikšmingą terminį judėjimą, o kambario temperatūroje yra ilgesnė αβ14 žiedo konformacija dėl βBChls pigmentacijos atstumo RC1 padėtyje.
RC-LH116 komplekse yra 32 BChl ir 16 karotinoidų, o bendras jo išsidėstymas yra toks pat, kaip gautas iš Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Protein Data Bank (PDB) ID 5Y5S] (9), Thiorhodovibrio (Trv.) 970 padermės (PDB ID 7C9R) (12) ir žaliųjų dumblių (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10). Po sulygiavimo pastebėti tik nedideli αβ heterodimerų padėčių nukrypimai, ypač 1-5, 15 ir 16 (S6 pav.). Baltymo-W buvimas daro didelę įtaką LH1 struktūrai. Trys jo TMH yra sujungti trumpomis kilpomis, N-galas yra komplekso spindžio pusėje, o C-galas – citoplazmos pusėje (1A ir 3 pav., A–D). Baltymas-W yra daugiausia hidrofobinis (3B pav.), o TMH2 ir TMH3 sąveikauja su LH1αβ-14 ir sudaro transmembraninį paviršių (3 pav., B ir E–G). Sąsają daugiausia sudaro Phe, Leu ir Val liekanos transmembraninėje srityje. Šios liekanos yra sukrautos su hidrofobinėmis aminorūgštimis ir αβ-14 pigmentais. Kai kurios polinės liekanos taip pat prisideda prie sąveikos, įskaitant vandenilinį ryšį tarp W-Thr68 ir β-Trp42 komplekso ertmės paviršiuje (3 pav., F ir G). Citoplazmos paviršiuje Gln34 yra greta αβ-14 karotinoidų keto grupės. Be to, n-dodecil-β-d-maltozido (β-DDM) molekulė buvo atskirta, o jos hidrofobinė uodega pratęsta iki baltymo-W ir αβ-14 sąsajos, o lipidinė uodega gali būti kūne. Taip pat pastebėjome, kad baltymo W ir RCH C-galo skiriamosios gebos regionai yra labai arti vienas kito, tačiau ne specifinių sąveikų susidarymo ribose (1 pav., A ir E). Tačiau sąveikos gali būti ir šių dviejų baltymų neišskaidytose C-galo aminorūgštyse, kurios gali sudaryti mechanizmą baltymo W pritraukimui RC-LH114-W komplekso surinkimo metu.
(A) Baltymas-W, kuris piešinyje pavaizduotas priešais sąsają su LH1αβ14, turi strypo formos šoninę grandinę (raudona), pavaizduotą elektrostatinio potencialo diagramos dalyje (skaidrus pilkas paviršius, kurio kontūro lygis yra 0,13). (B) Baltymas-W, pavaizduotas hidrofobiniu spalvotu paviršiumi. Poliarinės ir įkrautos sritys pavaizduotos žydra spalva, hidrofobinės sritys – balta spalva, o stipriai hidrofobinės sritys – oranžine spalva. (C ir D) Baltymas-W, pavaizduotas piešinyje, jo orientacija tokia pati kaip (A) (C) ir pasuktas 180° (D). Pagal padėtį sekoje, išskiriamos liekanos atitinka vaivorykštės spalvų schemą, kur N-galas yra mėlynas, o C-galas – raudonas. (E) Baltymas-W tame pačiame vaizde kaip ir (A), o liekanos baltymo-W:LH1 sąsajoje pavaizduotos strypais su pritvirtintomis žymėmis. (F) Baltymas-W piešinyje pasuktas 90° kampu (E) ir LH1αβ14 atžvilgiu, o juostiniame vaizde – sąsajos liekanų atžvilgiu. Išsikišusios beta polipeptido liekanos yra pažymėtos. Kofaktorius pavaizduotas kaip juosta, atitinkanti 1 paveikslo spalvą, suskaidytas β-DDM pavaizduotas pilka spalva, o deguonis – raudona spalva. (G) (F) paveikslėlyje esantis vaizdas pasuktas 180° kampu, jame matomos ryškios pažymėto alfa polipeptido liekanos.
Baltymas-W pakeičia αβ heterodimerą (15-ąjį 1F paveiksle), taip neleisdamas kilpos užsidarymui ir pakreipdamas pirmuosius tris αβ heterodimerus. Pastebėta, kad pirmojo αβ-1 heterodimero didžiausias polinkio kampas plėvelės normalės atžvilgiu buvo 25°–29° (1 pav., A ir E), kuris susidarė dėl αβ-1 2°–8° polinkio RC A ryškiame kontraste-LH116 (1 pav., B ir F). Antrasis ir trečiasis heterodimerai yra pakreipti atitinkamai 12°–22° ir 5°–10° kampu. Dėl sterinio RC poveikio αβ-1 pakrypimas neapima antrosios αβ poros (kuri atitinka 16-ąjį αβ 1F paveiksle), todėl LH1 žiede susidaro aiškus tarpas (1 pav., A ir E). Dėl dviejų αβ heterodimerų trūkumo ir keturių BChl bei dviejų karotinoidų netekimo nė vienas karotinoidas neprisijungia prie susukto αβ-1 subvieneto, todėl susidaro LH114-W žiedas, kuriame yra 13 karotinoidų – vegetariškų ir 28 BChl. Dviejų kompleksų αβ1–7 srityse vietinės skiriamosios gebos įverčiai yra mažesni nei likusios LH1 kilpos dalies, o tai gali atspindėti būdingą LH1 subvieneto, esančio greta RC QB vietos, plastiškumą (4 pav.).
RC-LH114-W (A ir B) ir RC-LH116 (C ir D) nuotraukos parodytos iš to paties vaizdo iš viršaus / šono (A ir B) (A ir C) ir ertmės paviršiaus (B ir D), kaip parodyta 1 pav. Spalvoti klavišai parodyti dešinėje.
Vienintelis kitas būdingas branduolio kompleksas, kurio stechiometrinis santykis yra 1:14, yra Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX dimeras (13). Tačiau baltymas W ir PufX neturi akivaizdžios homologijos ir daro didelę įtaką atitinkamoms jų LH1 struktūroms. PufX yra vienas TMH su N-galo citoplazminiu domenu, kuris sąveikauja su RC-H subvieneto citoplazmine puse (13) pozicijoje, atitinkančioje Rps. palustris LH116αβ-16. PufX sukuria kanalą chinono/chinolono mainams tarp RC-LH1 ir citochromo bcl komplekso ir yra visame Rba. sphaeroides branduolio komplekse (13). Nors monomero-monomero sąsaja yra Rba. Sphaeroides RC-LH1-PufX dimeras yra baltymo W prisijungimo pozicijoje RC-LH114-W, o PufX ir baltymo-W sukeltas tarpas yra lygiavertėje pozicijoje (S7A pav.). RC-LH114-W tarpas taip pat sutampa su hipotetiniu Pseudomonas rosea LH1 chinono kanalu (8), kurį sudaro peptidai, nesusiję su baltymu W ar PufX (S7B pav.). Be to, Blc chinono kanalas. Smaragdo žalumo LH1, susidaręs pašalinus vieną γ subvienetą (7), yra panašioje padėtyje (S7C pav.). Nors tai tarpininkauja skirtingi baltymai, šių chinono/chinololio kanalų atsiradimas bendroje RC-LH1 komplekso padėtyje atrodo kaip konvergentinės evoliucijos pavyzdys, rodantis, kad baltymo W sukurtas tarpas gali veikti kaip chinono kanalas.
Tarpas LH114-W kilpoje leidžia susidaryti ištisinei membranos sričiai tarp RC-LH114-W komplekso vidinės erdvės ir pagrindinės membranos (1G pav.), o ne sujungti du domenus per baltymo porą, kaip yra baltymuose. RC-LH116 kompleksas yra panašus į uždarą Tch. adatos formos kompleksą (22) (1H pav.). Kadangi chinono difuzija per membraną yra greitesnė nei difuzija per siaurą baltymo kanalą, atvira LH114-W kilpa gali leisti greitesnę RC apyvartą nei uždara LH116 kilpa, o chinono difuzija į RC gali būti labiau ribota. Norėdami patikrinti, ar baltymas W veikia chinonų konversiją per RC, atlikome citochromo oksidacijos tyrimą su tam tikra ubichinono 2 (UQ2) koncentracija (natūralaus UQ10 analogas su trumpesne izopreno uodega) (2E pav.). Nors chelatinio chinono buvimas trukdo tiksliai nustatyti tariamąją Michaelio konstantą (RC-LH114-W ir RC-LH116 tinka atitinkamai 0,2±0,1 μM ir 0,5±0,2 μM koncentracijoms), maksimalus RC-LH114-W greitis (4,6±0,2 e-RC-1 s-1) yra 28±5 % didesnis nei RC-LH116 (3,6±0,1 e-RC-1 s-1).
Iš pradžių apskaičiavome, kad baltymo W yra apie 10 % pagrindinio komplekso (16); čia silpno, vidutinio ir didelio apšvietimo sąlygomis augančių ląstelių užpildymo rodikliai yra atitinkamai 15 ± 0,6 %, 11 ± 1 % ir 0,9 ± 0,5 % (2F pav.). Kiekybinis masių spektrometrijos palyginimas parodė, kad histidino žymės pridėjimas nesumažino santykinio baltymo W gausumo, palyginti su laukinio tipo padermėmis (P = 0,59), todėl šie lygiai nėra modifikuoto baltymo W artefaktas (S10 pav.). Tačiau šis mažas baltymo W užpildymo rodiklis RC-LH1 komplekse gali leisti kai kuriems RC pagreitintu greičiu apsiversti, taip sumažinant lėtesnį chinono/chinolono mainą RC-LH116 komplekse. Pastebėjome, kad didelis apšvietimo užpildymo rodiklis neatitinka naujausių transkriptomikos duomenų, kurie rodo, kad pufW geno raiška padidėja esant stipriam apšvietimui (S11 pav.) (23). Skirtumas tarp pufW transkripcijos ir baltymo-W įtraukimo į RC-LH1 kompleksą yra painus ir gali atspindėti sudėtingą baltymo reguliavimą.
RC-LH114-W struktūroje išskirtos ir sumodeliuotos 6 kardiolipino (CDL), 7 fosfatidilcholino (POPC), 1 fosfatidilglicerolio (POPG) ir 29 β-DDM molekulės: 6 CDL, 24 POPC, 2 POPG ir 12 βDDM. RC-LH116 (5 pav., A ir B). Šiose dviejose struktūrose CDL beveik išsidėstęs citoplazminėje komplekso pusėje, o POPC, POPG ir β-DDM daugiausia išsidėstę luminalinėje pusėje. Dvi lipidų ir detergentų molekulės buvo išskirtos RC-LH114-W komplekso αβ-1–αβ-6 srityje (5 pav.), o penkios – ekvivalentiškame RC-LH116 regione (5 pav.). Daugiau lipidų rasta kitoje komplekso pusėje, daugiausia CDL, susikaupusių tarp RC ir αβ-7–αβ-13 (5 pav., A ir B). Kiti struktūriškai atskirti lipidai ir detergentai yra už LH1 žiedo ribų, o gerai atskirtos acilo grandinės tęsiasi tarp LH1 subvienetų, preliminariai žymimų β-DDM RC-LH114-W ir apibrėžiamų kaip β-DDM RC A β-DDM ir POPC-LH116 mišinyje. Panašios chelatuojančių lipidų ir detergentų padėtys mūsų struktūroje rodo, kad jos yra fiziologiškai svarbios jungimosi vietos (S12A pav.). Ekvivalentiškų molekulių padėtys Tch taip pat yra geros konsistencijos. „Gentle“ ir „Trv. 970“ padermės RC-LH1 (S12 pav., B–E) (9, 12) ir lipidų galvos grupės vandenilinių jungčių liekanos parodė gana gerą konservatyvumą sekos lygiavime (S13 pav.), o tai rodo, kad konservuotas CDL, kuris jungiasi prie RC (24), šios vietos gali būti konservuotos RC-LH1 komplekse.
(A ir B) RC-LH114-W (A) ir RC-LH116 (B) peptidai pavaizduoti brėžiniais, o pigmentai – lazdelėmis, naudojant 1 paveiksle pateiktą spalvų schemą. Lipidai pavaizduoti raudonai, o detergentai – pilkai. Prie RC QA ir QB vietų prijungtas UQ yra geltonas, o izoliuotas UQ – mėlynas. (C ir D) Tie patys vaizdai kaip (A) ir (B), tik be lipidų. (E–G) Padidintas Q1(E), Q2(F) ir Q3(G) vaizdas iš RC-LH116 su šoninėmis grandinėmis, kurios veikia viena kitą. Vandeniliniai ryšiai pavaizduoti juodomis punktyrinėmis linijomis.
RC-LH116 struktūroje tiek RC QA, tiek QB UQ, kurie dalyvauja elektronų pernašoje krūvio atskyrimo procese, yra suskaidomi savo jungimosi vietose. Tačiau RC-LH114-W struktūroje QB chinonas nebuvo išskirtas ir bus išsamiau aptartas toliau. Be QA ir QB chinonų, dvi chelatuotos UQ molekulės (esančios tarp RC ir LH1 žiedų) RC-LH114-W struktūroje yra paskirstytos pagal jų gerai atskirtas galvines grupes (esančias atitinkamai Q1 ir Q2). 5C pav.). Q1 priskiriami du izopreno vienetai, o tankio žemėlapis išskiria visas 10 Q2 izopreno uodegų. RC-LH116 struktūroje buvo išskirtos trys chelatuotos UQ10 molekulės (Q1–Q3, 5D pav.), ir visos molekulės turi aiškų tankį visoje uodegoje (5 pav., D–G). Abiejose struktūrose chinono galvinių grupių Q1 ir Q2 padėtys yra labai nuoseklios (S12F pav.), ir jos sąveikauja tik su RC. Q1 yra RC-LH114-W W tarpo įėjime (1G ir 5 pav., C, D ir E), o Q2 yra netoli QB prisijungimo vietos (5 pav., C, D ir F). Konservuoti L-Trp143 ir L-Trp269 likučiai yra labai arti Q1 ir Q2 ir suteikia potencialias π-stekavimo sąveikas (5 pav., E ir F bei S12 pav.). L-Gln88, esantis 3,0 Å atstumu nuo Q1 distalinio deguonies, sudaro stiprią vandenilinę jungtį (5 pav. E); ši liekana yra konservuota visose RC, išskyrus tolimiausią ryšį (S13 pav.). Daugumoje kitų RC L-Ser91 yra konservatyviai pakeistas Thr (S13 pav.), yra 3,8 angstremo atstumu nuo Q1 metilo deguonies ir gali sudaryti silpnas vandenilines jungtis (5E pav.). Q3, regis, neturi specifinės sąveikos, bet yra hidrofobinėje srityje tarp RC-M subvieneto ir LH1-α subvienetų 5–6 (5 pav., D ir G). Q1, Q2 ir Q3 arba netoliese esantys chelatuoti chinonai taip pat buvo išskirti Tch. Gentle, Trv. Strain 970 ir Blc. Rainelės struktūra (9, 10, 12) rodo konservatyvią pagalbinę chinono prisijungimo vietą RC-LH1 komplekse (S12G pav.). Penki suskaidyti UQ RC-LH116 gerai atitinka 5,8 ± 0,7 kiekvieno komplekso vertę, nustatytą efektyviosios skysčių chromatografijos (HPLC) metodu, o trys suskaidyti UQ RC-LH114-W yra mažesnės nei . Išmatuota 6,2 ± 0,3 vertė (S14 pav.) rodo, kad struktūroje yra neišspręstų UQ molekulių.
Pseudosimetriniai L ir M polipeptidai turi penkis TMH ir sudaro heterodimerą, kuris sujungia vieną BChl dimerą, du BChl monomerus, du bakteriofago (BPh) monomerus, vieną neheminę geležį ir vieną ar dvi UQ10 molekules. Dėl vandenilinių jungčių buvimo galinėje ketonų grupėje ir žinomo jos kaupimosi Rps, karotenoidai yra įtraukiami į M subvienetą, kuris vadinamas cis-3,4-dehidroorodopinu. Rūšis (25). RC-H išorinės membranos domenas yra pritvirtintas prie membranos vienu TMH. Bendra RC struktūra yra panaši į susijusių rūšių (pvz., Rba) tris subvienetus RC. sphaeroides (PDB ID: 3I4D). BChl ir BPh makrociklai, karotinoidų pagrindas ir neheminė geležis sutampa šių struktūrų skiriamosios gebos diapazone, kaip ir UQ10 galvos grupė QA vietoje bei QB chinonas RC-LH116 (S15 pav.).
Dviejų RC struktūrų su skirtingu QB vietų užimtumo greičiu prieinamumas suteikia naują galimybę ištirti nuoseklius konformacinius pokyčius, lydinčius QB chinono prisijungimą. RC-LH116 komplekse QB chinonas yra visiškai surištoje „proksimalinėje“ padėtyje (26), tačiau RC-LH114-W atskyrimas neturi QB chinono. RC-LH114-W nėra QB chinono, kas stebina, nes kompleksas yra aktyvesnis, labiau nei RC-LH116 kompleksas su struktūriškai atskirtu QB chinonu. Nors du LH1 žiedai chelatuoja apie šešis chinonus, penki yra struktūriškai atskirti uždarame RC-LH116 žiede, o tik trys yra struktūriškai apriboti atvirame RC-LH114-W žiede. Šis padidėjęs struktūrinis netvarkingumas gali atspindėti greitesnį RC-LH114-W QB vietų pakeitimą, greitesnę chinono kinetiką komplekse ir didesnę tikimybę kirsti LH1 kilpą. Manome, kad UQ trūkumas RC-LH114-W RC QB vietoje gali būti sudėtingesnio ir aktyvesnio komplekso rezultatas, o RC-LH114-W QB vieta iš karto užšalo UQ apykaitoje. Specifinis etapas (įėjimas į QB vietą buvo uždarytas) atspindi šio aktyvumo konformaciją.
Be QB, L-Phe217 pasisuka į padėtį, kuri nesuderinama su UQ10 prisijungimu, nes tai sukels erdvinį susidūrimą su pirmuoju uodegos izopreno vienetu (6A pav.). Be to, akivaizdūs pagrindiniai konformaciniai pokyčiai, ypač spiralė „de“ (trumpa spiralė kilpoje tarp TMH D ir E), kur L-Phe217 pasislenka į QB prisijungimo kišenę, ir L-Tyr223 pasisuka (6A pav.), kad nutrauktų vandenilinį ryšį su M-Asp45 karkasu ir uždarytų QB prisijungimo vietos įėjimą (6B pav.). Helix „de“ pasisuka ties pagrindu, L-Ser209 Cα pasislenka 0,33 Å, o L-Val221Cα – 3,52 Å. TMH D ir E pokyčių, kurie yra persidengiantys abiejose struktūrose, nėra (6A pav.). Kiek mums žinoma, tai yra pirmoji natūralios RC struktūra, kuri uždaro QB vietą. Palyginus su pilna (prie QB prijungta) struktūra, matyti, kad prieš redukuojant chinoną, reikalingas konformacinis pokytis, kad jis patektų į chinoną. L-Phe217 sukasi ir sudaro π sąveiką su chinono galvine grupe, o spiralė pasislenka į išorę, leisdama L-Gly222 skeletui ir L-Tyr223 šoninei grandinei sudaryti vandenilinių jungčių tinklą su stabilia vandenilinių jungčių struktūra (6 pav., A ir C).
(A) Persidengianti hologramos (L grandinė, oranžinė / M grandinė, rausvai raudona) ir apo (pilka) struktūros piešinys, kuriame pagrindinės liekanos pavaizduotos lazdelės pavidalu. UQ10 pavaizduotas geltona juosta. Punktyrinė linija žymi visoje struktūroje susidariusius vandenilinius ryšius. (B ir C) Apolipoproteino ir visos žiedo struktūros paviršiaus atvaizdavimas, kuriame L-Phe217 šoninės grandinės deguonis paryškintas mėlyna spalva, o L-Tyr223 – raudonai. L subvienetas yra oranžinis; M ir H subvienetai nespalvoti. (D ir E) Apolipoproteinas (D) ir visas (E) RC QB vietos [pažymėtos atitinkamai (A) spalva] ir Thermophilus thermophilus PSII (žalia, mėlyna su plastiko chinonu; PDB ID: 3WU2) Sulygiuokite (58).
Netikėtai, nors yra žinoma keletas QB stokojančių RC struktūrų be LH1, šiame tyrime pastebėti konformaciniai pokyčiai anksčiau nebuvo aprašyti. Tai apima QB trūkumo struktūrą iš Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) ir Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29), kurios visos beveik nesiskiria nuo bendros jų QB struktūros. Atidžiai ištyrus 3PRC, paaiškėjo, kad LDAO (laurilo dimetilamino oksido) detergento molekulės jungiasi prie QB pozicijos įėjimo, o tai gali neleisti persitvarkyti į uždarą konformaciją. Nors LDAO nesuyra toje pačioje pozicijoje 1EYS ar 1OGV, šie RC yra paruošiami naudojant tą patį detergentą, todėl gali sukelti tą patį efektą. Rba. Sphaeroides RC, kokristalizuoto su citochromu c2 (PDB ID: 1L9B), kristalinė struktūra taip pat, atrodo, turi uždarą QB vietą. Tačiau šiuo atveju RC-M polipeptido N-galinė sritis (sąveikaujanti su QB prisijungimo vieta per Tyr liekanos H ryšį Q spiralėje) įgauna nenatūralią konformaciją, ir QB konformacinis pokytis toliau nenagrinėjamas (30). Džiugu tai, kad RC-LH114-W struktūroje, kuri beveik tokia pati kaip RC-LH116 RC N-galinė sritis, tokio pobūdžio M polipeptido deformacijos nepastebėjome. Taip pat reikėtų pažymėti, kad pašalinus detergento pagrindu sukurtą LH1 anteną, PDB esantys apolipoproteinų RC buvo suskaidyti, o tai panaikino vidinius chinonų telkinius ir lipidus tarpe tarp RC ir aplinkinio LH1 žiedo vidinio paviršiaus (31, 32). RC išlieka funkcionalus, nes išlaiko visus kofaktorius, išskyrus skaidomą QB chinoną, kuris yra mažiau stabilus ir dažnai prarandamas paruošimo proceso metu (33). Be to, žinoma, kad LH1 ir natūralių ciklinių lipidų pašalinimas iš RC gali turėti įtakos funkcijoms, pavyzdžiui, sutrumpinti krūviu atskirtos P+QB būsenos gyvavimo trukmę (31, 34, 35). Todėl spėjame, kad vietinio LH1 žiedo, supančio RC, egzistavimas gali išlaikyti „uždarytą“ QB vietą, taip išsaugant vietinę aplinką šalia QB.
Nors apolipoproteinas (be QB chinono) ir visa struktūra atspindi tik du QB vietos apykaitos momentinius vaizdus, ​​o ne įvykių seką, yra požymių, kad prisijungimas gali būti užblokuotas, siekiant išvengti pakartotinio prisijungimo hidrochinonu, slopinant substrato slopinimą. Chinololio ir chinono sąveika šalia apolipoproteino QB vietos gali būti skirtinga, todėl RC ją atmeta. Jau seniai buvo teigiama, kad konformaciniai pokyčiai vaidina svarbų vaidmenį chinonų prisijungime ir redukcijoje. Sušalusių RC gebėjimas redukuoti chinonus po adaptacijos tamsoje yra sutrikęs (36); rentgeno kristalografija rodo, kad šis pažeidimas atsiranda dėl to, kad QB chinonai yra įstrigę „distalinėje“ konformacijoje maždaug 4,5 Å atstumu nuo aktyvios proksimalinės padėties (26), 37). Manome, kad ši distalinė prisijungimo konformacija yra tarpinės būsenos tarp apolipoproteino ir pilnos žiedinės struktūros, kuri seka po pradinės sąveikos su chinonu ir QB vietos atsidarymo, momentinis vaizdas.
II tipo RC, randamas tam tikrų fototrofinių bakterijų ir melsvabakterų, dumblių ir augalų PSII komplekse, pasižymi struktūriniu ir funkciniu konservatyvumu (38). 6 paveiksle (D ir E) parodytas struktūrinis išsidėstymas pabrėžia PSII RC ir bakterijų RC komplekso QB vietos panašumą. Šis palyginimas jau seniai naudojamas kaip modelis, skirtas tirti glaudžiai susijusias chinonų prisijungimo ir redukcijos sistemas. Ankstesnėse publikacijose teigiama, kad konformacinius pokyčius lydi chinonų PSII redukcija (39, 40). Todėl, atsižvelgiant į RC evoliucinį konservatyvumą, šis anksčiau nepastebėtas prisijungimo mechanizmas taip pat gali būti taikomas PSII RC QB vietai deguonimi prisotintuose fototrofiniuose augaluose.
Rps ΔpufW (nežymėta pufW delecija) ir PufW-His (C-galo 10x His žymėtas baltymas-W, ekspresuojamas iš natūralaus pufW lokuso) padermės. palustris CGA009 buvo aprašytos ankstesniame mūsų darbe (16). Šios padermės ir izogeninis laukinio tipo tėvas buvo išgautos iš šaldiklio, perkeliant nedidelį skaičių ląstelių ant PYE (kiekviena 5 g/l) (laikoma LB terpėje -80 °C temperatūroje, kurioje yra 50 % (m/t) glicerolio) baltymo, mielių ekstrakto ir sukcinato) agaro [1,5 % (m/t)]. Plokštelė buvo inkubuojama per naktį tamsoje kambario temperatūroje anaerobinėmis sąlygomis, o po to 3–5 dienas apšviesta balta šviesa (~50 μmolm-2 s-1), kurią teikė OSRAM 116-W halogeninės lemputės (RS Components, JK), kol pasirodė viena kolonija. Viena kolonija buvo panaudota 10 ml M22+ terpės (41), papildytos 0,1 % (m/t) kazino rūgščių (toliau – M22), inokuliuoti. Kultūra buvo auginama mažo deguonies kiekio sąlygomis tamsoje 34 °C temperatūroje, kratant 180 aps./min. greičiu 48 valandas, o po to 70 ml kultūros buvo inokuliuojama tomis pačiomis sąlygomis 24 valandas. Pusiau aerobinė kultūra, kurios tūris yra 1 ml, buvo naudojama 30 ml M22 terpės inokuliavimui 30 ml universaliame permatomame stikliniame buteliuke su užsukamu dangteliu ir apšvitinta maišant (~50 μmolm-2 s-1) 48 valandas steriliu magnetiniu maišymo strypu. Tada 30 ml kultūros buvo inokuliuojama maždaug 1 litru kultūros tomis pačiomis sąlygomis, kuri vėliau buvo panaudota maždaug 9 litrų kultūros, apšviestos ~200 μmolm-2 s-1 greičiu 72 valandas, inokuliavimui. Ląstelės buvo surinktos centrifuguojant 7132 RCF greičiu 30 minučių, resuspenduotos ~10 ml 20 mM tris-HCl (pH 8,0) ir laikomos -20 °C temperatūroje, kol prireikė.
Atšildžius, į resuspenduotas ląsteles įdėkite kelis deoksiribonukleazės I kristalus („Merck“, JK), lizocimo („Merck“, JK) ir dvi „Roche“ holofermento proteazės inhibitoriaus tabletes („Merck“, JK). 20 000 psi prancūziško slėgio kameroje („Aminco“, JAV) ląstelės buvo suardytos 8–12 kartų. Pašalinus nesuardytas ląsteles ir netirpias šiukšles centrifuguojant 18 500 RCF greičiu 15 minučių 4 °C temperatūroje, membrana buvo nusodinta iš pigmentuoto lizato centrifuguojant 113 000 RCF greičiu 2 valandas 43 000 °C temperatūroje. Tirpiąją frakciją išmeskite ir spalvotą membraną resuspenduokite 100–200 ml 20 mM tris-HCl (pH 8,0) ir homogenizuokite, kol nebeliks matomų agregatų. Suspenduota membrana buvo inkubuojama 20 mM tris-HCl (pH 8,0) (Anatrace, JAV), kuriame yra 2 % (m/t) β-DDM, 1 valandą tamsoje 4 °C temperatūroje, švelniai maišant. Tada centrifuguojama 70 °C temperatūroje, kad ištirptų 150 000 RCF 4 °C temperatūroje 1 valandą, kad būtų pašalintos likusios netirpios medžiagos.
ΔpufW padermės tirpinimo membrana buvo uždėta ant 50 ml DEAE Sepharose jonų mainų kolonėlės su trimis kolonėlės tūriais (CV) rišamojo buferio [20 mM tris-HCl (pH 8,0), kuriame yra 0,03 % (m/t) β-DDM]. Kolonėlė buvo plaunama dviem CV rišamaisiais buferiais, o po to – dviem rišamaisiais buferiais, kuriuose yra 50 mM NaCl. RC-LH116 kompleksas buvo eliuotas tiesiniu gradientu nuo 150 iki 300 mM NaCl (rišamajame buferyje) esant 1,75 CV, o likęs rišamasis kompleksas buvo eliuotas rišamuoju buferiu, kuriame yra 300 mM NaCl, esant 0,5 CV. Surinkite absorbcijos spektrą tarp 250 ir 1000 nm, išlaikykite frakciją, kurios absorbcijos santykis (A880/A280) yra didesnis nei 1 ties 880–280 nm, du kartus praskiedžiama rišamuoju buferiu ir vėl naudokite tą pačią procedūrą DEAE kolonėlėje gryninimo metu. Frakcijas, kurių A880/A280 santykis didesnis nei 1,7, o A880/A805 santykis didesnis nei 3,0, praskieskite, atlikite trečiąjį jonų mainų etapą ir išsaugokite frakcijas, kurių A880/A280 santykis didesnis nei 2,2, o A880/A805 santykis didesnis nei 5,0. Iš dalies išgrynintas kompleksas buvo sukoncentruotas iki ~2 ml „Amicon 100 000“ molekulinės masės ribos (MWCO) išcentriniame filtre („Merck“, JK) ir įkeltas į „Superdex 200 16/600“ dydžio išskyrimo kolonėlę („GE Healthcare“, JAV) su 200 mM NaCl buferiu, o po to eliuotas tame pačiame buferyje esant 1,5 CV. Surinkite dydžio išskyrimo frakcijos sugerties spektrus ir sukoncentruokite sugerties spektrus, kai A880/A280 santykis yra didesnis nei 2,4, o A880/A805 santykis yra didesnis nei 5,8–100, ir nedelsdami panaudokite juos kriogeninio TEM tinklelio paruošimui arba laikymui. Laikykite -80 °C temperatūroje, kol prireiks.
PufW-His padermės tirpinimo membrana buvo uždėta ant 20 ml HisPrep FF Ni-NTA sefarozės kolonėlės (20 mM tris-HCl (pH 8,0), kuriame yra 200 mM NaCl ir 0,03 % (m/m)) IMAC buferyje („GE Healthcare“). v) β-DDM]. Kolonėlė buvo plaunama penkiais IMAC buferio kronšteinais, o po to penkiais IMAC buferio kronšteinais, kuriuose yra 10 mM histidino. Pagrindinis kompleksas buvo eliuotas iš kolonėlės penkiais IMAC buferiais, kuriuose yra 100 mM histidino. Frakcijos, kuriose yra RC-LH114-W kompleksas, koncentruojamos iki ~10 ml maišomojoje talpykloje su „Amicon 100,000 MWCO“ filtru („Merck“, JK), 20 kartų praskiedžiamos rišamuoju buferiu ir po to įpilamos į 25 ml DEAE sefarozės kolonėlėje iš anksto naudojami keturi prie buferio surišti kronšteinai. Kolonėlė plaunama keturiais CV jungimosi buferiais, tada kompleksas eliuuojamas aštuoniais CV, naudojant linijinį gradientą nuo 0 iki 100 mM NaCl (jungimosi buferyje), o likusiuose keturiuose CV yra 100 mM jungimosi buferio. Likę kompleksai, eliuuoti natrio chloridu, kurio A880/A280 santykis didesnis nei 2,4, ir A880/A805 santykis didesnis nei 4,6, frakcijos buvo sukoncentruotos iki ~2 ml Amicon 100 000 MWCO centrifuginiame filtre ir užpildytos 1,5 CV IMAC iš anksto buferiu subalansuota Superdex 200 16/600 dydžio išskyrimo kolonėle, o tada eliuuojami tame pačiame buferyje per 1,5 CV. Surinkite dydžio išskyrimo frakcijų sugerties spektrus ir sukoncentruokite sugerties spektrus, kai A880/A280 santykis yra didesnis nei 2,1, o A880/A805 santykis yra didesnis nei 4,6, iki 100 A880. Šie spektrai nedelsiant naudojami užšaldytam TEM tinklelio paruošimui arba laikomi -80 °C temperatūroje iki reikalo.
Žemos temperatūros TEM grotelėms paruošti buvo naudojamas „Leica EM GP“ panardinamasis šaldiklis. Kompleksas buvo praskiestas IMAC buferiu iki A880 50, o po to 5 μl buvo įpilta ant naujai švytinčiai iškrauto QUANTIFOIL 1.2/1.3 anglimi padengto vario tinklelio („Agar Scientific“, JK). Tinklelis inkubuojamas 20 °C temperatūroje ir 60 % santykinėje drėgmėje 30 s, tada 3 s nusausinamas ir galiausiai atšaldomas skystame etane -176 °C temperatūroje.
RC-LH114-W komplekso duomenys buvo įrašyti eBIC (elektroniniame biovaizdavimo centre) („British Diamond Light Source“) naudojant „Titan Krios“ mikroskopą, kuris veikia esant 300 kV greitinimo įtampai, nominaliam 130 000 kartų didinimui ir 20 eV energijai. Vaizdams įrašyti skaičiavimo režimu buvo naudojamas „Gatan 968 GIF Quantum“ mikroskopas su K2 smailės detektoriumi. Kalibruoto pikselio dydis yra 1,048 Å, o dozės galia – 3,83 e-Å⁻²s⁻¹. Vaizdo įrašas buvo surinktas per 11 sekundžių ir padalintas į 40 dalių. Naudojant anglies danga padengtą sritį, mikroskopas buvo sufokusuotas, o tada kiekvienoje skylutėje buvo surinkti trys vaizdo įrašai. Iš viso buvo surinkta 3130 vaizdo įrašų, kurių defokusavimo vertės buvo nuo -1 iki -3 μm.
RC-LH116 komplekso duomenys buvo surinkti tuo pačiu mikroskopu Asterbury biostruktūros laboratorijoje (Lidso universitetas, JK). Duomenys buvo renkami skaičiavimo režimu, naudojant 130 k didinimą, o pikselių dydis buvo kalibruotas iki 1,065 Å su 4,6 e-Å-2s-1 doze. Filmas buvo įrašytas per 12 sekundžių ir padalintas į 48 dalis. Iš viso buvo surinkti 3359 filmai, kurių defokusavimo vertės buvo nuo -1 iki -3 μm.
Visas duomenų apdorojimas atliekamas „Relion 3.0“ sraute (42). Naudokite „Motioncorr 2“ (43), kad pakoreguotumėte spindulio judėjimą pagal dozės svertinį vertinimą, o tada naudokite „CTFFIND 4.1“ (44), kad nustatytumėte CTF (kontrasto perdavimo funkcijos) parametrą. Tipinės fotomikrografijos po šių pradinių apdorojimo etapų parodytos 2 paveiksle. S16. Automatinio pasirinkimo šablonas generuojamas rankiniu būdu pasirinkus apie 250 pikselių su 1000 dalelių 250 pikselių kadre ir be etaloninės dvimatės (2D) klasifikacijos, tokiu būdu atmetant tas klasifikacijas, kurios atitinka mėginio užterštumą arba neturi jokių pastebimų savybių. Tada automatinė atranka buvo atlikta visose mikrofotografijose, ir RC-LH114-W buvo 849 359 dalelės, o RC-LH116 kompleksas - 476 547 dalelės. Visos atrinktos dalelės buvo du kartus klasifikuojamos be etaloninės analizės, ir po kiekvieno etaloninės analizės atmetamos dalelės, kurios atitinka anglies sritį, mėginio užterštumą, nėra akivaizdžių požymių arba stipriai persidengia. Gaunamos atitinkamai 772 033 (90,9 %) ir 359 678 (75,5 %) dalelės. Šios dalelės naudojamos RC-LH114-W ir RC-LH116 3D klasifikacijai. Pradinis 3D etaloninis modelis buvo sugeneruotas naudojant stochastinį gradiento mažėjimo metodą. Naudojant pradinį modelį kaip etaloną, pasirinktos dalelės 3D formatu klasifikuojamos į keturias kategorijas. Naudojant šios kategorijos modelį kaip etaloną, atliekamas didžiausios kategorijos dalelių 3D patikslinimas, tada naudojamas pradinis 15 Å žemo dažnio filtras tirpiklio sričiai padengti, pridedami 6 pikseliai su švelniomis briaunomis ir pikseliai apdorojami vėliau, kad būtų pataisyta viršutinio detektoriaus Gatan K2 smailės moduliacijos perdavimo funkcija. RC-LH114-W duomenų rinkiniui šis pradinis modelis buvo modifikuotas pašalinant stiprų tankį kaukės kraštuose (atjungtą nuo pagrindinio komplekso tankio UCSF chimeroje). Gauti modeliai (RC-LH114-W ir RC-LH116 skiriamoji geba yra atitinkamai 3,91 ir 4,16 Å) naudojami kaip atskaitos taškas antrajam 3D klasifikavimo etapui. Naudotos dalelės yra sugrupuotos į pradinę 3D klasę ir neturi stiprios koreliacijos su kaimynyste. Persidengia arba neturi akivaizdžių struktūrinių ypatybių. Po antrojo 3D klasifikavimo etapo buvo pasirinkta kategorija su didžiausia skiriamąja geba [RC-LH114-W atveju viena kategorija yra 377 703 dalelės (44,5 %), RC-LH116 atveju yra dvi kategorijos, iš viso 260 752 dalelės (54,7 %), kur jos yra vienodos tik sulygiuotos po pradinio pasukimo su nedideliu skirtumu]. Pasirinktos dalelės pakartotinai išskiriamos 400 pikselių dėžutėje ir patikslinamos 3D patikslinimu. Tirpiklio kaukė generuojama naudojant pradinį 15 Å žemo dažnio filtrą, 3 pikselių žemėlapio išplėtimą ir 3 pikselių minkštąją kaukę. Naudojant dalelių CTF patikslinimą, dalelių judesio korekciją ir antrąjį dalelių CTF patikslinimo etapą, po kiekvieno žingsnio atliekamas 3D patikslinimas, tirpiklio maskavimas ir papildomas apdorojimas, siekiant dar labiau patikslinti gautą tekstūrą. Naudojant FSC (Furjė koreliacijos koeficiento) ribinę vertę, lygią 0,143, galutinių RC-LH114-W ir RC-LH116 modelių skiriamoji geba yra atitinkamai 2,65 ir 2,80 Å. Galutinio modelio FSC kreivė parodyta 2 paveiksle. S17.
Visos baltymų sekos atsisiųstos iš „UniProtKB“: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProt ID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). RC homologijos modeliui sukurti buvo naudojamas SWISS-MODEL (45), kuriame yra RC-L, RC-M ir RC-H baltymų sekos bei Rba kristalinė struktūra. Kaip šablonas buvo naudojamas sphaeroides RC (PDB ID: 5LSE) (46). Norėdami pritaikyti sugeneruotą modelį prie žemėlapio (47), pagerinti baltymo struktūrą ir kofaktorių [4×BChl a (monomerų bibliotekos liekanos pavadinimas = BCL), 2×BPh a (BPH), vienos ar dviejų rūšių UQ10 (U10), vienos rūšies neheminė geležis (Fe) ir viena 3,4-dihidroheksakarbonilcholino (QAK)], naudokite UCSF Chimera programos įrankį „fit map“ (48), kad pridėtumėte. Kadangi QAK monomerų bibliotekoje nėra, jis buvo parametrizuotas naudojant PHENIX programos įrankį eLBOW (49).
Toliau buvo sukonstruotas LH1 subvienetas. Iš pradžių, naudojant PHENIX (49) automatinio konstravimo įrankį, buvo automatiškai sukonstruota dalis LH1 sekos, naudojant žemėlapį ir LH1-α bei LH1-β baltymų sekas kaip įvestį. Pasirinkite pilniausią LH1 subvienetą, išskirkite jį ir įkelkite į Coot, rankiniu būdu pridėkite trūkstamą seką ir rankiniu būdu patikslinkite visą struktūrą prieš pridėdami du BCls a (BCL) ir spirilloksantiną (CRT) [pagal atitinkamus Rps]. LH1 komplekso tankis ir žinomas karotinoidų kiekis. Rūšis (17)]. Nukopijuokite visą LH1 subvienetą ir, naudodami UCSF Chimera „Docking Map Tool“, pritvirtinkite gretimą nemodelinę LH1 tankio sritį, tada patikslinkite ją Coot; kartokite procesą, kol bus sumodeliuoti visi LH1 subvienetai. RC-LH114-W struktūrai, išgaunant nepaskirstytą tankį iš Coot, baltymas segmentuojamas nuo likusių nebaltyminių komponentų USCF Chimera žemėlapyje ir naudojant automatinio kūrimo įrankį sukuriamas pradinis modelis bei likusių subvienetų (baltymų-W) modeliavimas. Programoje PHENIX (49). Į gautą modelį Coot (48) įtraukite visas trūkstamas sekas ir rankiniu būdu patikslinkite visą subvienetą. Likęs nepaskirstytas tankis atitinka lipidų (PDB monomerų bibliotekos ID CDL = CDL, POPC = 6PL ir POPG = PGT), β-DDM detergento (LMT) ir UQ10 molekulių (U10) derinį. Norėdami patobulinti visą pradinį modelį, naudokite PHENIX optimizavimą (49) ir rankinį optimizavimą Coot (48), kad pagerintumėte visą pradinį modelį, kol nebebus galima pagerinti modelio statistikos ir vizualinės atitikimo kokybės. Galiausiai, naudokite LocScale (50), kad paaštrintumėte vietinį žemėlapį, o tada atlikite kelis kitus nepaskirstyto tankio modeliavimo ir automatinio bei rankinio optimizavimo ciklus.
Atitinkami peptidai, kofaktoriai ir kiti lipidai bei chinonai, sujungti su atitinkamu tankiu, parodyti 1 ir 2 paveiksluose. S18–S23. Galutinio modelio statistinė informacija pateikta S1 lentelėje.
Jei nenurodyta kitaip, UV/Vis/NIR absorbcijos spektrai buvo surinkti Cary60 spektrofotometru (Agilent, JAV) 1 nm intervalais nuo 250 nm iki 1000 nm ir integravimo laiku 0,1 s.
Mėginys kvarco kiuvetėje, kurios ilgis yra 2 mm, praskiedžiamas iki A880 1 ir surenkamas absorbcijos spektras tarp 400 ir 1000 nm. Žiediniai dichroiniai spektrai buvo surinkti „Jasco 810“ spektrofolarimetru („Jasco“, Japonija) 1 nm intervalais tarp 400 nm ir 950 nm, skenavimo greičiu 20 nm min-1.
Molinis ekstinkcijos koeficientas nustatomas praskiedžiant šerdies kompleksą iki maždaug 50 A880. 10 μl tūrį praskiedžiama 990 μl rišamojo buferio arba metanolio ir nedelsiant surenkamas absorbcijos spektras, siekiant sumažinti BChl skaidymą. Kiekvieno metanolio mėginio BChl kiekis buvo apskaičiuotas pagal 54,8 mM-1 cm-1 ekstinkcijos koeficientą ties 771 nm, o ekstinkcijos koeficientas buvo nustatytas (51). Išmatuotą BChl koncentraciją padalykite iš 32 (RC-LH114-W) arba 36 (RC-LH116), kad nustatytumėte šerdies komplekso koncentraciją, kuri vėliau naudojama to paties mėginio, surinkto buferyje, absorbcijos spektrui nustatyti. Ekstinkcijos koeficientas. Kiekvienam mėginiui atlikti trys pakartotiniai matavimai, o skaičiavimui naudojamas vidutinis BChl Qy maksimumo sugerties tankis. RC-LH114-W ekstinkcijos koeficientas, išmatuotas esant 878 nm bangos ilgiui, yra 3280 ± 140 mM-1 cm-1, o RC-LH116 ekstinkcijos koeficientas, išmatuotas esant 880 nm bangos ilgiui, yra 3800 ± 30 mM-1 cm-1.
UQ10 buvo kiekybiškai įvertintas pagal (52) aprašytą metodą. Trumpai tariant, atvirkštinės fazės HPLC (RP-HPLC) buvo atliktas naudojant „Agilent 1200 HPLC“ sistemą. Ištirpinkite apie 0,02 nmol RC-LH116 arba RC-LH114-W 50 μl 50:50 metanolio ir chloroformo mišinio, kuriame yra 0,02 % (m/t) geležies chlorido, ir įšvirkškite iš anksto subalansuotą „Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4,6 mm“, ištirpintą 1 ml-1 min-1 greičiu 40 °C temperatūroje HPLC tirpiklyje (80:20 metanolis:2-propanolis) į × 25 cm kolonėlę. Atlikite izokratinę eliuciją HPLC tirpiklyje, kad 1 valandą stebėtumėte absorbciją esant 275 nm (UQ10), 450 nm (karotenoidai) ir 780 nm (BChl). 275 nm chromatogramoje esanti smailė, esanti ties 25,5 minutės, buvo integruota ir neturėjo jokių kitų aptinkamų junginių. Integruotas plotas naudojamas ekstrahuoto UQ10 moliniam kiekiui apskaičiuoti, remiantis kalibravimo kreive, apskaičiuota įpurškiant grynus standartus nuo 0 iki 5,8 nmol (S14 pav.). Kiekvienas mėginys buvo analizuojamas trimis pakartojimais, o nurodyta paklaida atitinka vidurkio standartinį nuokrypį.
Paruoštas tirpalas, kuriame yra RC-LH1 komplekso, kurio maksimali Qy absorbcija yra 0,1, su 30 μM redukuoto arklio širdies citochromo c2 (Merck, JK) ir 0–50 μMUQ2 (Merck, JK). Kiekvienai UQ2 koncentracijai buvo paruošti trys 1 ml mėginiai ir inkubuoti per naktį tamsoje 4 °C temperatūroje, siekiant užtikrinti visišką prisitaikymą prie tamsos prieš matavimą. Tirpalas buvo įpiltas į modulinį OLIS RSM1000 spektrofotometrą su 300 nm liepsnos / 500 linijų gardele, 1,24 mm įleidimo anga, 0,12 mm vidurine ir 0,6 mm išleidimo anga. Prie mėginio fototubo ir etaloninio fotodaugintuvo įėjimo angos buvo įdėtas 600 nm ilgio pralaidumo filtras, kad būtų pašalinta sužadinimo šviesa. Absorbcija buvo stebima esant 550 nm bangos ilgiui, integravimo laikas – 0,15 s. Sužadinimo šviesa skleidžiama iš 880 nm bangos ilgio M880F2 LED (šviesos diodo) („Thorlabs Ltd.“, JK) per šviesolaidinį kabelį 90 % intensyvumu per DC2200 valdiklį („Thorlabs Ltd.“, JK) ir skleidžiama į šviesos šaltinį 90° kampu. Matavimo spindulys yra nukreiptas prieš veidrodį, kad grąžintų bet kokią šviesą, kurios iš pradžių neabsorbavo mėginys. Stebėkite absorbciją 10 s prieš 50 s apšvietimą. Tada absorbcija buvo toliau stebima 60 s tamsoje, siekiant įvertinti, kiek chinololis savaime redukuoja citochromą c23+ (žr. S8 paveikslą, kuriame pateikti neapdoroti duomenys).
Duomenys buvo apdoroti pritaikant tiesinį pradinį greitį 0,5–10 s intervale (priklausomai nuo UQ2 koncentracijos) ir apskaičiuojant visų trijų mėginių greičių vidurkį esant kiekvienai UQ2 koncentracijai. RC-LH1 koncentracija, apskaičiuota pagal atitinkamą ekstinkcijos koeficientą, buvo naudojama greičiui konvertuoti į katalizinį efektyvumą, nubraižytą „Origin Pro 2019“ („OriginLab“, JAV) ir pritaikytą Michaelis-Menten modeliui, siekiant nustatyti regimas Km ir Kcat vertes.
Pereinamosios absorbcijos matavimams RC-LH1 mėginys buvo praskiestas iki ~2 μM IMAC buferyje, kuriame yra 50 mM natrio askorbato („Merck“, JAV) ir 0,4 mM terbutino („Merck“, JAV). Askorbo rūgštis naudojama kaip aukojamasis elektronų donoras, o tret-butaklofenas – kaip QB inhibitorius, siekiant užtikrinti, kad pagrindinis RC donoras išliktų redukuotas (t. y. nefotooksiduotas) viso matavimo proceso metu. Maždaug 3 ml mėginio įdedama į specialiai pagamintą besisukantį elementą (apie 0,1 m skersmens, 350 aps./min.), kurio optinio kelio ilgis yra 2 mm, siekiant užtikrinti, kad mėginys lazerio kelyje turėtų pakankamai laiko prisitaikyti prie tamsos tarp sužadinimo impulsų. Naudokite ~100 fs lazerio impulsus, kad sustiprintumėte Ti:Safyro lazerio sistemą („Spectra Physics“, JAV), kad sužadintumėte mėginį esant 880 nm bangos ilgiui ir 1 kHz pasikartojimo dažniu (20 nJ artimajai infraraudonajai spinduliuotei arba 100 nJ matomajai spinduliuotei). Prieš rinkdami duomenis, mėginį apie 30 minučių palaikykite sužadinimo šviesoje. Poveikis sukels QA inaktyvaciją (galbūt vieną ar du kartus sumažins QA). Tačiau atkreipkite dėmesį, kad šis procesas yra grįžtamas, nes po ilgo tamsos adaptacijos laikotarpio RC lėtai grįžta į QA aktyvumą. Pereinamiesiems spektrams matuoti buvo naudojamas „Helios“ spektrometras („Ultrafast Systems“, JAV), kurio uždelsimo laikas buvo nuo -10 iki 7000 ps. Naudokite „Surface Xplorer“ programinę įrangą („Ultrafast Systems“, JAV) duomenų rinkiniams išgrupuoti, tada sujungti ir standartizuoti. Naudokite „CarpetView“ programinės įrangos paketą („Light Conversion Ltd.“, Lietuva), kad gautumėte sujungtą duomenų rinkinį ir sukurtumėte su skilimu susijusius diferencinius spektrus, arba naudokite funkciją, kuri sujungia kelias laipsnio rodiklius su prietaiso atsaku, kad atitiktų vieno bangos ilgio spektrinę evoliuciją programoje „Origin“ („OriginLab“, JAV).
Kaip minėta aukščiau (53), buvo paruošta fotosintetinė plėvelė, turinti LH1 kompleksą, neturintį nei RC, nei periferinės LH2 antenos. Membrana buvo praskiesta 20 mM Tris (pH 8,0) ir įkelta į kvarcinę kiuvetę su 2 mm optiniu keliu. Mėginys buvo sužadintas 30 nJ lazerio impulsu esant 540 nm bangos ilgiui, o uždelsimo laikas buvo nuo -10 iki 7000 ps. Duomenų rinkinys apdorojamas taip, kaip aprašyta Rps.pal mėginiui.
Membrana buvo suspenduota centrifuguojant 150 000 RCF greičiu 2 valandas 4 °C temperatūroje, o tada jos absorbcija esant 880 nm buvo resuspenduota 20 mM tris-HCl (pH 8,0) ir 200 mM NaCl. Membraną ištirpinkite lėtai maišydami 2 % (m/t) β-DDM tirpale 1 valandą tamsoje 4 °C temperatūroje. Mėginys buvo praskiestas 100 mM trietilamonio karbonatu (pH 8,0) (TEAB; „Merck“, JK) iki 2,5 mg ml-1 baltymų koncentracijos („Bio-Rad“ analizė). Tolesnis apdorojimas buvo atliktas pagal anksčiau paskelbtą metodą (54), pradedant nuo 50 μg baltymų skiedimo į 50 μl TEAB, kuriame yra 1 % (m/t) natrio laurato („Merck“, JK). Po 60 s ultragarsinio apdorojimo, jis buvo redukuotas 5 mM tris(2-karboksietil)fosfinu („Merck“, JK) 37 °C temperatūroje 30 minučių. S-alkilinimui mėginys buvo inkubuojamas su 10 mM metil-S-metiltiometansulfonatu („Merck“, JK) ir įlašinamas iš 200 mM izopropanolio tirpalo 10 minučių kambario temperatūroje. Proteolitinis skaidymas buvo atliktas įlašinant 2 μg tripsino/endoproteinazės Lys-C mišinio („Promega“, JK) ir inkubuojamas 37 °C temperatūroje 3 valandas. Laurato paviršiaus aktyvioji medžiaga buvo ekstrahuota įlašinant 50 μl etilo acetato ir 10 μl 10 % (v/v) LC klasės trifluoracto rūgšties (TFA; „Thermo Fisher Scientific“, JK) ir maišant sūkuriniame maišytuve 60 s. Fazių atskyrimas buvo skatinamas centrifuguojant 15 700 RCF greičiu 5 minutes. Pagal gamintojo protokolą, apatinė fazė, kurioje buvo peptidas, buvo kruopščiai išsiurbta ir pašalinta druska naudojant C18 centrifugavimo kolonėlę („Thermo Fisher Scientific“, JK). Išdžiovinus vakuuminiu centrifugavimu, mėginys buvo ištirpintas 0,5 % TFA ir 3 % acetonitrilo tirpale, o 500 ng buvo analizuojama nanoflow RP chromatografija su masių spektrometrija, naudojant anksčiau aprašytus sistemos parametrus.
Baltymų identifikavimui ir kiekybiniam nustatymui naudokite „MaxQuant v.1.5.3.30“ (56) programą, kad surastumėte Rps. palustris proteomų duomenų bazę (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). Masių spektrometrijos proteomikos duomenys buvo pateikti „ProteomeXchange Alliance“ per PRIDE partnerių saugyklą (http://proteomecentral.proteomexchange.org) pagal duomenų rinkinio identifikatorių PXD020402.
RPLC analizei, sujungtai su elektropurškimo jonizacijos masių spektrometrija, RC-LH1 kompleksas buvo paruoštas iš laukinio tipo Rps. Naudojant anksčiau paskelbtą metodą (16), palustris ląstelėse susidariusios baltymų koncentracijos buvo 2 mg ml-1 20 mM Hepes (pH 7,8), 100 mM NaCl ir 0,03 % (m/t) β- (Bio-Rad analizė) DDM tirpale. Pagal gamintojo protokolą, naudojant 2D gryninimo rinkinį („GE Healthcare“, JAV), nusodinimo metodu buvo išskirta 10 μg baltymų, o nuosėdos ištirpintos 20 μl 60 % (t/t) skruzdžių rūgšties (FA), 20 % (t/t) acetonitrilo ir 20 % (t/t) vandens. Penki mikrolitrai buvo analizuojami RPLC („Dionex RSLC“) kartu su masių spektrometrija („Maxis UHR-TOF“, „Bruker“). Atskyrimui 60 °C temperatūroje ir 100 μlmin -1 greičiu naudokite „MabPac“ 1,2 × 100 mm kolonėlę („Thermo Fisher Scientific“, JK), gradientą nuo 85 % (v/v) tirpiklio A [0,1 % (v/v) FA ir 0,02 % (v/v) TFA vandeninio tirpalo] iki 85 % (v/v) tirpiklio B [0,1 % (v/v) FA ir 0,02 % (v/v) 90 % (v/v) acetonitrilo TFA tirpale]. Naudojant standartinį elektrospray jonizacijos šaltinį ir numatytuosius parametrus ilgiau nei 60 minučių, masių spektrometras gauna nuo 100 iki 2750 m/z (masės ir krūvio santykis). Pasitelkę „ExPASy“ bioinformatikos išteklių portalo „FindPept“ įrankį (https://web.expasy.org/findpept/), susiekite masių spektrą su komplekso subvienetais.
Ląstelės buvo auginamos 72 valandas 100 ml NF-mažo (10 μMm-2 s-1), vidutinio (30 μMm-2 s-1) arba didelio (300 μMm-2 s-1) apšvietimo aplinkoje. M22 terpė (M22 terpė, kurioje nėra amonio sulfato, o natrio sukcinatas pakeistas natrio acetatu) buvo naudojama 100 ml talpos buteliuke su užsukamu dangteliu (23). Per penkis 30 s ciklus 0,1 mikrono stiklo karoliukai buvo subrandinti santykiu 1:1 ląstelėms lizuoti ir 5 minutes atšaldyti ant ledo. Netirpios medžiagos, nesuirusios ląstelės ir stiklo karoliukai buvo pašalinti centrifuguojant 16 000 RCF 10 minučių stacionarioje mikrocentrifugoje. Membrana buvo atskirta Ti 70.1 rotoriuje su 100 000 RCF 20 mM tris-HCl (pH 8,0) su 40/15% (m/m) sacharozės gradientu 10 valandų.
Kaip aprašyta ankstesniame mūsų darbe, His žymės imunodetekcija PufW (16). Trumpai tariant, išgrynintas šerdies kompleksas (11,8 nM) arba membrana, turinti tokią pačią RC koncentraciją (nustatyta oksidacijos būdu, atėmus redukuotą skirtuminį spektrą ir suderinus apkrovą ant dažyto gelio), 2x SDS įkėlimo buferyje („Merck“, JK), praskiestame du kartus. Baltymai buvo atskirti replikuotame 12 % bis-tris „NuPage“ gelyje („Thermo Fisher Scientific“, JK). Gelis buvo nudažytas „Coomassie Brilliant Blue“ („Bio-Rad“, JK), kad būtų įkeltas ir vizualizuotas RC-L subvienetas. Antrajame gelyje esantis baltymas buvo perkeltas į metanoliu aktyvuotą polivinilidenfluorido (PVDF) membraną („Thermo Fisher Scientific“, JK) imunoanalizei. PVDF membrana buvo blokuojama 50 mM tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 0,2 % (t/t) Tween-20 ir 5 % (m/t) nugriebto pieno miltelių tirpale, o po to 4 valandas inkubuojama su pirminiu anti-His antikūnu (praskiestame antikūnų buferyje [50 mM tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl ir 0,05 % (t/t) Tween-20] 1:1000 A190-114A tirpale, „Bethyl Laboratories“, JAV). Po 3 plovimo po 5 minutes antikūnų buferyje, membrana buvo sujungta su krienų peroksidazės (Sigma-Aldrich, JK) anti-pelės antriniu antikūnu (praskiestu 1:10 000 antikūnų buferyje). Inkubuojama, kad būtų galima aptikti (5 minutes po 3 plovimų antikūnų buferyje), naudojant WESTAR ETA C 2.0 chemiliuminescencinį substratą (Cyanagen, Italija) ir „Amersham Imager 600“ (GE Healthcare, JK).
Nubraižę kiekvieno dažyto gelio arba imunofermentinio tyrimo juostos intensyvumo pasiskirstymą, integruodami plotą po smaile ir apskaičiuodami RC-L (dažyto gelio) ir Protein-W (imuninio tyrimo) intensyvumo santykį, apdorokite vaizdą „ImageJ“ (57) programoje. Šie santykiai buvo konvertuoti į molinius santykius, darant prielaidą, kad RC-L ir protein-W santykis gryname RC-LH114-W mėginyje yra 1:1, ir atitinkamai normalizuojant visą duomenų rinkinį.
Papildomos šio straipsnio medžiagos ieškokite adresu http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
Tai yra atviros prieigos straipsnis, platinamas pagal „Creative Commons Attribution“ licencijos sąlygas. Straipsnį leidžiama neribotai naudoti, platinti ir atgaminti bet kokioje terpėje su sąlyga, kad originalus kūrinys bus tinkamai cituojamas.
Pastaba: prašome jūsų pateikti savo el. pašto adresą tik tam, kad asmuo, kurį rekomenduojate puslapiui, žinotų, jog norite, kad jis matytų el. laišką ir kad tai nėra šlamštas. Mes neužfiksuosime jokių el. pašto adresų.
Šis klausimas naudojamas norint patikrinti, ar esate lankytojas, ir užkirsti kelią automatiniam šlamšto siuntimui.
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P. Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Didelės skiriamosios gebos šviesos gaudyklės 1 komplekso struktūra reakcijos centre suteikia naujų įžvalgų apie chinono dinamiką.
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P. Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Didelės skiriamosios gebos šviesos gaudyklės 1 komplekso struktūra reakcijos centre suteikia naujų įžvalgų apie chinono dinamiką.
©2021 Amerikos mokslo pažangos asociacija. visos teisės saugomos. AAAS yra HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ir COUNTER partneris. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.